一种抗真菌肽高产菌株及其制备抗菌肽的方法
【专利摘要】本发明公开了一种芽胞杆菌BH072（Bacillus?sp.BH072）及通过培养该菌株制备抗菌肽伊枯草菌素A（iturin?A）的方法。采用发酵方法产生伊枯草菌素A（iturin?A），从种子培养基中取6%-7%接种量接种于发酵培养基中，培养温度29℃-30℃，pH6.4-6.5，转速150rpm，培养60h，进行纯化提取。本发明的芽胞杆菌BH072对黑曲霉、尖刀镰孢菌、灰葡萄孢霉、腐霉等植物病原菌有显著的杀菌作用，具有广谱抗菌性，通过对发酵条件的优化不仅提高该菌株的利用率，而且也可为其他同类试验提供参考，采取有效的分离方法从发酵液中分离出伊枯草菌素A（iturin?A）具有很强的抑真菌活性，对其进行鉴定和产量优化后，其产量为52.21mg/ml，与已经报道的菌株iturin?A产量相比较高，适于开发后大规模工业化生产。
【专利说明】一种抗真菌肽高产菌株及其制备抗菌肽的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及芽胞杆菌属的一株抗真菌肽高产菌株芽胞杆菌BH072 (BacillusSP.BH072)新菌株及通过培养该菌株制备抗菌肽伊枯草菌素A (iturin A)的方法。
【背景技术】
[0002]真菌在自然界广泛存在，据报道自然界大约有一百五十万种真菌，目前已知的仅有七万四千种。有些真菌可以引起植物病害，导致农作物减产，造成巨大的经济损失。所以控制粮食作物和食品中真菌污染，控制其生长繁殖和毒素的产生是我们面临的一个十分艰巨的任务。真菌的生物控制方法中，抗真菌肽的研究尤其成为当前研究的热点。据APD(the Antimicrobial Peptide Database)数据库记载,从人类、动物、爬行动物、鸟类、昆虫和微生物等不同生物分离出了 756种不同的抗真菌肽。据报道，芽胞杆菌、假单孢菌、链霉菌、曲霉、食用菌等微生物均可产生具有不同杀真菌作用的抗真菌肽。其中尤以芽胞杆菌产生的抑菌物质种类多，芽胞杆菌产生的抗真菌物质有核糖体合成的抑菌蛋白和非核糖体合成的抗生素两种类型。核糖体合成的抑菌蛋白主要有细菌素、细胞壁降解酶类(如蛋白酶、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖等)以及一些未鉴定的抑菌蛋白等。对细菌和真菌具有不同程度抑菌作用。非核糖体合成的抗生素主要是脂肽抗生素。芽胞杆菌产生的脂肽类抗生素有表面活性素(Surfactin)、 伊枯草杆菌素(Iturins)和芬枯草菌素(Fengyein)三大类。脂肽类抗生素大多是带有D型和L型氨基酸的环肽，带有一个脂肪酸链，对丝状真菌和酵母都表现抑菌活性。
[0003]芽胞杆菌分布广泛，是土壤和植物体表根际的重要微生物种群，多数对人畜无毒无害，不污染环境，一些菌株产生拮抗有害病菌的抑菌物质。而且，芽胞杆菌对营养要求低，生长繁殖快，能产生耐热性内生芽胞，抗逆能力强，可以耐受各种不良环境。同时芽胞杆菌因其抑菌谱广且对多种植物病害具有较好防效而引起广泛注意。由于以上特点，芽胞杆菌成为了生物食品防腐和生物农药的研究热点。
[0004]抗真菌肽抑制病原菌孢子产生和萌发，使得菌丝畸形；或通过阻止、破坏真菌细胞壁的合成，在脂膜上形成孔洞，使重要的内容物外泄，导致真菌死亡；有的与真菌细胞内线粒体、核酸作用导致真菌死亡。归纳起来，在抑菌物质的抑菌机理研究方面有三个假说，一是攻击细胞的细胞膜，比较公认的是所谓的桶板模型(barrel-stave model)理论,通常带正电荷的含α-螺旋抑菌肽单体与细胞膜上带负电荷的磷脂分子相互吸引而结合在细胞膜表面，多个抑菌肽分子形成多聚体，扰乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排序，并以与膜表面垂直的排列方式将疏水基团插到磷脂双分子层，形成横跨细胞膜的离子通道，造成细胞质物质泄漏和电化学势丧失，细胞膜崩解而导致细胞死亡；二是抑制细胞壁的合成，如棘球白素(echinocandins)是I, 3-β -葡聚糖合成酶的抑制物,通过抑制葡聚糖的合成而抑制真菌细胞生长；三是作用于胞内DNA、RNA、酶和蛋白质等分子，使其失去活性，从而达到杀菌作用。
[0005]迄今为止，国内外多家实验室通过分离纯化芽胞杆菌的发酵产物，得到了一些高分子量蛋白类的抗菌物质和低分子量的抗菌肽。Caldeira等分离到一株解淀粉芽胞杆菌 CCMI1051 (Bacillus amyloliquefaciens)对根霉 L-122 (Rhizopus sp.)和哈茨木霉CCMI783 (Trichoderma harzianum)等具有强烈的抑制作用，Arrebola等报道解淀粉芽胞杆菌PPCB004可抑制Penicillium crustosum Thom等青霉属真菌的菌丝延伸,Lee等发现缓病类芽胞杆菌 WJ5 (Paenibacillus Ientimorbus)菌株抑制灰霉(Botrytis cinerea)等多种植物致病菌，其抗真菌活性物质分泌于细胞外，并可被正丁醇提取，权春善等和郝建安等分别分离到对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和爺病镰刀菌(Fusarium solani)等真菌具有强抑制作用的解淀粉芽胞杆菌Q-12菌株和NK10.B菌株。研究表明，芽胞杆菌及其产生的抑菌物质在植物病害生物防治中具有巨大的应用潜力。
