微阵列芯片检测中核苷酸序列的颗粒标记方法
【专利摘要】本发明公开了一种微阵列芯片检测中核苷酸序列的颗粒标记方法。本发明公开的一种在利用微阵列芯片检测靶标分子的方法包括如下步骤：颗粒表面包被上若干个功能基团，记作功能化颗粒；每种靶标分子都标记有修饰基团，记作修饰化靶标分子；所述功能基团与所述修饰基团能够结合；利用功能化颗粒和发光基团使每种修饰化靶标分子都能发光，从而实现对靶标分子的标记。本发明公开的颗粒标记方法可以直接或间接对靶标分子进行荧光标记，这种标记方法不但能够大幅度的降低荧光检测的成本，同时避免了传统的荧光标记方法在利用PCR富集靶标核酸分子过程中的抑制作用。
【专利说明】微阵列芯片检测中核苷酸序列的颗粒标记方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微阵列芯片检测中核苷酸序列的颗粒标记方法。
【背景技术】
[0002]近几年微阵列芯片技术的发展使得高通量地并行分析成千上万的分子相互作用成为可能。DNA微阵列芯片方法已被广泛使用，包括基因表达分析、突变分型、单核苷酸多态性(SNP)、短串联重复序列(STR)，对药物开发、疾病诊断和司法鉴定起到重要作用。固定于微阵列芯片的特定核苷酸探针，充当解码工具，通过空间上不同的位置把溶液中并行反应产生的多个靶标分子加以区别。这些探针甚至可以是通用探针，比如通用芯片上经过设计与人工合成的人造标签(Tag)序列或者相互补的序列。微阵列芯片方法与多重PCR结合在一起，可用于检测SNP与基因突变，包括碱基删除、插入、以及长片段缺失，适用于常规的遗传和诊断实验室开展。
[0003]与此同时，蛋白芯片和化学芯片也已经发展成为蛋白质组学领域两个重要的工具。结合多重PCR方法，特定的蛋白质、抗体、小分子化合物、多肽及碳水化合物都可以固定在固体表面形成微阵列芯片，类似于DNA微阵列芯片。这些分子的微阵列芯片可以用于分析单一的分子组成或者复杂的分子组成。
[0004]待检样本和固定在微阵列芯片表面的探针之间的相互作用可以通过多种方法加以检测。通常情况下，微阵列芯片的检测方法有基于荧光、化学发光或酶联标记的光学检测方法，基于酶标记、二茂铁标记或其他电活性标记的电化学检测方法，以及基于表面等离子共振技术或微天平分析技术的无标记的检测方法。为了进一步简化分析步骤和减少对仪器设备的依赖，磁珠标记方法也被采用，其结果可以用基于电荷耦合器件(CCD)的相机、摄像机或低倍显微镜进行成像分析，而且交叉反应和非特异性吸附能通过磁场或流体来快速地加以消除。用磁珠检测微阵列杂交DNA开辟了一条新的途径，在不需要对溶液中DNA的浓度进行精准的同时，实现常规的杂交试验。
[0005]荧光分子的应用提高了靶标分子与微阵列芯片结合的检测能力，当荧光分子同目标分子绑定后，显示出了不同的信号强度和发射光谱。将荧光分子标记在特异扩增靶标片段的引物上，通过不对称聚合酶链反应(PCR)富集靶标核酸片段，在各种SNP位点和基因突变的检测方面已得到了广泛的应用。但对于少量的临床样本，检测精度极端重要，单步不对称PCR由于其较低的灵敏度不能完成少量样品的检测。对于其他类型的检测同样也会因样本量太少无法获得足够的荧光信号强度，从而导致无法得到相应的检测结果。
[0006]以前的工作中提到的另一种方法是采用微球，优选顺磁性微粒，由于其易于处理和良好的生物相容性，能够使灵敏度进一步提高。通过对微球和标记了荧光的靶标分子进行修饰，便可以使突光标记分子可以I禹合到磁珠上，这样每一个磁珠同时偶联大量的突光分子，从而获得较高强度的发光能力的个体与微阵列芯片上面的探针进行杂交，从而获得对靶标分子的检测结果。目前这种方法主要应用于核酸分子检测当中，采用聚合酶链反应(PCR)进行靶标分子的富集，在进行聚合酶链反应(PCR)过程中所添加到引物均进行了荧光分子和能与顺磁性微粒相结合的化学修饰的双标记，以达到获得荧光信号的目的。
