一种高效表达α-转移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种高效表达α-转移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株，其保藏编号为CGMCC?No.8469。本发明通过紫外诱变的方法获得的突变菌株黑曲霉Atm61能高效重组表达α-转移葡萄糖苷酶，其发酵酶活高达14952U/mL，比出发菌提高了58%。该突变菌株黑曲霉Atm61表达的α-转移葡萄糖苷酶，可广泛应用于低聚异麦芽糖浆的生产，能使转苷效率提高40%～50%以上，获得的异麦芽糖浆中异麦芽低聚糖的质量体积比高达90%，市场前景广阔。
【专利说明】一种高效表达Ct-转移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物诱变筛选【技术领域】，具体涉及一种高效异源表达a -转移葡萄糖苷酶的黑曲霉(Asperillus niger)菌株及其应用。
【背景技术】
[0002]a转移葡萄糖苷酶(a -transglucosidase E.C.2.4.1.24)能够从低聚糖类底物的非还原性末端切开a-1、4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基以a_l、6糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖(简称頂0，主要包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖及四糖以上的低聚糖)、糖脂或糖肽等。该酶既具有水解能力，又可以专一地进行葡萄糖苷键的转移反应，是生产低聚异麦芽糖的必需酶制剂之一。
[0003]a转移葡萄糖苷酶在自然界中分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生物体内，在人类的糖原降解及动物、植物和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。a转移葡萄糖苷酶主要应用于生产頂0，而MO是人类肠道有益菌群双歧杆菌的增殖因子，摄入后不被人体消化吸收，也不易被大肠中的多数腐败细菌所利用，却能作为双歧杆菌的碳源而被利用，具有促进肠道有益菌群增值、润肠通便、调节血脂、低甜度、低热量等独特功效，尤其是在促进肠道有益菌群增值方面功效显著。作为一种功能性食品原料，IMO已被广泛用于各种食品的制造如乳制品、糖果类、焙烤食品等，居各种功能性低聚糖之首。[0004]目前工业上已经有以淀粉或麦芽糖为原料，通过酶法生产低聚异麦芽糖的工艺，但是已有的生产工艺转化率并不高。此外，虽然我国异麦芽糖产量很高，a转移葡萄糖苷酶的用量很大，但却一直没有实现工业化生产，该酶仍然依赖进口，这些因素都极大制约了国内低聚异麦芽糖的生产。因此，本领域亟需获得高活性的a转移葡萄糖苷酶及其相应的高产量的a转移葡萄糖苷酶生产菌株，以适应低聚异麦芽糖生产工艺的需要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种高效表达a-转移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株及其应用，本发明通过紫外诱变的方式对异源表达a-转移葡萄糖苷酶的黑曲霉工程菌株进行突变筛选，最终获得一株稳定性好、a-转移葡萄糖苷酶产量高的黑曲霉突变株，为a-转移葡萄糖苷酶的工业化生产奠定了基础，从而弥补现有技术的不足。
[0006]本发明一方面提供了一种a-转移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
[0007]所述a -转移葡萄糖苷酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。
[0008]本发明另一方面提供了一株高效表达上述a-转移葡萄糖苷酶的黑曲霉Atm61(Aspergillus niger Atm61)，已于2013年11月12日保藏于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏编号为 CGMCC N0.8469。
[0009]本发明所述黑曲霉Atm61在生产a -转移葡萄糖苷酶中的应用。
[0010]本发明通过紫外诱变的方法获得的突变菌株黑曲霉Atm61能高效重组表达a-转移葡萄糖苷酶，其发酵酶活高达14952U/mL，比出发菌提高了 58%。该突变菌株黑曲霉Atm61表达的a -转移葡萄糖苷酶，可广泛应用于低聚异麦芽糖浆的生产，能使转苷效率提高40%~50%以上，获得的异麦芽糖浆中异麦芽低聚糖的质量体积比高达90%，市场前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1:pGm-At重组质粒的遗传图谱；
