一种不对称还原1-萘乙酮为光学纯（s）-1-萘基-1-乙醇的方法及筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种不对称还原1-萘乙酮为光学纯（S）-1-萘基-1-乙醇的方法，步骤如下：将白地霉发酵培养后，收集白地霉菌丝体；称取一定量的白地霉菌丝体，用磷酸缓冲液制成白地霉菌悬液；在菌悬液中添加底物1-萘乙酮，然后50～180r/min、25～40℃下反应5min～48h，得反应液；取反应液用等体积的乙酸乙酯萃取1～5次，将混合液在10000r/min下离心10min，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物，其中（S）-1-萘基-1-乙醇的光学纯度（e.e值）可达到99%。本方法白地霉不对称还原1-萘乙酮，可获得光学纯（S）-1-萘基-1-乙醇，经还原后获得产率为84%，e.e值99%的（S）-1-萘基-1-乙醇，反应的产率高，产物纯度高，耗时短，该方法具有简单、高效、选择性高、光学纯度高、环境友好的优点。
【专利说明】—种不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S) -1-萘基-1-乙酉孚的方法及筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于化学合成【技术领域】，涉及光学纯(S)-1-萘基-1-乙醇的合成，尤其是一种不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S) -1-萘基-1-乙醇的方法。
【背景技术】
[0002]手性芳香醇是一类具有芳香族基团的手性醇，是多种芳香醇胺类药物的重要中间体。(S)-1-萘基-1-乙醇(S (-)-1- (l-napthyl)ethanol)是合成降胆固醇药物 HMG-CoA还原酶抑制剂的重要手性中间体。手性芳香醇通常以化学不对称还原的方法获得，但化学不对称还原方法有一定难度，反应步骤较多，并且要使用价昂的手性催化试剂(二磷配体与铱、铑、钌的络化物等)，反应过程或产物造成环境污染等缺点。 [0003]手性芳香醇通常采用不对称还原的方法获得，不对称还原又分为化学不对称还原和生物不对称还原。化学催化不对称还原主要分为手性试剂控制的不对称还原和手性催化剂控制的不称还原。目前，(S) -1-萘基-1-乙醇可以通过化学催化CBS还原反应获得，即1-萘乙酮在手性恶唑硼烷(CBS催化剂)和乙硼烷的醚溶液催化下被立体选择性还原为(S)-1-萘基-1-乙酉享(MP Krzeminskij A Wojtczakj Chiral terpene auxiliaries.Partl:Highly enantioselective reduction of ketones with borane catalyzed by anoxazaborolidine derived from β -pinene.Tetrahedron letters，2005)。
[0004]生物法不对称合成主要是应用生物催化剂对前手性羰基化合物进行不对称还原，得到手性醇的方法。根据使用催化剂的形式，可分为酶催化法和生物活性细胞催化法，二者的反应实质都是通过能够催化不对称还原的酶来进行反应。由于酶对底物有精确的识别能力，因此，生物催化剂可以达到很高的对映体选择性、化学选择性和区域选择性。此外，生物催化还具有反应活性高、易于控制、反应条件温和安全、对环境的压力小、生物催化剂大部分可再生等特点。生物不对称还原中活性细胞催化是研究的热点，其中活性细胞催化还原中应用最多的为微生物细胞。生物不对称还原1-萘乙酮获得(S)-1-萘基-1-乙醇的研究国外已有报道，Bucciarelli M利用酵母细胞不对称还原获得了(S)-1-萘基-1-乙醇，但其产率仅仅为 25% (Bucciarelli Mj Forni A，Moretti I, Torre, G.Asymmetric reductionof trifluoromethyl and methyl ketones by yeast.Synthesisl983;11:897 - 9.)。Y.Naoshima等利用固定化的胡萝卜细胞还原1_萘乙酮获得(S) _1_萘基-1-乙醇产率为 54% ~70%，e.e.值 89% ~99%。(Y.Naoshimaj Y.Akakabej Biotransformationof aromatic ketones with cell cultures of carrot, tobacco and Gardenia.Phytochemistry30 (1991) 3595.)。NeetaA.Salvi 等利用少根根霉(Rhizopus arrhizus)还原1-萘乙酮获得(S)-1-萘基-1-乙醇，产率18%，e.e.74%，耗时14d (N.A.SalvijS.Chattopadhyayj Studies on Rhizopus arrhizus mediated enantioselective reductionof arylalkanones， Tetrahedron57 (2001)2833)。 Annemarie Hagej 以 Meruliustremellosus ono991还原1-蔡乙丽获得产率51%，e.e.值90%的(S)-1-蔡基-1-乙醇(A.Hage, Η.E.Asymmetric reduction of ketones via whole cell bioconversions andtransfer hydrogenation: complementary approaches.Microbiol.Biotechnol.57 (2001)79)。AshwiniL.Kamble,利用维斯假丝酵母菌(Candida viswanathii)还原1-萘乙酮获得了 e.e.值 99% 的(S)-1-萘基-1-乙醇，反应时间 12h (AshwiniL.Kamble, PankajSoni,Biocatalytic synthesis ofS (-)-1- (l_-naphthyl)ethanol by a novel isolateof Candida viswanathi1.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic35 (2005)1-6)。国内尚未见白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮为(S) -1-萘基-1-乙醇的研究报道。
[0005]化学不对称还原获得手性芳香醇通常需要昂贵的手性催化剂，反应过程复杂，技术难度高，反应器具要求高，投资大，反应过程或反应副产物污染环境。酶法还原所需要的酶要经过复杂的分离纯化，且在不对称还原时还需要加入昂贵的辅酶以保证反应的进行。与纯酶催化相比，利用微生物细胞进行催化反应的生物还原具有明显优点，一般情况下，微生物细胞含有可以接受广泛非天然底物的多种脱氢酶、所有必需的辅酶及其再生途径，辅酶循环再生由细胞自动完成。进行不对称还原反应时只需要加入少量的能源物质如葡萄糖或醇类等作为辅助底物即可，同时，所有的酶和辅酶处在天然的细胞环境中，可减少环境因素对酶活的影响。并且，全细胞生物催化省去复杂的酶分离和纯化的步骤，在利用它的还原能力时极为方便。但目前使用的微生物细胞不对称还原获得(S)-1-萘基-1-乙醇的方法要么产物产率低，要么e.e值低，要么反应耗时长，采用的微生物种类也相对有限。