[0007]现有技术是将荧光分子标记在每一个靶标分子上，如:聚合酶链反应(PCR)过程中添加的弓I物均进行了荧光分子和能与顺磁性微粒相结合的化学修饰的双标记，这种标记方法，检测成本过高，在富集靶标核酸分子方面也存在一定的抑制作用。理论上，靶标分子均需进行相应的化学修饰，以便能够与顺磁性微粒相偶联，而在对靶标分子进行荧光标记可以采用不同方式来实现，并非是要全部并直接的将荧光分子标记到靶标分子上。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种微阵列芯片检测中核苷酸序列的颗粒标记方法。
[0009]本发明提供了一种在利用微阵列芯片检测靶标分子的方法中对靶标分子进行标记的方法，该方法涉及到微阵列芯片和靶标分子；微阵列芯片上连接有若干种探针；靶标分子是若干种靶标分子的混合物，每种靶标分子中含有能与芯片上的某种探针结合的序列、还含有待测靶标位点的序列，一种靶标分子对应一种探针；
[0010]该方法包括如下步骤:颗粒表面包被上若干个功能基团，记作功能化颗粒；每种靶标分子都标记有修饰基团，记作修饰化靶标分子；所述功能基团与所述修饰基团能够相互作用；利用功能化颗粒和发光基团使每种修饰化靶标分子都能发光，从而实现对靶标分子的标记。
[0011]上述方法中，所述利用功能化颗粒和发光基团使每种修饰化靶标分子都能发光的方法为如下(I)- (5)中任一所述的方法:
[0012](I)将修饰化靶标分子混合物中的一种修饰化靶标分子进行发光基团标记，记作修饰化且发光化靶标分子；将除修饰化且发光化靶标分子之外的其它修饰化靶标分子混合物、修饰化且发光化靶标分子、功能化颗粒共同孵育，通过功能基团与修饰基团的相互作用从而实现靶标分子与颗粒的连接，每个颗粒上连接若干个靶标分子，从而实现每种靶标分子都能发光；
[0013]修饰化且发光化靶标分子与除修饰化且发光化靶标分子之外的其它修饰化靶标分子混合物均匀混合，当该均匀混合物与功能化颗粒共同孵育时，得到的每一个功能化颗粒上均会连接有修饰化且发光化靶标分子，从而实现结合在功能化颗粒的每种靶标分子都能发光；
[0014](2)在功能化颗粒上的功能基团上标记发光基团，记作功能化且发光化颗粒；将修饰化靶标分子混合物与功能化且发光化颗粒孵育，通过功能基团与修饰基团的相互作用从而实现靶标分子与颗粒的连接，每个颗粒上连接若干个靶标分子，从而实现每种靶标分子都能发光；
[0015](3)在功能化颗粒的内部标记上发光基团，记作功能化且发光化颗粒；将修饰化靶标分子混合物与功能化且发光化颗粒孵育，通过功能基团与修饰基团的相互作用从而实现靶标分子与颗粒的连接，每个颗粒上连接若干个靶标分子，从而实现每种靶标分子都能发光;
[0016](4)制备无关分子，该无关分子不含有靶标位点序列且不能与探针结合，该无关分子被标记上与修饰化靶标分子同样的修饰基团，同时标记发光基团，记作修饰化且发光化无关分子；将修饰化靶标分子混合物、修饰化且发光化无关分子、功能化颗粒共同孵育，每个颗粒连接有若干个靶标分子和无关分子，从而实现每种靶标分子都能发光；
[0017]修饰化靶标分子混合物与修饰化且发光化无关分子均匀混合，当该均匀混合物与功能化颗粒共同孵育时，得到的每一个功能化颗粒上均会带有修饰化且发光化无关分子，从而实现结合在功能化颗粒的每种靶标分子都能发光；
[0018](5)制备结合分子，该结合分子与靶标分子混合物中的一种靶标分子结合、但不与探针序列结合，该结合分子不连接修饰基团但是连接发光基团，记作发光化结合分子；将功能化颗粒和修饰化靶标分子混合物共同孵育，得到孵育产物；将孵育产物与发光化结合分子混匀，使每个颗粒上连接若干个靶标分子，每个颗粒上都有一种靶标分子与所述发光化结合分子，从而实现每种靶标分子都能发光。
[0019]上述任一所述的方法中，所述方法(I )、方法(4)或方法(5)的发光基团是通过PCR的方法合成到所述方法(I)的靶标分子混合物中的一种靶标分子、所述方法(4)的无关分子或所述方法(5)的结合分子上的；
[0020]所述PCR的方法是利用一条引物含有发光基团，另一条引物不进行任何标记的引物对进行PCR扩增，从而得到含有发光基团的所述方法(I)的靶标分子混合物中的一种靶标分子、所述方法(4)的无关分子或所述方法(5)的结合分子上的；