[0012]图2:突变菌株黑曲霉Atm61发酵上清液SDS-PAGE电泳检测图，其中泳道I所示为蛋白标准分子量标记，由上至下为116.0kD, 66.2kD，45.0kD, 35.0kD, 25.0kD, 18.4kDa和14.4kD;泳道2所示为出发菌株黑曲霉At3发酵上清液中蛋白表达情况；泳道3所示为突变菌株黑曲霉Atm61发酵上清液中蛋白表达情况,箭头所指107kDa处的蛋白条带即为重组表达的a-转移葡萄糖苷酶；
[0013]图3: a -转移葡萄糖苷酶的相对酶活与pH的曲线图；
[0014]图4: a -转移葡萄糖苷酶的相对酶活与温度的曲线图。
【具体实施方式】
[0015]本发明用到了在遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)等参考书中所记载的技术。但是,本领域的普通技术人员可以选用已公开的技术来实施本发明实施例中记载的方案，而不限于实施例中所限定述的具体方法和试剂。
[0016]本发明中，核酸是按5'至3'方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。
[0017]本发明说明书中记载的低`聚异麦芽糖和异麦芽低聚糖可互换使用，都指选自下组的一种或多种糖:异麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、或潘糖。此外，应理解，所述的术语还包括上述糖的混合物。
[0018]本发明所记载的a转移葡萄糖苷酶，又称为a-D-葡萄糖苷水解酶，能切开麦芽糖和麦芽低聚糖分子结构中a -1, 4糖苷键，并能将游离出来的一个葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖分子或麦芽糖或麦芽三糖等分子中的a -1, 6位上，其转糖苷作用可将低聚糖中的a-l，4糖苷键转化成a-1，6糖苷键或其他形式的链接，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等。
[0019]基因指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
[0020]核酸包括DNA、RNA,单链或双链的，以及它们的化学修饰物；核酸与多核苷酸在本说明书中可以互换使用。
[0021]宿主菌株或宿主细胞是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码a转移葡萄糖苷酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。
[0022]丝状真菌指所有丝状形式的真菌亚门生物(参见INTRODUCTORY MYCOLOGY, 4thEd.(Alexopoulos,2007)和 AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OF THE FUNGI, IOthEd.(Kirk et al.，2008))。这些真菌的特征是带有由几丁质、纤维素和其他复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明所述的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝的延伸来完成的，碳代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌亲代细胞可以使，但不限于，曲霉属某种(Aspergillus sp.)(例如棒曲霉(A.clavatus)、烟曲霉(A.fumigatus)、泡盛曲霉(A.awamori)、黄曲霉(A.f Iavus)，土曲霉(A.terreus)和米曲霉(A.0ryzae))、青霉属某种(Penicillium sp.)(例如产黄青霉(P.chrysogenum))、新萨托菌属某种(Neosartorya sp.)(例如费希新萨托菌(N.fischeri))、粘帚霉菌属某种(Gliocladium sp.)(例如粉红粘帚霉(G.roseum))、木霉属某种(Trichoderma sp.)(例如里氏木霉(T.reesei)、绿色木霉(T.viride)、康宁木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum))、腐质霉属某种(Humicola sp.)(例如特异腐质霉(H.1nsolens)和灰腐质霉(H.grisea))、金孢霉属某种(Chrysosporium sp.)、镰刀菌属某种(Fusarium sp.)、脉孢霉属某种(Neurospora sp.)、肉座菌属某种(Hypocrea sp.)和裸孢壳属某种(Emericella sp.)的细胞。
