一种产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，属于酶制剂制备【技术领域】。以产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌1398-2-12为出发菌株，并进行培养基优化和发酵工艺改进，经特定发酵条件下的液体深层混合发酵而制备的中性蛋白酶酶活力为5500-7000U/mL；适用温度范围为30-75℃，最适反应温度70℃，在75℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为4.5-8.5，最适反应pH值为7.2。比现有的中性蛋白酶热稳定性强，酶活力较高，更适应工业化需求。
【专利说明】一种产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵【技术领域】，具体是一种产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌。
【背景技术】
[0002]蛋白酶是生物体内的一类酵素(酶)，它们能够分解蛋白质。分解方法是打断那些将氨基酸连结成多肽链的肽键。抑制蛋白酶活性的小分子化合物被称为蛋白酶抑制剂。许多病毒蛋白酶的抑制剂是很有效的抗病毒药。蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的际和胨。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶。按其活性中心和最适PH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
[0003]蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。
[0004]酶的应用已有千年以上的历史，虽然中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一，但是广泛应用还是最近几十年的事。随着科学技术的发展，随着酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造等酶技术的发展，中性蛋白酶的应用范围也不断扩大。自上世纪以来，世界各国科研工作者一直都致力于中性蛋白酶产生菌的筛选、酶提取、纯化以及酶学性质的研究和应用研究工作，取得了一定的成绩。
[0005]从目前国内中性蛋白酶发展以及研究报道来看，我国中性蛋白酶的研究总体水平来说仍处于一个起步阶段。大量研究表明，微生物发酵生产及遗传工程技术将合成特定氨基酸的基因克隆进入微生物细胞·质粒中，从而借助某些微生物增殖生产等，中性蛋白酶已广泛应用，这些方法具有产量较高、生产周期短、成本低等优点。采用基因工程与传统的微生物育种方式结合来提高菌种产酶量是一条值得继续探索的发展途径。综合过去已经取得的成绩以及在研究中存在的问题，今后发展的方向主要有以下几个方面:1.继续通过基因工程与传统的微生物育种技术进一步提高微生物产酶能力。2.采用酶体外定向技术改变酶的底物特异性与适应性，如底物亲和力、pH适应性、耐热性以及耐氧化性等等，为开拓酶的新应用领域做出贡献。3.继续寻找产中性蛋白酶新的菌种，特别是极端微生物源中性蛋白酶显得尤为重要。4.在应用方面，继续开发酶的应用领域，同时，积极开展理论与应用研究，为此酶在食品与其它行业的发展中如何做出更大贡献，将是未来营养研究的重要领域，必将为食品与其它行业高效、持续、稳定发展开辟新的广阔前景。
[0006]国内目前从事中性蛋白酶生产与销售的酶制剂企业很少，主要是由于所采用生产菌种大多为上世纪八十年代所开发的诱变菌株，产酶能力下降、不太稳定、部分优良性状出现部分退化或丧失，且易受到酵母及噬菌体的污染，对生产造成一定程度的影响。加之，目前我国中性蛋白酶发酵单位相对较低，浓缩成本高，不便保存与运输，而且，通常情况下，酶保存技术属商业机密，因此，有关中性蛋白酶酶保藏的研究仍是一个值得研究的领域。如何获得新的产中性蛋白酶菌株、提高菌株产酶能力以及如何保藏酶将成为一个发展方向。
[0007]中国专利CN1289659C公开了一种产高温中性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其制备高温中性蛋白酶的工艺和高温中性蛋白酶，所述中性蛋白酶适用反应温度为50-70°C，最适反应温度为65°C，适用pH值为5-8，最适pH值为7.0-7.2。在50°C保温I小时酶活力下降10%，在60°C下酶的半衰期45分钟。
[0008]中性蛋白酶是能催化蛋白质肽键水解，最适作用pH值在7.0左右的蛋白酶。中性蛋白酶由于具有催化反应速度快、无工业污染、催化反应条件适应性较宽等性质和优点，被应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业，但是由于中性蛋白酶热稳定性差，生产与使用条件复杂，限制了它进一步应用的范围，进一步优化选育产中性蛋白酶的优良菌株对中性蛋白酶的工业化生产具有十分重要的意义，尤其中性蛋白酶的热稳定性、耐酸碱性等酶学特性仍是本行业技术人员最为关注的问题之一。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1398-2-12。
[0010]本发明提供的枯草芽孢杆菌1398-2-12是由实验室保藏的一株产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1398_2经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得。
[0011]本发明提供的产强热稳定性中性蛋白酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌1398-2-12。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院邮编:430072)，保藏号为CCTCC NO:M2013539,分类名枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)。
[0012]所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12菌株特点如下:
[0013]所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。