[0006]通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种在水相中利用微生物细胞不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，该方法简单、高效、选择性高、光学纯度高、环境友好，经还原后获得产率为84%，e.e值99%的(S)-1-萘基-1-乙醇，丰富了微生物活细胞不对称还原反应的微生物种类。
[0008]本发明实现目的的技术方案是:
[0009]一种不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S) -1-萘基-1-乙醇的方法，步骤如下:
[0010]⑴菌丝体的制备:将白地霉发酵培养后,收集白地霉菌丝体；
[0011]⑵白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇:
[0012]称取白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为2~11的磷酸缓冲液制成菌体浓度为20~200mg/mL的白地霉菌悬液；
[0013]在菌悬液中以I~10mmol/100mL的浓度添加底物1-萘乙酮，然后50~180r/min、25~40°C下反应5min~48h，得反应液；
[0014]取反应液用等体积的乙酸乙酯萃取I~5次，将混合液在10000r/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物，其中(S) -1-萘基-1-乙醇的光学纯度(e.e值)可达到99%。
[0015]而且，所述的不对称还原1-萘乙酮为光学 纯(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，步骤如下:
[0016]⑴菌丝体的制备:将白地霉发酵培养后,收集白地霉菌丝体；[0017]⑵白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇:
[0018]称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为4的磷酸缓冲液制成菌体浓度为60mg/mL的白地霉菌悬液；
[0019]在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，然后180r/min、30°C下反应4h,得反应液；
[0020]取反应液用等体积的乙酸乙酯萃取I~5次，将混合液在10000r/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物，其中(S) -1-萘基-1-乙醇的光学纯度(e.e值)可达到99%。
[0021]而且，所述步骤⑵中在菌悬液中以I~lOmmol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，再进行如下处理:向添加有1-萘乙酮的菌悬液中以5~30g/L的添加量添加辅助底物，辅助底物为丙醇、乙醇、异丙醇、甲醇、甘油、葡萄糖或者果糖，然后180r/min、3(TC下反应4h，得反应液。
[0022]而且，所述辅助底物的添加量为20g/L。
[0023]而且，所述步骤⑴中白地霉发酵培养的具体步骤如下:
[0024]将斜面上的白地霉接种于IOOmL种子培养基中，180r/min，30°C下培养24h ;再以2%的接种量接种于发酵培养基中，180r/min，30°C下培养48h。
[0025]而且，所述种子培养基组成:葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉3g/L，麦芽汁浸粉 3g/L ；
[0026]发酵培养基组成:葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，麦芽汁浸粉3g/L ；
[0027]或者，发酵培养基组成:甘油为5~15g/L，酵母浸粉为5~10g/L，硫酸镁为I~3g/L。
[0028]而且，所述发酵培养基组成为:甘油10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO4.7H202g/L。
[0029]而且，所述步骤⑴中菌丝体的制备的具体步骤为:将白地霉发酵培养后，得白地霉发酵液，将发酵获得的白地霉发酵液过滤并用0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液洗涤两次，收集白地霉菌丝体。
[0030]而且，所述白地霉为白地霉WGK2-1菌株。
[0031]如上所述的不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S)-1-萘基-1-乙醇的方法的筛选方法，步骤如下:
[0032]⑴反应体系反应温度的选择
[0033]获取白地霉WGK2-1菌丝体，称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L的pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为160mg/mL的白地霉菌悬液，在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1-萘乙酮，180r/min，不同的反应温度下反应24h，反应温度分别为25°C、30°C、35°C、40°C，取一定体积的反应液，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在10000r/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算(S)-1-萘基-1-乙醇产率、e.e.值，选择e.e.值最高的作为反应温度；
[0034]⑵反应体系反应转速的选择
[0035]获取白地霉菌丝体，称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为160mg/mL的白地霉菌悬液，在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1-萘乙酮，30°C，不同转速下反应24h,转速分别为50r/min、100r/min、180r/min,取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算(S)-1-萘基-1-乙醇产率和e.e值，选择e.e.值最高的作为反应转速；
[0036]⑶反应体系底物浓度的选择