[0023]本发明所涉及的曲霉或曲霉属某种是指以前或目前被分类为曲霉属的任何真菌属。
[0024]本发明中所述酶表达的分析方法和酶活测定方法如下:
[0025]为了评价a转移葡萄糖苷酶的表达，可以在蛋白水平或核酸水平进行分析。可以应用的分析方法包括Northern印迹、斑点印迹(DNA或RNA分析)、Southern印迹、放射自显影、RT-PCR(反转录酶聚 合酶链式反应)和含有适当标记的探针(基于核酸编码序列)进行的原位杂交。此外，基因表达可以通过免疫学方法，诸如细胞、组织切片的免疫组织化学染色或者组织培养基的免疫试验。例如通过Western印迹或ELISA来评估。这样的免疫试验可以用于定性地和定量地评 价a转移葡萄糖苷酶(诸如Atm61)的表达。此类方法的细节是本领域技术人员已知的，并且用于实施此类方法的许多试剂是可商业获得的。在一些实施方式中，a转移葡萄糖苷酶(诸如Atm61)的表达通过SDS-PAGE进行分析。
[0026]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。在本发明中，百分比为重量百分比，除非特别说明。
[0027]实施例1出发菌株黑曲霉At3的构建
[0028]按照制造商的说明书，使用真菌基因组DNA提取试剂盒(Omega)从土曲霉(Aspergillus terreus)过夜培养物中提取基因组DNA。根据NCBI上编号为XM_001210809的a-转移葡萄糖苷酶基因序列设计PCR引物。用于克隆土曲霉中的At3基因的正向引物At3-F序列为 5’-CCATTACGTAATGGITGACATCACCGACCTTCTGG，反向引物 At3-R序列为 5’-CTGCTCTAGACTACCACTCCAGGACCCAGTCCTT，将该基因用 Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)从土曲霉基因组DNA中扩增出来。
[0029]使用凝胶纯化试剂盒(Fermentas)将上述PCR产物纯化。用限制性内切酶SnaBI和XbaI (Fermentas)对纯化了的PCR产物进行酶切；同时，用限制性内切酶SnaBI和XbaI对质粒pGm进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化,并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5 a大肠杆菌(Transgen),用氨节青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitoogen)。测序结果显示，本发明PCR扩增得到的a-转移葡萄糖苷酶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，编码氨基酸序列为 SEQ ID NO:1。[0030]使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，将所得质粒命名为PGm-At (质粒图谱见图1)。
[0031]将上述纯化得到的质粒pGm-At通过原生质体转化法转入黑曲霉宿主菌Gl中，得到25个黑曲霉转化子(分别命名为Atl，At2，At3，……，At25)。将所述25个转化子的孢子悬浮液分别接种于20mL TSB发酵培养基中，在30°C，200rpm的条件下培养5d ;将所得发酵液用8层纱布过滤；滤液在14000g条件下离心lOmin，收集上清液；将上清液在浓度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳检测分析，结果显示本发明构建得到的转化子Atl、At3、At4、At5、At6、At9、At 10、At 13、At 14、At 15、At 18、Atl9、At20、At21、At23、At24、At25 在 107kD处都有明显的蛋白条带，与本发明所述a-转移葡萄糖苷酶理论分子量一致，从而说明上述阳性转化子均能重组表达a-转移葡萄糖苷酶；挑选其中a-转移葡萄糖苷酶蛋白表达量较高的阳性转化子At3、At5、AtlO、Atl5、At20、At23，分别测定其发酵上清液的酶活，结果显示，黑曲霉At3的发酵上清液酶活最高，达9413U/mL。
[0032]a -转移葡萄糖苷酶酶活力测定方法
[0033]采用中华人民共和国轻工行业标准QB2525-2001，将a转移葡萄糖苷酶作用于底物a-甲基-D-葡萄糖苷生成葡萄糖，所生成的葡萄糖与含有葡萄糖氧化酶、过氧化酶的4-氨基安替比林(4-Aminoantipyrin)和酹试剂进行显色反应来定量测定。
