一种与鸡背部羽毛成熟性相关的分子遗传标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种与鸡背部羽毛成熟性相关的分子遗传标记，包含如序列表中序列1～4所示的核苷酸序列。其中，序列1的第140bp处有一个A/G突变，序列2的第132bp处有一个C/G突变，序列3的第110bp处有一个A/G突变，序列4的第490bp处有一个C/T突变。本发明还提供4个分别用于扩增如序列表中序列1～4所示核苷酸序列的引物对，以及筛选与鸡背部羽毛成熟性相关的分子遗传标记的方法。本发明提供的与鸡背部羽毛成熟性相关的遗传标记，可以预测鸡的背部羽毛成熟度性状，可以应用于选育具有背部羽毛成熟性早的优质鸡。
【专利说明】一种与鸡背部羽毛成熟性相关的分子遗传标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及鸡背部羽毛成熟性相关的分子标记育种技术，具体涉及一种与鸡背部羽毛成熟性相关的分子遗传标记及其应用。
【背景技术】
[0002]优质肉鸡是我国肉鸡养殖业一大特色，随着消费者生活水平的提高和受传统消费习惯的影响，对优质鸡体型外貌的要求也越来越严格。体型外貌和羽毛成熟性等包装性状可以反映出肉鸡的饲养方式或饲养日龄。优质肉鸡相较于其它快大型肉鸡品种，其生长速度慢且早熟性差、上市日龄长、耗料量大。上市日龄鸡羽毛发育均匀度较差为大多优质肉鸡的一大缺点，羽毛成熟度是判断肉鸡性成熟的重要指标之一，人们通常习惯观察鸡背部羽毛间接判定肉鸡品质和饲养日龄，刘清朝等(刘清朝，张德祥，黄军，土鸡羽毛成熟度的选育效果分析，中国家禽科学研究进展——第十四次全国家禽科学学术讨论会论文集2009-07-01)以三黄鸡为素材，采用传统的选育方法，表明干毛组后代鸡群的主翼羽脱换速度、早熟性、开产日龄以及干毛比例等性状均优于未干毛组后代鸡群，羽毛成熟性好的优质肉鸡屠宰后胴体美观。
[0003]血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)为细胞特异性表面膜受体，为酪氨酸激酶受体，具有较高亲和力，作为一种典型跨膜镶嵌蛋白，主要分为胞外区、跨膜区和膜内区3部分。血管内皮生长因子(VEGF)生物学功能需与VEGFR2结合而产生，VEGFR-2基因上单核苷酸多态位点(SNP)可以通过影响结合效率或降低VEGFR2的转录活性进而影响生产性能和疾病。根据候选基因分析法的有关原理，VEGFR2基因筛选为优质鸡羽毛成熟性的理想分子标记。
[0004]鸡羽毛成熟度包含多个性状，其中“干毛”是指优质鸡体羽发育成熟时的羽毛特征，此时羽毛根部毛管收缩、中空透明、不含羽髓液。上市优质鸡体羽干毛程度很大程度上影响售价。常规的“干毛”数量遗传的选育通过主翼羽肉眼观察评分，但通过背部羽毛和分子标记辅助选择的方法评判鸡羽毛成熟度尚无报道，分子标记具有早期选育、快速高效等特点。`
【发明内容】
[0005]本发明一方面提供一种与鸡背部羽毛成熟性相关的遗传标记，通过该遗传标记可以预测鸡的背部羽毛成熟度性状(干毛性状)，从而可用于优质鸡羽毛成熟性的分子标记辅助育种。
[0006]本发明通过以下技术方案实现:
[0007]本发明提供一种与鸡背部羽毛成熟性相关的分子遗传标记，其是与鸡羽毛成熟度相关的 VEGFR2 基因上的 4个多态位点，分别是 exon5-A160G、intron7-C1469G、exonl0-A69G和exon9-C88T，分子遗传标记包含如序列表中序列I~4所示的核苷酸序列。其中，序列I的第140bp处有一个A/G突变(在序列表序列I中标注为r)，序列2的第132bp处有一个C/G突变(在序列表序列2中标注为S)，序列3的第IlObp处有一个A/G突变(在序列表序列3中标注为r)，序列4的第490bp处有一个C/T突变(在序列表序列4中标注为y)。
[0008]本发明第二方面还提供4对引物，包括分别用于扩增序列表中序列I~4所示核苷酸序列的4对引物Ml、M2、M3、R5，4对引物的序列分别如下:
[0009]I) 引物Ml——上游引物:TGTTCCTGATGGCAAATCAA ;下游引物:TGGGTCACCATGCTGTAGAA ；
[0010]2) 引物M2——上游引物:TGTTCAAGGGAAAGGACTGG ;下游引物:ACCATTTTGCCTCTGGAGAA ；