[0014]本发明提供的枯草芽孢杆菌1398-2-12具有所产中性蛋白酶耐受温度高、适用pH值范围宽泛的特点，发酵液粗酶液75°C酶活完全稳定，最适反应温度70°C，pH值4.5-8.5酶活稳定，最适反应pH值7.2。该菌株最适生长PH值7.0-7.2，最适生长温度30-36°C，最适产酶温度32-35 °C。
[0015]按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株产强热稳定性中性蛋白酶的菌株枯草芽孢杆菌菌1398-2-12，发酵液中性蛋白酶酶活可达5500-7000U/mL，对酶的热稳定性进行了分析，将粗酶液分别置于40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔 10 分钟取样测定酶活。40°C、45°C、50°C、55°C下，60分钟酶活没有下降。60°C与65°C下，30分钟降到原有酶活的95%，60分钟降到85%。70°C下，30分钟降到原有酶活的85%，60分钟降到80%。75°C下，30分钟降到原有酶活的80%,60分钟降到70%。
[0016]有益效果:本发明提供的枯草芽孢杆菌1398-2-12具有产中性蛋白酶耐受温度高、适用pH值范围宽泛的特点，经筛选过程培养基优化，与出发菌株相比生长迅速，发酵液中性蛋白酶酶活可达5500-7000U/mL，比出发株酶活力提高78.5%。该菌株分泌的中性蛋白酶可耐受较高温度，粗酶液401:、451:、501:、551:下，60分钟酶活没有下降。60°C与65°C下，30分钟降到原有酶活的95%，60分钟降到85%。70°C下，30分钟降到原有酶活的85%，60分钟降到80%。75°C下，30分钟降到原有酶活的80%，60分钟降到70%，同样条件下达到同样酶活耐受温度比出发菌平均提高了 5-10°C。该菌株所产中性蛋白酶pH值4.5-8.5酶活稳定，比出发菌株所产中性蛋白酶的PH值5-8范围宽泛。
【具体实施方式】
[0017]下面通过具体的实施方式叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方式应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方式中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0018]实施例1
[0019]本发明产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株具体为1398-2-12。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院邮编:430072)，保藏号为CCTCC NO:M2013539，分类命名为枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12。
[0020]本发明提供的枯草芽孢杆菌1398-2-12由实验室保藏的一株产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌1398-2经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得。
[0021]实施例2产强热稳定性中性蛋白酶菌株的筛选方法，包括以下步骤
[0022](1)菌悬液的制备
[0023]将枯草芽孢杆菌1398-2斜面菌种在平板划线分离后长出的单菌落接入种子培养100r/min, 35°C培养12h后,取ImL培养液离心后用生理盐水洗漆两次，并重悬于9mL生理盐水中。
[0024](2)紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变
[0025]将菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射100s。将经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置35°C培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于35°C震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。
[0026](3)高产菌种的初筛
[0027]将上述涂布均匀的平板，置35°C培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌1398-2-12，1398-2-2，1398-2-3 ；
[0028](4)摇瓶发酵复筛
[0029]将获得的三株菌1398-2-12，1398-2-2, 1398-2-3在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10% (V/V)，35°C、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。
[0030](5)酶活测定
[0031]酶活力单位定义:lmL粗酶液，于70°C、pH7.2条件下，Imin水解酪蛋白产生I μ g酪氨酸，即为I个酶活力单位，以U/mL表示。
[0032]经测定，菌株1398-2-12为稳定的最高产菌株，且酶活达到6000U/mL。
[0033]该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院邮编:430072)，保藏号为CCTCCNO:M2013539o
[0034]所述氯化锂平板培养基组成为:淀粉10g，蛋白胨10g，(NH) 2S044g, K2HP048g,CaCl22g，氯化锂 9g，琼脂 20g,蒸馏水 1000mL, pH 值 7.2，121°C 灭菌 20min ；
[0035]所述种子培养基组成为:牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，NaCllOg，蒸馏水 1000 mL, pH 值 7.2，121°C 灭菌 20min ；
[0036]所述的发酵培养基:玉米粉50_150g，豆饼粉 40_100g，(NH)2S044g, K2HP048g,CaCl22g,蒸馏水 1000mL, pH 值 7.2，121°C 灭菌 20min ；
[0037]实施例3:产强热稳定性中性蛋白酶出发菌株筛选培养基的优化
[0038](一 )菌株