[0034]具体测定方法包括:吸取2% a -甲基-D-葡萄糖苷底物溶液Iml和0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)lml加入试管(15mmX150mm)内，在(50±0.5) °C的恒温水浴箱中保温lOmin。加入样品酶液0.5ml，混匀，于(50±0.5)°C的恒温水浴箱中准确保温60min后，将试管转移至沸水浴中加热5min,然后用流水快速冷却。冷却后,吸此溶液0.1ml到试管中，并加入4-氨基安替比林-苯酚显色剂3ml，混匀。将此试管放入(40±0.5) °C的恒温水浴中保温20min，测定500nm处的吸光度，根据吸光度值计算a转移葡萄糖苷酶的酶活力(U/ml),即在此试验条件下,在反应混合物2.5ml中，60min产生I y g葡萄糖所需的酶量定义为一个a转移葡萄糖苷酶活力单位。
[0035]TSB 发酵培养基:12g NaNO3,0.5g KCl, 1.5g KH2PO4, 2.05g MgSO4 ? 7H20，3.5gNaH2PO4 ? H20，45g胰蛋白大豆肉汤，70g柠檬酸钠，Ig吐温80，ImL痕量元素(见下)，加入dlH20至终体积700mL，高压蒸气灭菌后加入300mL用0.22 y m的微孔滤膜过滤除菌的40%
麦芽糖。
[0036]痕量兀素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4 ? 7H20,8.8g ZnSO4 ? 7H20,0.4gCuSO4 *5H20,0.15g MnSO4 *4H20,0.1g Na2B4O7 ? IOH2O, 50mg (NH4) 6Mo7024 ? 4H20，0.2mL 浓 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 ii m的微孔滤膜过滤除菌。
[0037]实施例2:紫外诱变与筛选
[0038]2.1紫外诱变方法
[0039](I)将实施例1构建得到的黑曲霉At3作为出发菌株，将其接种到CMA斜面上活化，在37°C下培养4d;
[0040](2)用3ml无菌的0.l%Tween-80洗涤At3新鲜斜面制得孢子悬液，吸取IOul置于血球计数板上计数，根据计数结果稀释孢子悬液至孢子数目约为IO6个/ml左右；
[0041](3)吸取51111稀释后的孢子悬液置于9cm培养皿中，在紫外灯30w、照射距离22cm、照射时间4min的条件下进行紫外诱变；
[0042](4)紫外照射完毕后，将诱变后的孢子悬液稀释100倍，吸取稀释后的孢子悬液涂布CMA平板，每个CMA平板涂IOOul，约涂100个平板左右，在37°C下避光培养40h ；
[0043](5)培养40h后，挑取平板上长出的个体形态小、菌丝浓密且紧实的突变菌落，于另一 CMA平板上进行划线纯化，划线平板在37°C下培养40h ； [0044](5)挑出约100个划线平板上长出的单菌落，接种至CMA斜面，在37°C下培养4天以上；
[0045]CMA平板:20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，Ig蛋白胨，15g琼脂，加入dlH20至终体积1000mL,高压蒸气灭菌。
[0046]2.2突变菌株的筛选
[0047]1、初筛
[0048]根据CMA斜面上诱变菌株的生长情况，挑选长势相近的诱变菌株分批进行发酵表达，同时以出发菌株At3作对照。发酵采用一步摇瓶发酵法:将黑曲霉诱变菌株的孢子悬浮液分别接种于20mL TSB发酵培养基中，每个菌株接I瓶，在30°C，200rpm的条件下培养5d ；将所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000 Xg条件下离心lOmin，收集上清液；将上清液在浓度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳，通过观察比较a转移葡萄糖苷酶重组蛋白条带的表达量，挑选出16株比出发菌株At3表达效果好的突变菌株。
[0049]2、复筛
[0050]将挑选出的16株突变菌株再次进行发酵表达，同时以出发菌株At3作对照。发酵采用两步摇瓶发酵法:将黑曲霉诱变菌株的孢子悬浮液接种于20ml CLS发酵培养基中，在300C，200rpm的条件下培养48h ;然后按10%接种量，吸取2mlCSL培养液菌体接种于20mLTSB发酵培养基中，在30°C，200rpm的条件下培养5d ;将所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在 14000 Xg 条件下离心 IOmin,收集上清液；用 Econo-PaclODG Columns (BO1-RAD)对上清液进行脱盐除糖处理；然后将其进行12%SDS-PAGE检测分析并测定酶活；最终挑选出一株a转移葡萄糖苷酶表达量最高的突变菌株，命名为黑曲霉Atm61 (Aspergillus nigerAtm61)，并于2013年11月12日保藏于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏编号为CGMCC N0.8469。