[0021]所述方法(I)和方法(4)的PCR的方法中，所述含有发光基团的引物同时带有修饰基团。
[0022]上述任一所述的方法中，所述靶标分子为单链核苷酸，所述探针为单链核苷酸，所述无关分子为单链核苷酸，结合分子为单链核苷酸。
[0023]上述任一所述的方法中，所述靶标分子为多核苷酸、多肽、蛋白或碳水化合物；
[0024]所述多核苷酸具体为通过PCR的方法富集得到的；
[0025]所述功能基团为化学功能基团或链霉亲和素、中性链亲和素、卵白亲合素、链亲合素或卵黄亲合素；
[0026]所述化学功能基团具体为多核苷酸、蛋白、多肽、碳水化合物、醛基，羟基，羧基，酯键，氣基，横酸基或疏基；
[0027]所述发光基团为荧光团、磷光团或发色团标记；
[0028]所述修饰基团为生物素、地高辛、多核苷酸、蛋白、多肽或碳水化合物。
[0029]上述任一所述的方法中，所述荧光团为量子点、发光的蛋白质或小分子荧光染料。
[0030]上述任一所述的方法中，所述小分子荧光染料为氧杂蒽衍生物、青色素衍生物、萘衍生物、香豆素衍生物、噻二唑衍生物、芘衍生物、恶嗪衍生物、吖啶衍生物、次甲基衍生物、CF染料、Alexa Fluor染料、四氢吡咯衍生物、吖啶橙、DAP1、Hoechst33258、吡罗昔康或奎宁。
[0031]上述任一所述的方法中，所述氧杂蒽衍生物为荧光素、罗丹明、俄勒R绿、曙红或得克萨斯红；
[0032]所述青色素衍生物为青色素、吲哚花青绿、羰花青或部花青；
[0033]所述萘衍生物为丹磺酰氯或普罗丹；
[0034]所述芘衍生物为级联蓝色；
[0035]所述恶嗪衍生物为尼罗河红色、蓝色尼罗河、甲酚紫或恶嗪170 ；
[0036]所述吖啶衍生物为二氨基吖啶、吖啶橙或吖啶黄；[0037]所述次甲基衍生物为金胺、结晶紫或孔雀石绿；
[0038]所述四氢吡咯衍生物为卟吩或胆红素。
[0039]上述任一所述的方法中，所述磷光团为过渡金属化合物或稀土化合物；
[0040]所述发色团为食品着色剂、织物染料、番茄红素、β -胡萝卜素、花青素、叶绿素、血红蛋白、血蓝蛋白或矿物；
[0041]所述织物染料具体为偶氮化合物；
[0042]所述矿物具体为孔雀石或紫水晶；
[0043]所述颗粒的直径为0.1微米至10微米；
[0044]所述颗粒为磁性颗粒，具体为顺磁性颗粒；
[0045]所述微阵列芯片上的探针分子为多核苷酸，蛋白、多肽或碳水化合物；
[0046]所述微阵列芯片的基底材料为硅，玻璃，塑料，水凝胶，琼脂糖，硝酸纤维素或尼龙；
[0047]所述微阵列芯片的探针点直径具体为10微米到5000微米。
[0048]一种利用微阵列芯片检测靶标位点的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:
[0049](I)按照权利要求上述任一所述的方法，实现每种靶标分子都能发光；
[0050](2)再将步骤(I)孵育后的体系与微阵列芯片进行孵育，靶标分子与芯片上的探针通过相互作用而连接，
[0051](3)检测芯片的发光情况，再结合芯片上的探针，从而判断连接到芯片上的靶标位点种类。
[0052]上述任一所述的方法在微阵列芯片检测中的应用也属于本发明的保护范围。
[0053]本发明的颗粒标记方法具有以下优点:
[0054]1、可以直接或间接对靶标分子进行荧光标记，这种标记方法不但能够大幅度的降低荧光检测的成本，同时避免了传统的荧光标记方法在利用PCR富集靶标核酸分子过程中的抑制作用。
[0055]2、当对靶标分子中的一种靶标分子进行发光标记，而并非是对所有的靶标分子进行发光标记，使得标记成本大幅度下降；其次，减少了对扩增引物进行发光标记，在很大程度上也会降低其对PCR扩增效率的抑制。
[0056]3、当将发光标记合成到颗粒内或者包被在颗粒表面的功能基团或无关分子上或结合分子上，从根本上解决了抑制PCR扩增的问题，同时当将发光标记合成到颗粒内或者包被在颗粒表面的功能基团上或无关分子上或结合分子上，所需发光标记的量仅为标记一种革El标分子的10%。