[0039]出发菌株选择的是筛选结果最佳的1398-2-12菌株，发酵72小时后中性蛋白酶活可达 6000U/mL。
[0040]( 二 )培养基优化`
[0041]对筛选菌株过程中的氯化锂平板培养基、种子培养基和发酵培养基进行培养基优化，以优化前相同的发酵条件发酵72小时，经检测，发酵液粗酶液中性蛋白酶活可达7000U/mL。
[0042]氯化锂优化平板培养基组成为:淀粉10g，蛋白胨10g，(NH) 2S044g, K2HP048g,CaCl22g，氯化锂9g，中草药粉剂5-20g,琼脂20g,蒸馏水1000mL, pH值7.2，121 °C灭菌20min ；
[0043]种子优化培养基组成为:牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，NaCllOg,中草药粉剂15-20g，蒸馏水lOOOmL，pH值7.2，121 °C灭菌20min ;发酵优化培养基:玉米粉 50-150g,豆饼粉 40-100g, (NH)2S044g, K2HP048g, CaCl22g，中草药粉剂 15_25g，蒸馏水lOOOmL, pH 值 7.2，121°C灭菌 20min ；
[0044]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0045]称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10_15份；黄芩10_15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70°C~90°C保持2~4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60°C~78°C保持3~4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
[0046]所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1-1.5。
[0047]实施例4:中性蛋白酶的热稳定性分析
[0048]对酶的热稳定性进行了分析，将实施例3粗酶液分别置于40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔10分钟取样测定酶活。粗酶液40 V、45°C、50°C、55°C下，60分钟酶活没有下降。60°C与65°C下，30分钟降到原有酶活的95%，60分钟降到85%。70°C下，30分钟降到原有酶活的85%，60分钟降到80%。75°C下，30分钟降到原有酶活的80%，60分钟降到70%，同样条件下达到同样酶活耐受温度比出发菌平均提高了 5-10°C，比优化培养基前的筛选菌株提高了 3-5°C。
[0049]实施例5:中性蛋白酶pH稳定性分析
[0050]对酶的pH稳定性进行了分析，将实施例3粗酶液分别置于pH值3.5,4.5,5.5、6.5、7.5、8.5下，每隔10分钟取样测定酶活。粗酶液pH值5.5、6.5、7.5下，60分钟酶活没有下降。pH值4.5与8.5下，30分钟降到原有酶活的95%，60分钟降到85%。pH值3.5下，30分钟降到原有酶活的80%，60分钟降到70%。同样条件下达到同样酶活耐pH值比出发菌和优化培养基前的筛选菌株明显宽泛。
【权利要求】
1.一种产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12,该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013539。
2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶发酵生产中的应用。
3.如权利要求2所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶发酵生产中的应用，其特征在于，氯化锂优化平板培养基组成为:淀粉10g，蛋白胨10g，(NH)2S044g, K2HP048g, CaCl22g，氯化锂 9g，中草药粉剂 5_20g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL, pH值 7.2。
4.如权利要求2所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶发酵生产中的应用，其特征在于，种子优化培养基组成为:牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉 10g, NaCllOg,中草药粉剂 15-20g，蒸馏水 1000mL, pH 值 7.2。
5.如权利要求2所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶发酵生产中的应用，其特征在于，发酵优化培养基组成为:玉米粉50-150g，豆饼粉40-100g，(NH)2S044g，K2HP048g，CaCl22g，中草药粉剂 15_25g，蒸馏水 lOOOmL，pH 值 7.2。
6.如权利要求3-5任一所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶发酵生产中的应用，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下: 称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70°C~90°C保持2~4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60V~78°C保持3~4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
7.如权利要求6所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 1398-2-12在中性蛋白酶发酵生产中的应用，其特征在于，所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1-1.5。
【文档编号】C12R1/125GK103667150SQ201310683912
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】李洪兵, 张锦杰, 朱永明, 孙明芳, 陈香, 刘德凤 申请人:湖南鸿鹰生物科技有限公司