[0011]3) 引物M3——上游引物:GAAGCCTTGTGGGAGGTGTA ;下游引物:AGCTGCCAATACCACAGGAC ；
[0012]4) 引物R5——上游引物:TGTTCAAGGGAAAGGACTGG ;下游引物:CTCTACCACCCATCCTGGAG。
[0013]筛选与鸡的背部羽毛成熟性相关的上述遗传标记的方法，包括如下步骤:从鸡血液中提取基因组DNA，用上文所述的4对引物分别在鸡的基因组DNA中进行PCR扩增，对PCR扩增产物纯化和克隆测序，获得如序列表中序列I~4所示的核苷酸序列。
[0014]本发明提供了鉴定上述序列I第140bp处A/G突变、序列2第132bp处C/G突变、序列3第IlObp处A/G突变的PCR - SSCP分型方法，其步骤包括:分别用引物M1、M2、M3在鸡基因组DNA中进行PCR扩增，分别将3 μ L Ml、M2、M3的PCR扩增产物与7 μ L SSCP上样缓冲液混合，在PCR仪上95°C变性lOmin，立即取出于冰上放置5min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分型。
[0015]本发明还提供了鉴定上述序列4第490bp处C/T突变的PCR -RFLP分型方法，其步骤包括:用引物R5在鸡基因组DNA中进行PCR扩增，将10 μ L R5引物扩增出的PCR产物，加入限制性内切酶0.8 μ L，10 XBufferl.2 μ L，dd Η208 μ L ；20μ L的体系过夜消化(7_12h)，进行琼脂糖凝胶电泳分型。
[0016]上文所述的分子遗传标记、引物在选育具有背部羽毛成熟性早的优质鸡中均可应用。
[0017]所述的鸡为优质鸡，进一步为清远麻鸡。
[0018]发明人通过对优质鸡背部羽毛干毛性状进行表型评分，全面筛查鸡VEGFR2基因的多态性及DNA测序(参见图2)，筛选出4个多态的DNA分子标记，通过PCR-SSCP和PCR-RFLP分型方法判断肉鸡个体的基因多态，并通过运用分子数量遗传学的有关原理，对鸡背部羽毛成熟性与肉鸡DNA多态建立了关联分析。经统计检验表明，关联分析显著。结果表明，鸡VEGFR2基因的SNP多态可有效应用于清远鸡羽毛成熟度性状的选择，这有利于早期快速建立羽毛早熟性的家禽选育。
[0019]本发明提供了一种与鸡背部羽毛成熟性相关的遗传标记，利用该遗传标记，可早期准确地筛选出具有羽毛成熟性早的优质鸡。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1A~图1B:图1A为鸡背部羽毛未干毛的情形，图1B为鸡背部羽毛干毛的情形。
[0021]图2:为鸡VEGFR2基因外显子5 (A)、9 (B)UO (C)，内含子7 (D)的SNP测序图。
[0022]图3A~3C:为鸡VEGFR2基因PCR-SSCP分型图；其中，图3A为鸡VEGFR2基因外显子5 (E5)的PCR-SSCP分型，图3B为鸡VEGFR2基因内含子7 (17)的PCR-SSCP分型，图3C为鸡VEGFR2基因外显子10 (ElO)的PCR-SSCP分型。
[0023]图4:为鸡VEGFR2基因外显子9 (E9)的PCR-SSCP分型图，其中M为marker。【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0025]1、鸡干毛的评分方法
[0026]分别对所选育的鸡品种进行个体编号，同时依据优质鸡上市日龄时背部羽毛的干毛评分方法进行百分制评分。鸡达到上市日龄时羽毛为干毛时处于休止期，此时羽枝收缩细化、羽轴中无羽髓液、呈中空透明状、羽根部血管收缩、与皮肤组织结合较为疏松；未干毛鸡羽毛处于生长期或起始期、羽枝粗大饱满、呈灰黑色、羽髓液清晰可见，羽根部与皮肤组织连接紧密，屠宰时羽毛较难剥离。通过对120日龄鸡背部羽毛成熟度进行评分，具体评分方法为:由尾脂腺向背部连续数20根羽毛，每根羽毛为5分制，根据羽毛发育情况，干毛的羽毛为5分，没干毛的为O分，计算出每只鸡的干毛分数。一般而言，鸡背部羽毛评分大于或等于80分以上为“干毛”，羽毛成熟性早。
[0027]本实施例中详细记录了广东天农食品有限公司的清远麻鸡核心群的系谱及120日龄的鸡个体干毛性状，共采集160只清远麻鸡样本。
[0028]2、鸡血样的采集和DNA的提取