[0051]所用到额CSL发酵培养基的一种配比如下:100g玉米浆，IgNaH2PO4 ? H20,0.5gMgSO4, 100g麦芽糖，IOg葡萄糖，50g果糖，加入dlH20至900mL，用固体NaOH颗粒调pH5.8后定容至1L，高压蒸气灭菌。
[0052]实施例4:突变菌株黑曲霉Atm61的摇瓶发酵验证
[0053]将突变菌株黑曲霉Atm61 (CGMCC N0.8469)和出发菌株黑曲霉At3同时接种到CMA平板上培养4-5d，取其各自孢子悬浮液分别接种于20ml CLS发酵培养基中，在30°C，200rpm的条件下培养48h ;然后按10%接种量，吸取2ml CSL培养液菌体分别接种于20mLTSB发酵培养基中，在30°C，200rpm的条件下培养5d，分别收集黑曲霉Atm61和黑曲霉At3的发酵上清液；用Econo-PaclODG Columns (BO1-RAD)对上清液进行脱盐除糖处理；然后将其进行12%SDS-PAGE电泳检测分析，结果如图2所示，两株菌在107kDa处均有明显的蛋白条带，说明本发明获得的突变菌株黑曲霉Atm61也能重组表达a转移葡萄糖苷酶；酶活测定结果显示，出发菌黑曲霉At3的发酵酶活为9492U/mL，而突变株黑曲霉Atm61的发酵酶活高达14952U/mL，比出发菌提高了 58%。
[0054]实施例4:酶学性质分析
[0055]用pH值为 2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0、11.0 的缓冲液稀释实施例 3
所述出发菌和突变菌的发酵上清液，分别测定其酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做作用PH-相对酶活曲线。结果如图3所示，本发明的突变株黑曲霉Atm61表达的a-转移葡萄糖苷酶与出发菌相比，作用PH-相对酶活曲线并未发生变化，最适作用pH值均为5.0。
[0056]分别在30°c、40°c、5(rc、6(rc、7(rc、8(rc、9(rc，PH5.0 条件下测定实施例 3 所述出发菌和突变菌发酵上清液酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图4所示，本发明的突变株黑曲霉Atm61表达的a-转移葡萄糖苷酶与出发菌相比，作用温度-相对酶活曲线并未发生变化，最适作用温度均为50°C。
[0057]上述结果表明，本发明获得的突变株黑曲霉Atm61的突变并未引起其表达的a-转移葡萄糖苷酶酶学性质发生失活突变。
[0058]实施例5 a -转移葡萄糖苷酶在生产低聚异麦芽糖浆中的应用
[0059]工业生产低聚异麦芽糖浆，以淀粉为原料，加水制成30%粉浆，在pH值为6.0、温度为90~120°C条件下，经耐热性a淀粉酶液化后，在pH值为5.0、温度为60°C的条件下，用@淀粉酶、普鲁兰酶和真菌a淀粉酶同时作用，转化成麦芽糖；然后加入本发明所述突变株黑曲霉Atm61表达的a -转移葡萄糖苷酶进行转苷反应，生成异麦芽糖、异麦芽三糖、四糖及五糖等含a-1，6键的分支低聚糖与潘糖。分析结果表明，本发明所述a-转移葡萄糖苷酶可使其转化率明显提高40%~50%以上。
`[0060]将上述转苷反应的产物经活性炭脱色、离子交换树脂脱盐，浓缩到固形物质量体积比为75%，即得到普通异麦芽糖浆，其中异麦芽低聚糖的质量体积比为40%~50%，葡萄糖的质量体积比为40%;再将异麦芽糖浆中的葡萄糖用酵母发酵或膜过滤除去，便可得到含异麦芽低聚糖的质量体积比为90%的产品。
[0061]上述结果表明本发明所述突变菌株黑曲霉Atm61表达的a-转移葡萄糖苷酶，可广泛应用于低聚异麦芽糖浆的生产。
【权利要求】
1.一种a-转移葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的a-转移葡萄糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.如权利要求1所述的a-转移葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的a-转移葡萄糖苷酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
3.一株黑曲霉，其特征在于，所述的黑曲霉的保藏编号为CGMCC N0.8469。
4.权利 要求3所述的黑曲霉在生产权利要求1所述的a-转移葡萄糖苷酶中的应用。
【文档编号】C12N1/14GK103695383SQ201310692982
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】王华明, 訾祯祯 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司, 中国科学院天津工业生物技术研究所