[0037]按步骤⑴的方法培养白地霉获取白地霉菌丝体。称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为160mg/mL的白地霉菌悬液。在菌悬液中添加不同浓度的底物1-萘乙酮，分别为l、2、4、5、7、10mmol/100mL，180r/min，3(TC下反应24h。取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测，计算(S) -1-萘基-1-乙醇产率和e.e值，选择e.e.值最高的作为1_萘乙酮添加浓度；
[0038]⑷反应体系菌体底物浓度的选择
[0039]按步骤⑴的方法培养白地霉获取白地霉菌丝体。称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成不同菌体浓度的白地霉菌悬液，分别为20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL> 160mg/mL>200mg/mL 的白地霉菌悬液。在菌悬液中以lmmol/lOOmml的浓度添加底物1_萘乙酮,30°C, 180r/min下反应24h。取一定体积的反应液，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算(S) -1-萘基-1-乙醇产率和e .e值，选择e.e.值最高的作为反应液菌体浓度；
[0040](5)反应体系反应时间的筛选
[0041]获取白地霉菌丝体，称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为60mg/mL的白地霉菌悬液，在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1-萘乙酮，180r/min,30°C下反应,每隔一定的时间取反应液，分别在反应5min、10min、20min、30min、60min、4h、8h、24h、48h取样。将取得的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算(S)-1-萘基-1-乙醇产率和e.e.值,选择e.e.值最高的作为反应时间；
[0042](6)反应体系反应液pH的选择
[0043]获取白地霉菌丝体，称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH不同的缓冲液制成菌体浓度为60mg/mL的白地霉菌悬液，pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9，在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，180r，30°C下反应24h，取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在10000r/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测，计算(S)-1-萘基-1-乙醇产率、e.e.值，选择e.e.值最高的作为反应体系的pH ;
[0044](7)反应体系中辅助底物的添加和添加水平的选择
[0045]获取白地霉菌丝体，称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol的pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为60mg/mL的白地霉菌悬液，在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1-萘乙酮，以10g/L的添加量添加不同的辅助底物，分别丙醇、乙醇、异丙醇、甲醇、甘油、葡萄糖、果糖，在180r/min，30°C下反应24h，取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算产率、e.e.值，选择e.e.值最高的辅助底物；
[0046]添加不同水平的该辅助底物，添加量分别为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L，选择e.e.值最闻的添加量；
[0047](8)在发酵培养基中添加不同水平的硫酸镁对白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮的影响
[0048]在发酵培养基中，添加不同水平的硫酸镁，分别为0g、lg、2g、3g、4g，发酵并收集白地霉菌丝体；将收获的白地霉菌丝体在60°C下烘至恒重，称重得到不同发酵培养基可收获的菌体干重，按步骤⑵对各个发酵培养基收获的白地霉菌丝体进行1-萘乙酮的不对称还原，并计算产物产率和e.e值，选择e.e值最高的作为硫酸镁的添加量；
[0049](9)不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌丝体发酵培养基氮源的优化
[0050]以葡萄糖为碳源(10g/L)，分别以酵母浸粉、蛋白胨、麦芽浸粉、黄豆粉、硫酸铵、硝酸铵、甲酸铵为氮源(5g/L)做为发酵培养基培养，发酵并收集白地霉菌丝体，将收获的白地霉菌丝体在60°C下烘至恒重，称重得到不同发酵培养基可收获的菌体干重(g/L)，按步骤⑵对各个发酵培养基收获的白地霉菌丝体进行1-萘乙酮的不对称还原，并计算产物产率和e.e值,选择e.e.值最高的作为氮 源添加；
[0051](10)不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌丝体发酵培养基碳源的优化
[0052]以酵母浸粉为氮源(5g/L)，分别以蔗糖、果糖、乳糖、甘油、甘露醇、葡萄糖、淀粉为碳源(10g/L),做为发酵培养基培养白地霉菌丝体按步骤⑴收集白地霉菌丝体，将收获的白地霉菌丝体在60°C下烘至恒重，称重得到不同发酵培养基可收获的菌体干重(g/L)，按步骤⑵对各个发酵培养基收获的白地霉菌丝体进行1-萘乙酮的不对称还原，并计算产物产率和e.e值,选择e.e.值最高的作为碳源添加。
[0053]本发明的优点和有益效果为:
[0054]1.本发明方法利用白地霉菌株发酵获得的白地霉菌丝体，在水相系统中，一定的反应条件下对底物1-萘乙酮进行生物不对称还原，获得较高产率和对映体过量值e.e.值(%e.e.越高光学纯度越高)的(S)-1-萘基-1-乙醇。白地霉不对称还原1-萘乙酮，可获得光学纯(S) -1-萘基-1-乙醇，经还原后获得产率为84%，e.e值99%的(S) -1-萘基-1-乙醇，反应的产率高，产物纯度高，耗时短，该方法具有简单、高效、选择性高、光学纯度高、环境友好的优点。
[0055]2.本发明方法不但将廉价的1-萘乙酮不对称还原为具有较高价值的降低胆固醇药物重要手性中间体一 (S) -1-萘基-1-乙醇，而且有助于了解微生物细胞不对称还原合成手性化合物，丰富了不对称还原的微生物种类，对今后专用的手性微生物和手性微生物酶源的开发和不对称还原具有重要意义。