[0029]依次对有干毛性状记录的清远麻鸡进行DNA样本的收集，采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约ImL血液，注入经高压灭菌并装有约200 μ L2%无菌乙二胺四乙酸抗凝剂(EDTA)的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，_80°C保存备用。
[0030]基因组DNA的抽提与检测:采用Ezup柱式动物基因组DNA提取试剂盒(上海生工)抽提基因组DNA，具体操作步骤按照其试剂盒说`明书进行。
[0031]3、目的片段的获得及测序分型
[0032]根据鸡VEGFR2基因组序列(Genbank登录号:NC_006091.3)，设计4对引物M1、M2、M3、R5，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物的核苷酸序列、产物长度等信息见下表1所示:
[0033]表1VEGFR-2基因多态检测引物信息表
[0034]
序歹Ij~~"
(SEQ引切引物序列^ 3 )位置(bp)退:度
)段大小(bp)( C)
NOl卜:TGIICVIGATGCIAAAIVAA
Ml^09 - E5(6869-7077)56
R:TGGGTCACCATGCTGTAGAA:NCPF:TGTTrAAGGGAAA(UW^
M11 - 17(9735-10045)57
R:ACTATTTT(.1CCTC'TGGAGAA
N03F:GAA(-1CCTTGTGGGAG(顶
M3171 - EI ()(11054-11224) 58
R:AGCKiCCAATACCA(、/\GGAC
N04RTGTTCAAGGGAAAGGACTGG
R5?、9 - E9(^735-104^V)59.5
R:CTCTACCAa:、CATa:TGGAG[0035]注:F代表正向引物，R代表反向引物，E代表外显子，I代表内含子
[0036]用上述引物M1、M2、M3、R5分别对鸡基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为:模板 DNA 约 150ng, 10 XPCR 缓冲液 5 μ L，10 μ M/ μ L 上下游引物各 1.5 μ L，2.0mol/LdNTPs4.0yL,,5U/yL Taq酶0.5 μ L，加灭菌三蒸水至总体积为50 μ L。PCR反应扩增程序为:94°C变性 3min，35 次循环(94°C 30s, 56/57/58/59.5°C 30s, 72°C 30s)72°C延伸 7min(退火温度见表1 )，得到PCR扩增产物。
[0037]扩增产物委托华大基因公司测序。测序鉴定得出，Ml引物扩增片段209bp，如序列表中序列I所示，位于该片段第140bp处有A/G突变;M2引物扩增片段311bp，如序列表中序列2所示，位于该片段第132bp处有C/G突变;M3引物扩增片段171bp，如序列表中序列3所示，位于该片段第IlObp处有A/G突变；R5引物扩增片段759bp，如序列表中序列4所示，位于该片段第490bp处有C/T突变。这些突变分别依次对应于鸡VEGFR2基因上位于exon5_A160G (Ala — Val)、intron7_C1469G、exonlO_A69G (Thr — Ala)、exon9_C88T 的 4个SNP。exon9-C88T有一个Hpa II酶切位点，可建立PCR-RFLP分型方法；其余3个多态位点建立PCR-SSCP分型方法。
[0038]4、PCR-SSCP 和 PCR-RFLP 酶切分型
[0039]PCR-SSCP分型方法建立:分别用Ml、M2、M3引物扩增出的PCR产物3 μ L与7 μ LSSCP上样缓冲液混合，在PCR仪上95°C变性lOmin，立即取出于冰上放置5min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分型。结果参见图3A~3C。
[0040]PCR-RFLP分型方法的建立:取10 μ L R5引物扩增出的PCR产物，加入限制性内切酶0.8 μ L，10 X Buffer 1.2 μ L，dd Η208 μ L0 20 μ L的体系过夜消化(7_12h)，进行琼脂糖凝胶电泳分型。结果参见图4。
[0041]5、基因型判定及数据统计分析
[0042](I)在清远麻鸡 群体中，exon5_A160G位点共检测出基因型AA、AG、GG，频率分别为