[0006]芽胞杆菌产生的抑菌肽在国内外已得到了一定程度的实际应用。美国有4株枯草芽胞杆菌生物防治菌株获得环境保护局(EPA)批准，可进行商品化或有限商品化生产应用，分别是 GB03、MBI600、QST713 和 Bacillus subtilis var.amyloliquefaciens FZB24。国内一些单位也对具有抑菌作用的枯草芽胞杆菌进行了研究，涉及的防治对象有大田作物的叶部病害、土传病害和果实病害等，初步揭示了不同菌株的抑菌活性和抑菌物质的性质。我国利用枯草芽胞杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现发成功并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁、台湾宝等。枯草芽胞杆菌BS-208菌株分泌的抑菌物质可以抑制病菌孢子发芽和菌丝生通过竞争性生长繁殖占据生存空间的方式来阻止植物病原真菌的生长，从而预防与治疗的目的，对真菌病害的防治效果尤为明显。由其制成的“亚宝”性粉剂已经完成农药登记。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”已获得农业部登记注册，并在多个省推广使用，面积约4667公顷。百抗的主要有效成分是枯草芽胞杆菌B-908，大田应用中对水稻纹枯病防效达70%以上。它通过营养竞争、位点占领等机制对烟草、三七、花卉、小麦、白菜等作物易患的土传病害具有很好的防治效果，从而成为全国第一个在水稻上获得登记的芽胞杆菌杀菌剂，并将在泰国和越南等国推广应用。江苏省农业科学院植物保护研究所的陈志谊等人经过10多年生物防治水稻病害的研究获得B-916菌株对多种病原真菌和水稻白叶枯病菌都有显著抑制作用，对水稻纹枯病田间防效达50%~81%。2002年取得了国家农药“三证”，年使用面积达6.7万公顷以上，已在江苏等地得到广泛推广。南京农业大学开发的生防菌B3(商品名麦丰宁)对小麦纹枯病田间防效50%~80%。B3产生两种不同类型的抑菌物质，一种对植物病原真菌有抑菌作用，另一种对水稻白叶枯病菌等植物病原细菌有抑制作用，其防病机制主要表现在抑制小麦纹枯病病菌菌丝生长、菌核形成和菌核萌发。黑龙江省科学院微生物研究所研发的枯草芽胞杆菌水剂主要防治瓜类及保护地蔬菜枯萎病、立枯病和豆类根腐病，已在黑龙江省进行推广应用。
[0007]目前，国内外有许多关于枯草芽胞杆菌产生的脂肽物质如表面活性剂(surfactant)、伊枯草素(iturin)、芬莽素(fengycin)的报道,但大多都趋向于对脂肽物质的分离纯化或对枯草芽胞杆菌产脂肽物质的培养基成分优化，对发酵条件的优化相对较少，抗菌肽的产量较低，抗菌基因种类单一。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种 芽胞杆菌BH072新菌株，该菌株具有三个抗菌基因，可产生大量抗真菌肽。
[0009]本发明另一个目的是提供一种通过培养该芽胞杆菌BH072制备抗菌肽伊枯草菌素A (iturin A)的方法及其纯化提取方法，解决现有技术中抗菌肽伊枯草菌素A产量低的问题。
[0010]芽胞杆菌BH072从国内蜂蜜样品中分离，并发现其对真菌具有显著的抑制作用。经形态学和生理生化试验研究，发现该菌为芽胞杆菌，并将其命名为芽胞杆菌BH072(Bacillus sp.BH072)。
[0011]本发明芽胞杆菌BH072主要有以下特性(表1、表2):
[0012]表1形态学观察结果汇总
[0013]
【权利要求】
1.一种抗真菌肽高产菌株芽胞杆菌BH072 (Bacillus sp.BH072) CGMCC N0.8473。
2.一种采用权利要求1所述芽胞杆菌BH072 (Bacillus sp.BH072)制备抗菌肽伊枯草菌素A (iturin A)的方法，其特征在于，采用发酵方法产生伊枯草菌素A (iturin A)，从种子培养基中取6%_7%接种量接种于发酵培养基中，培养温度29°C -30°C，pH6.4-6.5，转速150rpm,培养60h，进行纯化提取。
3.根据权利要求2所述制备抗菌肽伊枯草菌素A(iturin A)的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为0.90%-0.95%大豆粉，0.95%-1.00%蔗糖和0.90%-0.95%Mg2+。
4.根据权利要求2所述制备抗菌肽伊枯草菌素A(iturin A)的方法，其特征在于，所述纯化提取采用甲醇抽提法提取发酵液中的伊枯草菌素A，并通过HPLC方法纯化获得高纯度产物。
5.根据权利要求4所述制备抗菌肽伊枯草菌素A(iturin A)的方法，其特征在于，所述甲醇抽提指将发酵液先于4200rpm，4°C，离心20min后取上清，再用浓HCl调节pH至2.0,至于4°C，过夜，然后4200rpm，4°C，离心20min后取沉淀，冷冻干燥，将残留物用甲醇抽提24h，甲醇抽提产物经60°C烘干后，`进行称重，即可得iturin A的质量浓度。
【文档编号】C12P21/04GK103773712SQ201310662193
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】周志江, 赵鑫, 韩烨 申请人:天津大学