[0056]3.本发明筛选方法经不对称还原体系反应条件的优化，确定了该菌不对称还原萘乙酮获得(S)-1-萘基-1-乙醇的反应条件，建立了反应体系，确定了该菌株不对称还原反应时添加的辅助底物种类及水平，提高了不对称还原水平；经过培养基的优化，培养基发酵获得白地霉菌丝体量和不对称还原能力均有所提高，确定了白地霉的发酵培养基组成。
【专利附图】
【附图说明】
[0057]图1为本发明中反应温度对白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮的影响图；
[0058]图2为本发明中转速对白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮的影响图；
[0059]图3为本发明中底物添加浓度对白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮的影响图；
[0060]图4为本发明中菌体浓度对白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮的影响图；
[0061]图5为本发明中白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮的时间进程图；
[0062]图6为本发明中缓冲液pH对白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮的影响图；
[0063]图7为本发明中不同辅助底物对白地霉不对称还原1-萘乙酮的影响图；
[0064]图8为本发明中异丙醇添加浓度对白地霉不对称还原1-萘乙酮的影响图；
[0065]图9为本发明中硫酸镁添加水平对白地霉菌体干重和不对称还原的影响图；
[0066]图10为本发明中不同氮 源对白地霉生长的影响图；
[0067]图11为本发明中不同氮源对白地霉不对称还原1-萘乙酮的影响图；
[0068]图12为本发明中不同碳源对白地霉生长的影响图；
[0069]图13不同碳源对白地霉不对称还原-萘乙酮的影响图。
【具体实施方式】
[0070]下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0071 ] 如无特殊说明，本发明中所使用的试剂为常规试剂；如无特殊说明，所使用的方法为常规方法。
[0072]本发明对该白地霉的不对称还原反应中的各项反应条件进行了优化，建立了反应体系，考察了反应体系中加入不同辅助底物和辅助底物的添加浓度的造成的影响，并且对培养具有高选择性白地霉菌丝体的发酵培养基进行了优化。
[0073]本发明中1-萘乙酮和(S)-1-萘基-1-乙醇分析方法的检测如下:
[0074]采用安捷伦高效液相色谱1200系统对标品1-萘乙酮和1-萘基-1-乙醇进行检测分析。通过安捷伦C-18柱对1-萘乙醇、1-萘基-1-乙醇标品进行分析，两者的保留时间分别为8.46min、6.21min,具体液相条件为色谱柱AgilentTC-18 (4.6X250mm),流动相体积比为乙腈:水=6:4，流速1.0mL/min，柱温25°C，柱压常压；检测波长UV225nm，进样量20 μ L0通过ChiraIFisienS SCDP手性柱对(R) -1-萘基-1-乙醇和(S) -1-萘基-1-乙醇标品进行分析，两者的保留时间分别为4.20min、6.62min。具体的液相色谱条件为:手性柱ChiralFistcn? SCDP (4.6X 150mm),流动相体积比为正己烧:异丙醇=90:10,流速为0.5mL/min,柱温为25°C，柱压常压；检测波长为UV210nm。
[0075]产物(S) -1-萘基-1-乙醇的光学纯度通过对映体过量值(％e.e.)来评价:
[0076]对映体过量值(％e.e.)=[ (Ss-Se) / (Ss+SE) ] X 100% ；
[0077]产率(％)= (C/C。)X 100% ；
[0078]式中Ss为(S) -1-萘基-1-乙醇的峰面积，Sk为(R) _1_萘基_1_乙醇的峰面积，C为反应后体系中的(S) -1-萘基-1-乙醇摩尔浓度，C0为初始1-萘乙酮的摩尔浓度。
[0079]本发明中不对称还原反应白地霉的确定:将实验室保存的从新疆传统乳制品中分离出的白地霉菌株WGK2-1对1-萘乙酮在水相中进行不对称还原，以(S)-1-萘基-1-乙醇的产率和光学纯度(e.e.值)为指标，考察其不对称还原萘乙酮的能力。结果表明，其不对称还原萘乙酮获得萘乙醇的产率为57%，e.e值为99%。
[0080]本发明白地霉菌丝体不对称还原反应体系及反应条件的优化的总体思路如下:
[0081]1.白地霉菌的培养及白地霉菌丝体的制备
[0082]将平板上的白地霉菌丝体接种于种子培养基中，培养24h获得种子液。以2%的接种量接种于发酵培养基中，30°C，180r/min培养48h。培养结束后，将发酵液中的菌丝体过滤并用pH为7的0.2mol/L磷酸缓冲液洗涤两次，将收集的白地霉菌丝体用于还原反应。
[0083]2.白地霉菌丝体的不对称还原反应
[0084]将得到的白地霉菌丝体用一定pH的0.2mol/L缓冲液制成一定浓度的白地霉菌丝悬液，反应在菌悬液中进行。考察反应体系PH2~11，反应温度25~40°C，转速50~180r/min,菌悬液浓度20~200mg/mL,底物浓度I~lOmmol/lOOmL,反应时间5min~48h对白地霉菌丝体不对称还原萘乙酮的影响(以产率和e.e值为指标)。
[0085]3.不同辅助底物及辅助底物浓度对白地霉菌丝体不对称还原萘乙酮的影响
[0086](I)在白地霉菌丝体不对称还原萘乙酮的反应体系中加入不同的辅助底物，如丙醇、乙醇、甲醇、异丙醇、甘油、葡萄糖、果糖等，不同辅助底物对不对称还原反应的影响。
[0087](2)在考察不同辅助底物种类的基础上考察某种辅助底物添加浓度对不对称还原反应的影响，如异丙醇添加5~30g/L对不对称还原反应的影响。
[0088]4.菌株的发酵培养基培养优化
[0089](1)不同碳源的发酵培养基如蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、甘油、淀粉等对白地霉菌体培养(以菌体干重为指标)及不对称还原的影响；碳源添加水平对白地霉培养及不对称还原反应的影响。
[0090](2)不同氮源的发酵培养基如酵母浸粉、蛋白胨、黄豆粉、硫酸铵、硝酸铵等对白地霉菌体培养和不对称还原反应的影响；氮源添加水平对白地霉培养及不对称还原反应的影响。
[0091](3)添加硫酸镁及添加水平对白地霉菌体培养和不对称还原反应的影响
[0092](4)培养基中添加其他金属离子对白地霉培养和不对称还原反应的影响，如硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、氯化钙等。
[0093](5)采用正交实验最终确定白地霉发酵培养基的组成。优化后白地霉菌丝体不对称还原萘乙酮为(S) -1-萘基-1-乙醇的产率为84%，e.e值为99%。
