一种溶藻弧菌检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种溶藻弧菌的检测试剂盒，具体包括引物及LAMP实际反应液，本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低，操作简便。
【专利说明】一种溶藻弧菌检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于病原菌诊断【技术领域】，具体涉及一种应用LAMP技术检测溶藻弧菌的快速检测试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002]溶藻弧菌是一种革兰氏阴性条件致病菌，通常人类感染是因为生食海鲜或者伤口接触了带菌的海水或海产品。临床症状主要表现为伤口感染、胃肠炎、中耳炎、眼内炎、食物中毒和败血症等疾病。目前海洋病原菌检测的传统方法主要包括前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定、血清学鉴定，需5~6天出报告，方法繁琐，费时费力。而PCR方法，虽然快速、敏感、特异，但对操作人员要求较高、且需特殊仪器，同样不适合现场检测。
[0003]环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplif1-cation, LAMP)技术是Notomi等2000年发明的一种新颖的扩增技术，该技术在具有置换活性的DNA聚合酶(BstDNA polymerase)作用下，利用特别设计的四段引物识别靶基因的六个区域，恒温条件下进行核酸扩增，以达到对目的基因的高效、特异复制的目的。另外通过环引物的添加，大大加快了反应的速度，整个过程只需要I~2 h。其结果可以根据反应的副产物白色沉淀焦磷酸镁来判断是否发生扩增，也可以在反应管中加入荧光染料，反应后观察是否变色来进行鉴别。该检测技术较常规PCR和real-time PCR来说不需要昂贵的设备、特殊的实验室环境和专业技术人员。其突出优点有:操作简便，耗时少，且特异性好、灵敏度高。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种利用LAMP技术对溶藻弧菌进行快速检测的试剂盒。`
[0005]本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
溶藻弧菌快速检测试剂盒(LAMP法)，它包括:
(I)6条引物:
表1溶藻弧菌引物
【权利要求】
1.一种溶藻弧菌检测试剂盒，其特征在于，包括: 引物； 2*反应缓冲液； Chelex-1OO 试剂； Bst DNA聚合酶； 钙黄绿素； 阳性对照DNA ； 阴性对照DNA ； 所述的引物为6条，分别为如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列的外侧引物F3和如SEQID N0.2所示的核苷酸序列的外侧引物B3^BSEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的内侧引物FIP和如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的内侧引物BIP^BSEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的环引物LF和如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列环引物LB ； 所述的2*反应的组成及含量为: pH8.8 Tris-HCl 40 mM KCl20 mM MgSO416 mM (NH4)2SO420 mM Tween200.2 % Betaine1.6 M dNTPs1.4 mM MnCl2I mM。
2.根据权利要求1所述的溶藻弧菌快速检测试剂盒，其特征在于，包括以下检测步骤: 1)取各引物干粉，加去离子水配置成IOOuM保存液，实验时将引物保存液稀释十倍使用，向Chelex-1OO中加入20ml去离子水，配成5% ChelexlOO溶液； 2)细菌基因组DNA的提取:取Iml样品菌液离心弃上清，取沉淀，细菌沉淀中加入Iml5% ChelexlOO溶液，震荡混匀后置100°C水浴lOmin，然后立即冰浴lmin，4°C 12000rpm离心lOmin，取上清即为样本DNA ； 3)在冰盒上配置25μ I反应体系如下: 2*反应缓冲液IOuM12.5μ I F3 溶液 IOuM1.Ομ I Β3 溶液 IOuM1.Ομ I FIP 溶液 IOuM1.Ομ I BIP 溶液 IOuM1.0μ I LF 溶液 IOuM1.0μ I LB 溶液 IOuM1.0μ I Bst DNA 聚合酶 8u/ul1.0μ I 钙黄绿素50uM1.0μ I 样本 DNA2.0μ I 去尚子水2.5 μ I4)扩增:将配置好的反应溶液置于恒温金属加热仪中，在63°C的条件下反应40分钟，在80°C条件下恒温 5分钟使酶灭活以终止反应；若反应管变为草绿色即可判定含有溶藻弧菌。
【文档编号】C12Q1/68GK103614486SQ201310673719
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】胡成进, 刘晓斐, 汤潜 申请人:胡成进