[0057]4、当在微阵列芯片检测中核苷酸序列的颗粒标记方法中引入结合分子时，结合分子不连接修饰基团但是连接发光基团，由于结合分子片段短且不携带颗粒，能够使其与靶标分子相结合，从而使得一颗颗粒上的多个靶标都能够结合到连接了发光基团的结合分子。
【专利附图】
【附图说明】
[0058]图1为微阵列芯片排布示意图。[0059]图2为实施例2的微阵列芯片检测结果。
[0060]图3为实施例2的方法示意图。
[0061]图4为实施例3的微阵列芯片检测结果。
[0062]图5为实施例3的方法示意图。
[0063]图6为实施例4的微阵列芯片检测结果。
[0064]图7为实施例4的方法示意图。
[0065]图8为实施例5的微阵列芯片检测结果。
[0066]图9为实施例5的方法示意图。
[0067]图10为实施例6的微阵列芯片检测结果。
[0068]图11为实施例6的方法示意图。
【具体实施方式】
[0069]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0070]下述实施例中所用的材料 、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0071]下述实施例以遗传性耳聋相关的6个SNP/突变的检测为例，对本发明进行具体阐述。
[0072]下述实施例用到的微阵列芯片如下:
[0073]—、微阵列芯片中的通用标签阵列是由12个标签探针组成的矩阵，能与下述实施例中的多重PCR产物进行杂交反应。
[0074]通用标签阵列的探针依格式进行设计:NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-TagX，其中X是一个I到12的序数，TagX代表不同的序列。探针5’端有氨基修饰，沿着5’ -3’方向是15个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T15)，再连有Tagl到Tagl2的任一序列。表1中的标签探针中Tagl到Tagl2的核苷酸序列与表2所示引物中的Tagl到Tagl2的核苷酸序列--对应。
[0075]通用标签阵列上的探针如表1所示。
[0076]表1通用标签阵列上的探针
[0077]
【权利要求】
1.一种在利用微阵列芯片检测靶标分子的方法中对靶标分子进行标记的方法，该方法涉及到微阵列芯片和靶标分子；微阵列芯片上连接有若干种探针；靶标分子是若干种靶标分子的混合物，每种靶标分子中含有能与芯片上的某种探针结合的序列、还含有待测靶标位点的序列，一种祀标分子对应一种探针；
该方法包括如下步骤:颗粒表面包被上若干个功能基团，记作功能化颗粒；每种靶标分子都标记有修饰基团，记作修饰化靶标分子；所述功能基团与所述修饰基团能够相互作用；利用功能化颗粒和发光基团使每种修饰化靶标分子都能发光，从而实现对靶标分子的己 O
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述利用功能化颗粒和发光基团使每种修饰化靶标分子都能发光的方法为如下(I) - (5)中任一所述的方法: (1)将修饰化靶标分子混合物中的一种修饰化靶标分子进行发光基团标记，记作修饰化且发光化靶标分子；将除修饰化且发光化靶标分子之外的其它修饰化靶标分子混合物、修饰化且发光化靶标分子、功能化颗粒共同孵育，通过功能基团与修饰基团的相互作用从而实现靶标分子与颗粒的连接，每个颗粒上连接若干个靶标分子，从而实现每种靶标分子都能发光； (2)在功能化颗粒上的功能基团上标记发光基团，记作功能化且发光化颗粒；将修饰化靶标分子混合物与功能化且发光化颗粒孵育，通过功能基团与修饰基团的相互作用从而实现靶标分子与颗粒的连接，每个颗粒上连接若干个靶标分子，从而实现每种靶标分子都能发光; (3)在功能化颗粒的内部标记上发光基团，记作功能化且发光化颗粒；将修饰化靶标分子混合物与功能化且发光化颗粒孵育，通过功能基团与修饰基团的相互作用从而实现靶标分子与颗粒的连接，