[0094]本发明所使用的白地霉为具有不对称还原能力的微生物白地霉，其为可以不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌株，菌株的名称为WGK2-1，分类命名为:白地霉Geotrichum candidum，保存编号为:CGMCCN0.5259，保藏日期:2011年09月20日，保藏单位为:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。(专利号:ZL201110439277.0，发明创造名称:一种高产胞外多糖的产香白地霉菌株及胞外多糖和挥发性风味物质。)
[0095]一种不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S) -1-萘基-1-乙醇的方法，步骤如下:[0096]⑴白地霉WGK2-1菌株的培养:
[0097]将斜面上的白地霉接种于IOOmL种子液培养基中，180r/min，30°C下培养24h ；再以2%的接种量接种于发酵培养基中(250mL三角瓶装液lOOmL)，180r/min，30°C下培养48h ；
[0098]其中，种子培养基组成(g/L):葡萄糖10，蛋白胨5，酵母浸粉3，麦芽汁浸粉3 ;
[0099]发酵培养基组成(g/L):葡萄糖10，蛋白胨5，酵母浸粉5，麦芽汁浸粉3 ;
[0100]或者，发酵培养基组成:甘油为5~15g/L，酵母浸粉为5~10g/L，硫酸镁为I~3g/L ；
[0101]发酵培养基组成优选:甘油10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO4 ? 7H202g/L。
[0102]白地霉WGK2-1菌丝体的制备:将发酵获得的白地霉发酵液过滤并用0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液洗涤两次，收集白地霉菌丝体。
[0103]⑵白地霉WGK2-1菌丝体不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇:
[0104]称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为2~9的磷酸缓冲液制成菌体浓度为20~200mg/mL的白地霉菌悬液；
[0105]在菌悬液中 以I~lOmmol/lOOmL的浓度添加底物1-萘乙酮，50~180r/min, 25~40°C下反应5min~48h,得反应液；
[0106]取反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在10000r/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物，其中(S) -1-萘基-1-乙醇的光学纯度(e.e值)可达到99%。
[0107]检测结果:
[0108]将光学纯(S) -1-萘基-1-乙醇用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，产物(S) -1-萘基-1-乙醇产率为57%，e.e.值为99%。
[0109]以上检测结果表明，白地霉菌株WGK2-1具有不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇的能力，且产物有较高的e.e.值。
[0110]上述白地霉菌株WGK2-1菌丝体的不对称还原反应的最优反应条件的筛选方法，步骤如下:
[0111](I)白地霉WGK2-1菌株的培养:
[0112]将斜面上的白地霉接种于IOOmL种子液培养基中，180r/min，30°C下培养24h。再以2%的接种量接种于发酵培养基中(250mL三角瓶装液lOOmL)，180r/min，30°C下培养48h。种子培养基组成(g/L):葡萄糖10，蛋白胨5，酵母浸粉3，麦芽汁浸粉3。发酵培养基组成(g/L):葡萄糖10，蛋白胨5，酵母浸粉5，麦芽汁浸粉3。
[0113]白地霉WGK2-1菌丝体的制备:将发酵获得的白地霉发酵液过滤并用0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液洗涤两次，收集白地霉菌丝体。
[0114]⑵白地霉WGK2-1菌丝体不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇:
[0115]称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为I的磷酸缓冲液制成菌体浓度为160mg/mL的白地霉菌悬液。在菌悬液中以I~lOmmol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，180r/min, 25~40°C下反应24h。取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物，用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，产物(S)-1-萘基-1-乙醇产率为57%，e.e.值为99%。白地霉菌株WGK2-1具有不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇的能力，且产物有较高的e.e.值。
[0116]⑶反应体系反应温度的选择
[0117]按步骤⑴的方法培养白地霉获取白地霉WGK2-1菌丝体。称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L的pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为160mg/mL的白地霉菌悬液。在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，180r/min,不同的反应温度下反应24h，反应温度分别为25V、30 V、35°C、40 V。取一定体积的反应液，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算(S)-1-萘基-1-乙醇产率、e.e.值。结果如图1所示。
[0118]根据图1，选择30°C为白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮的反应温度。
[0119]⑷反应体系反应转速的选择
[0120]按步骤⑴的方法培养白地霉WGK2-1，获取白地霉菌丝体。称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为160mg/mL的白地霉菌悬液。在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，30°C，不同转速下反应24h，转速分别为50r/min、100r/min、180r/min。取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次,将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检 测分析，计算(S) -1-萘基-1-乙醇产率和e.e值。结果如图2所示。