0.692,0.295 和 0.013，群体处于 Hardy-Weinberg 平衡状态(P > 0.05)。intron7_C1469G位点有基因型CC、CG、GG，频率分别为0.580,0.259,0.161，群体处于Hardy-Weinberg非平衡状态(P < 0.01)。exonlO-A69G位点有基因型AA、AG、GG，其频率分别为0.716,0.210和
0.074，处于 Hardy-Weinberg 非平衡状态(P < 0.05)。exon9_C88T 有两种基因型 CT 和 TT，其频率分别为0.580和0.420，处于Hardy-Weinberg非平衡状态(P < 0.05)。
[0043]除了第5外显子SNP位点为低度多态外，其余3个位点均为中度多态。仅exon9-C88T位点TT型干毛评分显著高于CT型(P < 0.01 )，其他位点上基因型之间均差异不显著(P > 0.05)。
[0044](2)利用VEGFR-2基因4个多态位点构建出清远麻鸡7种组合基因型，干毛评分高低达到90分以上依次为ABDDEEGG、AACDEEHH、AADDEEGG，达到80分以上的组合为AA⑶EEGH、AA⑶EEGG、AADDEEGH, 70分以下的为AA⑶EFGG。说明了最优势组合基因型ABDDEEGG、AACDEEHH 和 AADDEEGG，其次为 AACDEEGH、AACDEEGG、AADDEEGH,可有效应用于优质清远鸡的背部羽毛干毛的早期选育。对各基因型组合与干毛评分进行关联分析，发现AA⑶EFGG组合基因型在清远麻鸡干毛评分中显著低于其余6种基因型(P < 0.05)，且个体间干毛均匀度较差，生产中应加以淘汰(结果参见表2)。
[0045]结果表明，鸡VEGFR2基因的4个SNP多态与鸡羽毛成熟性相关联，鸡VEGFR2基因的4个SNP多态可作为分子标记应用于清远麻鸡的鸡羽毛成熟性的早期选育，这有利于早期快速建立羽毛早熟性的清远麻鸡品系。本发明筛选出了优势组合基因型，为ABDDEEGG、AA⑶EEHH和AADDEEGG，可有效应用于优质清远鸡的早期选育，也可为其它家禽类似的选育提供借鉴。本发明有助于加快鸡的育种进程，其选育准确率高，实用性强，具有非常广泛的应用前景。
[0046]表2清远麻鸡不同基因型组合中干毛评分
[0047]
【权利要求】
1.一种与鸡背部羽毛成熟性相关的分子遗传标记，其特征在于，所述的与鸡背部羽毛成熟性相关的分子遗传标记包含如序列表中序列I~4所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的分子遗传标记，其特征在于，序列表中序列I的第140bp处有一个A/G突变，序列表中序列2的第132bp处有一个C/G突变，序列表中序列3的第IlObp处有一个A/G突变，序列表中序列4的第490bp处有一个C/T突变。
3.一种引物对，其特征在于，包括分别用于扩增序列表中序列I~4所示核苷酸序列的4对引物Ml、M2、M3、R5，4对引物的序列分别如下: 1)引物Ml----上游引物:TGTTCCTGATGGCAAATCAA ； 下游引物:TGGGTCACCATGCTGTAGAA ； 2)引物M2----上游引物:TGTTCAAGGGAAAGGACTGG ； 下游引物:ACCATTTTGCCTCTGGAGAA ； 3)引物M3----上游引物:GAAGCCTTGTGGGAGGTGTA ; 下游引物:AGCTGCCAATACCACAGGAC ； 4)引物R5——上游引物:TGTTCAAGGGA AAGGACTGG;下游引物:CTCTACCACCCATCCTGGAG。
4.一种筛选与鸡背部羽毛成熟性相关的分子遗传标记的方法，其特征在于，包括如下步骤: 从鸡血液中提取基因组DNA，用权利要求3所示的4对引物分别在鸡的基因组DNA中进行PCR扩增，获得如序列表中序列I~4所示的核苷酸序列。
5.权利要求1~2任一项所述的分子遗传标记、权利要求3所述的4对引物在选育具有背部羽毛成熟性早的优质鸡中应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的鸡为清远麻鸡。
【文档编号】C12Q1/68GK103695417SQ201310673549
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】李华, 李培周, 于辉, 邝智祥 申请人:佛山科学技术学院