每个颗粒上连接若干个靶标分子，从而实现每种靶标分子都能发光； (4)制备无关分子，该无关分子不含有靶标位点序列且不能与探针结合，该无关分子被标记上与修饰化靶标分子同样的修饰基团，同时标记发光基团，记作修饰化且发光化无关分子；将修饰化靶标分子混合物、修饰化且发光化无关分子、功能化颗粒共同孵育，每个颗粒连接有若干个靶标分子和无关分子，从而实现每种靶标分子都能发光； (5)制备结合分子，该结合分子与靶标分子混合物中的一种靶标分子结合、但不与探针序列结合，该结合分子不连接修饰基团但是连接发光基团，记作发光化结合分子；将功能化颗粒和修饰化靶标分子混合物共同孵育，得到孵育产物；将孵育产物与发光化结合分子混匀，使每个颗粒上连接若干个靶标分子，每个颗粒上都有一种靶标分子与所述发光化结合分子，从而实现每种靶标分子都能发光。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述靶标分子为多核苷酸、多肽、蛋白或碳水化合物； 所述多核苷酸具体为通过PCR的方法富集得到的； 所述功能基团为化学功能基团或链霉亲和素、中性链亲和素、卵白亲合素、链亲合素或卵黄亲合素； 所述化学功能基团具体为多核苷酸、蛋白、多肽、碳水化合物、醛基，羟基，羧基，酯键，氣基，横酸基或疏基； 所述发光基团为荧光团、磷光团或发色团标记；所述修饰基团为生物素、地高辛、多核苷酸、蛋白、多肽或碳水化合物。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述荧光团为量子点、发光的蛋白质或小分子荧光染料。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述小分子荧光染料为氧杂蒽衍生物、青色素衍生物、萘衍生物、香豆素衍生物、噻二唑衍生物、芘衍生物、恶嗪衍生物、吖啶衍生物、次甲基衍生物、CF染料、Alexa Fluor染料、四氢吡咯衍生物、吖啶橙、DAPI,Hoechst33258、吡罗昔康或奎宁。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于:所述氧杂蒽衍生物为荧光素、罗丹明、俄勒R绿、曙红或得克萨斯红； 所述青色素衍生物为青色素、吲哚花青绿、羰花青或部花青； 所述萘衍生物为丹磺酰氯或普罗丹； 所述芘衍生物为级联蓝色； 所述恶嗪衍生物为尼罗河红色、蓝色尼罗河、甲酚紫或恶嗪170 ； 所述吖啶衍生物为二氨基吖啶、吖啶橙或吖啶黄； 所述次甲基衍生物为金 胺、结晶紫或孔雀石绿； 所述四氢吡咯衍生物为卟吩或胆红素。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述磷光团为过渡金属化合物或稀土化合物； 所述发色团为食品着色剂、织物染料、番茄红素、β_胡萝卜素、花青素、叶绿素、血红蛋白、血蓝蛋白或矿物； 所述织物染料具体为偶氮化合物； 所述矿物具体为孔雀石或紫水晶； 所述颗粒的直径为0.1微米至10微米； 所述颗粒为磁性颗粒，具体为顺磁性颗粒； 所述微阵列芯片上的探针分子为多核苷酸，蛋白、多肽或碳水化合物； 所述微阵列芯片的基底材料为硅，玻璃，塑料，水凝胶，琼脂糖，硝酸纤维素或尼龙。
8.一种利用微阵列芯片检测靶标位点的方法，包括如下步骤: (1)按照权利要求1-7任一所述的方法，实现每种靶标分子都能发光； (2)再将步骤(1)孵育后的体系与微阵列芯片进行孵育，靶标分子与芯片上的探针通过相互作用而连接， (3)检测芯片的发光情况，再结合芯片上的探针，从而判断连接到芯片上的靶标位点种类。
9.权利要求1-8任一所述的方法在微阵列芯片检测中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103760355SQ201310651906
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】李阳, 张冠斌, 蒋迪, 项光新, 邢婉丽, 程京 申请人:博奥生物有限公司, 清华大学