[0121 ] (5)反应体系底物浓度的选择
[0122]按步骤⑴的方法培养白地霉获取白地霉菌丝体。称取一定量的白地霉菌丝体，用
0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为160mg/mL的白地霉菌悬液。在菌悬液中添加不同浓度的底物1-萘乙酮，分别为l、2、4、5、7、10mmol/100mL，180r/min，3(TC下反应24h。取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测，计算(S) -1-萘基-1-乙醇广率和e.e值。结果如图3所不。
[0123]根据图3，选择Immol/lOOmL为1-萘乙酮添加浓度。
[0124](6)反应体系菌体底物浓度的选择
[0125]按步骤⑴的方法培养白地霉获取白地霉菌丝体。称取一定量的白地霉菌丝体，用
0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成不同菌体浓度的白地霉菌悬液，分别为20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL> 160mg/mL>200mg/mL 的白地霉菌悬液。在菌悬液中以lmmol/lOOmml的浓度添加底物1_萘乙酮,30°C, 180r/min下反应24h。取一定体积的反应液，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算(S) -1-萘基-1-乙醇产率和e.e值。结果如图4所示。
[0126]根据图4,选择60mg/mL为反应液菌体浓度。
[0127](7)反应体系反应时间的筛选
[0128]按步骤⑴的方法培养白地霉获取白地霉菌丝体。称取一定量的白地霉菌丝体，用
0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为60mg/mL的白地霉菌悬液。在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，180r/min, 30°C下反应48h,每隔一定的时间取反应液，分别在反应5min、10min、20min、30min、60min、4h、8h、24h、48h取样。将取得的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在10000r/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算
(S)-1-萘基-1-乙醇产率和e.e.值。结果如图5所示。
[0129]根据图5，选择4h为反应终止时间。
[0130]⑶反应体系反应液pH的选择
[0131]按步骤⑴的方法培养白地霉获取白地霉菌丝体。称取一定量的白地霉菌丝体，用
0.2mol/L、pH不同的缓冲液制成菌体浓度为60mg/mL的白地霉菌悬液，pH分别为2、3、4、5、
6、7、8、9。在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1-萘乙酮，180r，30°C下反应24h。取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测，计算(S)-1-萘基-1-乙醇产率、e.e.值。结果如图6所示。
[0132]根据图6，选择反应体系的pH为4。
[0133]⑶反应体系中辅助底物的添加和添加水平的选择
[0134]按步骤⑴的方法培养白地霉获取白地霉菌丝体。称取一定量的白地霉菌丝体，用
0.2mol的pH值为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为60mg/mL的白地霉菌悬液。在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，以10g/L的添加量添加不同的辅助底物，分别丙醇、乙醇、异丙醇、甲醇、甘油、葡萄糖、果糖，在180r/min，3(TC下反应24h。取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算产率、e.e.值。检测结果显示添加不同的辅助底物参与反应，产物e.e.值均大于99%，产率不同，产率结果如图7所示。
[0135]根据图7，选择异丙醇为辅助底物。并添加不同水平的辅助底物异丙醇，添加量分别为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L。结果如图8所示，选择合适的添加量为20g/L。
[0136](W)在发酵培养基中添加不同水平的硫酸镁对白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮的影响
[0137]在发酵培养基中(葡萄糖10g/L，酵母浸粉5g/L)，添加不同水平的硫酸镁(MgSO4 ? 7H20)，分别为0g、lg、2g、3g、4g，按步骤⑴发酵并收集白地霉菌丝体。将收获的白地霉菌丝体在60°C下烘至恒重，称重得到不同发酵培养基可收获的菌体干重(g/L)。按步骤⑵对各个发酵培养基收获的白地霉菌丝体进行1-萘乙酮的不对称还原，并计算产物产率和e.e值。结果显示，添加不同水平硫酸镁进行发酵收获的白地霉菌丝体进行不对称还原反应，收获菌体干重相似，产物的e.e.值均大于99%，但产率不同，结果如图9所示。
[0138](11)不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌丝体发酵培养基氮源的优化
[0139]以葡萄糖为碳源(10g/L)，分别以酵母浸粉、蛋白胨、麦芽浸粉、黄豆粉、硫酸铵、硝酸铵、甲酸铵为氮源(5g/L)做为发酵培养基培养，按步骤⑴发酵并收集白地霉菌丝体。将收获的白地霉菌丝体在60°C下烘至恒重，称重得到不同发酵培养基可收获的菌体干重(g/L)。按步骤⑵对各个发酵培养基 收获的白地霉菌丝体进行1-萘乙酮的不对称还原，并计算产物产率和e.e值。结果如图10、11所示。
[0140]根据图10、11，选取酵母浸粉为氮源。
[0141](12)不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌丝体发酵培养基碳源的优化
[0142]以酵母浸粉为氮源(5g/L)，分别以蔗糖、果糖、乳糖、甘油、甘露醇、葡萄糖、淀粉为碳源(10g/L),作为发酵培养基培养白地霉菌丝体按步骤⑴收集白地霉菌丝体。将收获的白地霉菌丝体在60°C下烘至恒重，称重得到不同发酵培养基可收获的菌体干重(g/L)。按步骤⑵对各个发酵培养基收获的白地霉菌丝体进行1-萘乙酮的不对称还原，并计算产物产率和e.e值。结果如图12、13所示。
[0143]根据以上结果，选取甘油为发酵培养基碳源。
[0144](13)正交试验优化不对称还原1-萘乙酮的白地霉发酵培养基
