鸡mmp-9基因启动子区-1954突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及了一种鸡MMP-9基因5′调控区-1954突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用；本发明构建的MMP-9基因启动子-1954位点C+C+和C-C-两种基因型荧光素酶报告载体，分别转染鸡的卵泡颗粒细胞后检测发现C+C+基因型表达活性显著高于C-C-型，说明可能是由于两种基因型表达活性的差异，导致了产蛋性能的不同。本发明方法简便快速，并且有助于选育高产蛋的鸡种，为标记辅助育种工作提供有利的帮助。
【专利说明】鸡圖P-9基因启动子区-1954突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种鸡MMP-9基因启动子区-1954突变位点的分子标记方法及其育种中的应用。
【背景技术】
[0002]动物的大多数器官在形成后，极少出现周期性的组织重建与再生。雌性动物的生殖系统，尤其是卵巢中的卵泡在不同阶段经历着生长、成熟和萎缩等周期性变化，Nalbandov指出尤其是鸟类卵泡应该是所有高等脊椎动物中生长速度最快的结构，小卵泡在短短几天内可增长150-200倍发育成熟并排卵。这些动态组织的变更要求细胞外基质的不断的降解和重建。胞外基质内环境稳定性的维持在很大程度上依赖于基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制因子(IlMPs)的协调控制。
[0003]大量研究发现，哺乳动物中MMPs对卵泡发育、闭锁、排卵以及黄体退化过程中起了非常重要的作用。Imai等认为，MMP-2的表达量是衡量牛卵母细胞是否发育正常的一个重要指标。Brannstrom和Ogiwara研究发现,在MMPs的抑制剂或者抗体作用下,小鼠排卵被完全抑制或者减少。而MMPs在鸟类卵巢发育中的研究却很少，前期本课题组发现MMP-9随鸡卵巢成熟和卵泡增大中表达量显著上升，分离培养颗粒细胞，添加激素和TGF-β进行处理，发现ΜΜΡ-9基因表达只受到TGF-β调控，而其启动子区-1700至-2400含有此基因表达的重要调控元件。
[0004]众所周知，DNA分子标记辅助育种技术，是一种通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择的现代育种技术。该技术对目标基因的转移，不仅可在生长发育的早期进行准确、稳定的选择，而且可克服再度利用隐性基因时识别难的问题，从而加速育种进程，提高育种效率。
[0005]基因启动子区的碱基突变，通常会影响基因转录表达。因此，本研究对不同产蛋率鸡种间的ΜΜΡ-9基因启动子区存在的SNPs进行了筛查，发现并找出了一个有意义的分子标记，为方便快速地选育出早产、高产的品系/种提供了有利的理论依据。
【发明内容】
[0006]根据现有技术，发明人进行了进一步的研究和实验，具体涉及了一种鸡ΜΜΡ-9基因5'调控区突变位点的分子标记方法及其育种中的应用，发明人发现鸡ΜΜΡ-9 5'调控区上游-1954位点存有C碱基插入/缺失突变，并进行了标记分析，结果发现，新杨褐鸡种中此位点纯合缺失C_C_基因型与高产蛋数相关联(P=0.024)。另外，该基因型对应较小的开产日龄(158d)，C+C+型对应较大的开产日龄(161d)，有使母鸡提前开产的趋势(P=0.19)。可见检测这个与产蛋性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，并且有助于选育高产蛋的鸡种，为育种工作提供有利的帮助。
[0007]本发明的具体标记方法是:
[0008]采用标记弓丨物P-MMP-9，包括[0009]P-MMP-9-F,其序列如 Seq ID No:1 所示；
[0010]P-MMP-9-R，其序列如 Seq ID No:2 所示；
[0011]扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如Seq ID No: 5所示，发现MMP-9基因TSS上游-1954位点在新杨褐鸡中存在C+C+、c+σ和σσ三种基因型。
[0012]在产蛋数低的群体中，选择CX—基因型的个体，或者选C+C—基因型的公母鸡，通过相互交配得到CT-基因型的后代，然后CX-基因型个体进行繁育扩群，可以得到全为c_c_型高产蛋数的群体。
[0013]通过这种标记方法得到的CT-基因型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性能低的地方品种中有目的地增加CT-基因型的频率对提高产蛋量是一个有效措施；而对于开产较晚的群体，这样的措施也会使其开产适当提前，从而实现早期选种。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为P-MMP-9-F/R弓丨物PCR扩增的片段电泳图；
[0015]图2为鸡MMP-9 调控区-1954位点的多态性测序图；
[0016]图3为构建定点突变PGL3-载体后序列比对结果；
[0017]图4为分离培养的鸡卵泡颗粒细胞图片，200 X倍镜观察；
[0018]图5为C+C+和CX—两种基因型荧光素酶报告基因启动活性检测示意图；
(五)【具体实施方式】
[0019]实施例1鸡MMP-9 5'调控区序列的克隆测序、序列比对及突变位点分析
[0020]1.试验材料
[0021]新杨褐基因组(上海家禽育种有限公司，国家家禽工程技术研究中心)，文昌鸡基因组(海南省文昌鸡育种公司)，海兰褐基因组(山东泰安海兰褐育种公司)。
[0022]2.试验方法
[0023]2.1引物设计
[0024]根据已发表红色原鸡序列(GenBank Accession NC_006107.3)设计引物P-MMP-9见表l(Seq ID No:1和2所示)，此引物是为研究鸡MMP-9 5'调控区的突变而根据数据库中登录的红色原鸡的序列特意设计的。
[0025]表1 MMP-9启动子扩增弓丨物
[0026]
【权利要求】
1.鸡MMP-9基因5'调控区突变位点的分子标记方法，其特征在于具体标记方法是: 米用标记引物P-MMP-9,包括 P-MMP-9-F，其序列如 Seq ID No:1 所示； P-MMP-9-R，其序列如Seq ID No: 2所示；扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物由琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如Seq ID No: 3所示，结果在MMP-9基因5'调控区-1954位点分别检测到C+C+、C+C—和C_C_三种基因型。
2.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于其在鸡育种中的应用方法是:在产蛋数低的群体中，选择CX—基因型的个体，相互交配得到CX—基因型高产蛋数的群体后代。或者选C+C—基因型的公母鸡，相互交配得到CX—基因型的后代，然后CX—基因型个体进行繁育扩群，可以得到全为CX—型高产蛋数的群`体。
【文档编号】C12Q1/68GK103773844SQ201310665567
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】姜运良, 朱桂玉, 康丽, 陈欣, 魏晴晴, 杨春红, 崔新星, 陈玉霞, 袁振杰 申请人:山东农业大学