[0145]对白地霉发酵培养基进行三因素三水平的正交实验，三因素分别为甘油、酵母浸粉、硫酸镁，甘油水平分别为5g/L、10g/L、15g/L，酵母水平分别为5g/L、7g/L、10g/L，硫酸镁水平为lg/L、2g/L、3g/L，正交表如表1所示。按正交设计表配置发酵培养基并按实施例1中的发酵方法进行培养，并收集白地霉菌丝体。菌丝体60°C下烘至恒重，称重得到菌体干重。白地霉菌丝体按实施例2进行不对称还原1-萘乙酮的反应，计算产物产率，实验结果和正交结果分析如表2、3所示。根据正交结果及分析，确定发酵培养基成分为:甘油IOg/L，酵母浸粉10g/L，MgSO4 WH2C^gzl15在此培养基下按步骤⑴培养收集白地霉菌丝体，按步骤⑵进行白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮的反应，产物(S) -1-萘基-1-乙醇的产率为84%, e.e 值为 99%。
[0146]表1
[0147]
【权利要求】
1.一种不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S) -1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:步骤如下: ⑴菌丝体的制备:将白地霉发酵培养后，收集白地霉菌丝体； ⑵白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇: 称取白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为2~11的磷酸缓冲液制成菌体浓度为20~200mg/mL的白地霉菌悬液； 在菌悬液中以I~lOmmol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，然后50~180r/min、25~40°C下反应5min~48h，得反应液； 取反应液用等体积的乙酸乙酯萃取I~5次,将混合液在10000r/min下离心IOmin,取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物，其中(S) -1-萘基-1-乙醇的光学纯度(e.e值)可达到99%。
2.根据权利要求1所述的不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:步骤如下: ⑴菌丝体的制备:将白地霉发酵培养后，收集白地霉菌丝体； ⑵白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮为(S) -1-萘基-1-乙醇: 称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为4的磷酸缓冲液制成菌体浓度为60mg/mL的白地霉菌悬液； 在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，然后180r/min、30°C下反应4h,得反应液； 取反应液用等体积的乙酸乙酯萃取I~5次,将混合液在10000r/min下离心IOmin,取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物，其中(S) -1-萘基-1-乙醇的光学纯度(e.e值)可达到99%。
3.根据权利要求1所述的不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述步骤⑵中在菌悬液中以I~lOmmol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，再进行如下处理:向添加有1-萘乙酮的菌悬液中以5~30g/L的添加量添加辅助底物，辅助底物为丙醇、乙醇、异丙醇、甲醇、甘油、葡萄糖或者果糖，然后180r/min、3(TC下反应4h，得反应液。
4.根据权利要求3所述的不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述辅助底物的添加量为20g/L。
5.根据权利要求1所述的不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述步骤⑴中白地霉发酵培养的具体步骤如下: 将斜面上的白地霉接种于IOOmL种子培养基中，180r/min，30°C下培养24h ;再以2%的接种量接种于发酵培养基中，180r/min，30°C下培养48h。
6.根据权利要求1或2所述的不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述种子培养基组成:葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉3g/L，麦芽汁浸粉3g/L ； 发酵培养基组成:葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，麦芽汁浸粉3g/L ;或者，发酵培养基组成:甘油为5~15g/L，酵母浸粉为5~10g/L，硫酸镁为I~3g/L。
7.根据权利要求6所述的不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述发酵培养基组成为:甘油10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO4.7H202g/L。
8.根据权利要求1所述的不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述步骤⑴中菌丝体的制备的具体步骤为:将白地霉发酵培养后，得白地霉发酵液，将发酵获得的白地霉发酵液过滤并用0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液洗涤两次，收集白地霉菌丝体。
9.根据权利要求1至8任一项所述的不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S)-1-萘基-1-乙醇的方法，其特征在于:所述白地霉为白地霉WGK2-1菌株。
10.一种如权利要求1至9任一项所述的不对称还原1-萘乙酮为光学纯(S) -1-萘基-1-乙醇的方法的筛选方法，其特征在于:步骤如下: ⑴反应体系反应温度的选择 获取白地霉WGK2-1菌丝体，称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L的pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为160mg/mL的白地霉菌悬液，在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1-萘乙酮，180r/min，不同的反应温度下反应24h，反应温度分别为25°C、30°C、35°C、40°C，取一定体积的反应液，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在10000r/min下离心IOmin,取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算(S)-1-萘基-1-乙醇产率、e.e.值，选择e.e.值最高的作为反应温度； ⑵反应体系反应转速的选择 获取白地霉菌丝体，称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为160mg/mL的白地霉菌悬液，在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1-萘乙酮，30°C，不同转速下反应24h,转速分别为50r/min、100r/min、180r/min,取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算(S)-1-萘基-1-乙醇产率和e.e值，选择e.e.值最高的作为反应转速； ⑶反应体系底物浓度的选择 按步骤⑴的方法培养白地霉获取白地霉菌丝体。称取一定量的白地霉菌丝体，用.0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为160mg/mL的白地霉菌悬液。在菌悬液中添加不同浓度的底物1-萘乙酮，分别为l、2、4、5、7、10mmol/100mL，180r/min，3(TC下反应24h。取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心IOmin,取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测，计算(S) -1-萘基-1-乙醇产率和e.e值，选择e.e.值最高的作为1_萘乙酮添加浓度； ⑷反应体系菌体底物浓度的选择 按步骤⑴的方法培养白地霉获取白地霉菌丝体。称取一定量的白地霉菌丝体，用.0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成不同菌体浓度的白地霉菌悬液，分别为20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL> 160mg/mL>200mg/mL 的白地霉菌悬液。在菌悬液中以lmmol/lOOmml的浓度添加底物1_萘乙酮,30°C, 180r/min下反应24h。取一定体积的反应液，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算(S) -1-萘基-1-乙醇产率和e.e值，选择e.e.值最高的作为反应液菌体浓度； (5)反应体系反应时间的筛选 获取白地霉菌丝体，称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为60mg/mL的白地霉菌悬液，在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，180r/min,30°C下反应，每隔一定的时间取反应液，分别在反应5min、10min、20min、30min、60min、4h、8h、24h、48h取样。将取得的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算(S)-1-萘基-1-乙醇产率和e.e.值，选择e.e.值最高的作为反应时间； (6)反应体系反应液pH的选择 获取白地霉菌丝体，称取一定量的白地霉菌丝体，用0.2mol/L、pH不同的缓冲液制成菌体浓度为60mg/mL的白地霉菌悬液，pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9，在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1_萘乙酮，180r，30°C下反应24h，取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在10000r/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测，计算(S)-1-萘基-1-乙醇产率、e.e.值，选择e.e.值最高的作为反应体系的pH ; (7)反应体系中辅助底物的添加和添加水平的选择 获取白地霉菌丝体，称取一定量 的白地霉菌丝体，用0.2mol的pH为7的磷酸缓冲液制成菌体浓度为60mg/mL的白地霉菌悬液，在菌悬液中以Immol/lOOmL的浓度添加底物1-萘乙酮，以10g/L的添加量添加不同的辅助底物，分别丙醇、乙醇、异丙醇、甲醇、甘油、葡萄糖、果糖，在180r/min，30°C下反应24h，取一定体积的反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，将混合液在lOOOOr/min下离心lOmin，取有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸有机相得到油状物并用乙醇溶解，将样品用高效液相检测分析，计算产率、e.e.值，选择e.e.值最高的辅助底物； 添加不同水平的该辅助底物，添加量分别为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L，选择e.e.值最闻的添加量； ⑶在发酵培养基中添加不同水平的硫酸镁对白地霉菌丝体不对称还原1-萘乙酮的影响 在发酵培养基中，添加不同水平的硫酸镁，分别为Og、lg、2g、3g、4g，发酵并收集白地霉菌丝体；将收获的白地霉菌丝体在60°C下烘至恒重，称重得到不同发酵培养基可收获的菌体干重，按步骤⑵对各个发酵培养基收获的白地霉菌丝体进行1-萘乙酮的不对称还原，并计算产物产率和e.e值，选择e.e值最高的作为硫酸镁的添加量； (9)不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌丝体发酵培养基氮源的优化 以葡萄糖为碳源(10g/L)，分别以酵母浸粉、蛋白胨、麦芽浸粉、黄豆粉、硫酸铵、硝酸铵、甲酸铵为氮源(5g/L)做为发酵培养基培养，发酵并收集白地霉菌丝体，将收获的白地霉菌丝体在60°C下烘至恒重，称重得到不同发酵培养基可收获的菌体干重(g/L)，按步骤⑵对各个发酵培养基收获的白地霉菌丝体进行1-萘乙酮的不对称还原，并计算产物产率和e.e值,选择e.e.值最高的作为氮源添加；(10)不对称还原1-萘乙酮为(S)-1-萘基-1-乙醇的白地霉菌丝体发酵培养基碳源的优化 以酵母浸粉为氮源(5g/L)，分别以蔗糖、果糖、乳糖、甘油、甘露醇、葡萄糖、淀粉为碳源(10g/L)，作为发酵培养基培养白地霉菌丝体按步骤⑴收集白地霉菌丝体，将收获的白地霉菌丝体在60°C下烘至恒重，称重得到不同发酵培养基可收获的菌体干重(g/L)，按步骤⑵对各个发酵培养基收获的白地霉菌丝体进行1-萘乙酮的不对称还原，并计算产物产率和e.e值,选择e.e.值最高的 作为碳源添加。
【文档编号】C12P7/22GK103642849SQ201310684508
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】王昌禄, 郭敏, 李贞景, 陈勉华, 李风娟 申请人:天津市食品加工工程中心