重组的人乳头瘤病毒16型l1蛋白及其用途
【专利摘要】本发明为重组的人乳头瘤病毒16型L1蛋白及其用途，提供一种新的编码重组的HPV16L1蛋白的多核苷酸基因片段、包含该基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该基因片段翻译表达的HPV16L1蛋白五聚体和由该五聚体组成的抗HPV16型感染的宫颈癌疫苗。
【专利说明】重组的人乳头瘤病毒16型L1蛋白及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人类乳头状瘤病毒感染的预防和/或治疗。更具体而言，本发明涉及 一种重组的人乳头瘤病毒16型L1蛋白，及由其组成的五聚体，含该蛋白的疫苗及其在预防 HPV16型病毒感染，特别是在预防HPV16型病毒感染引起的宫颈癌疾病中的用途。
【背景技术】
[0002] 人类乳头状瘤病毒（Human Papillomavirus,简称HPV)是通过密切接触而传播的 DNA病毒。在人体组织中，HPV主要感染皮肤和黏膜组织。HPV可分为高危险型和低危险 型两种，长期持续感染高危型可以致癌，如宫颈癌，危害生命。低危型HPV可导致生殖器病 变，如尖锐湿疣，影响生活质量。宫颈癌是女性第二大恶性肿瘤，每年全球的发病大概在54 万（2013年），约有24万例死亡，幸运的是，宫颈癌是唯一研制出疫苗的癌症。2006年 6月8日，美国食品与药品管理局（FDA)正式批准美国Merck公司（即默沙东公司）生产 的Gardasil HPV预防性疫苗上市；它是由酿酒酵母表达并纯化的HPV16/18/6/11 LI VLP四 价宫颈癌预防性疫苗，被批准用于预防6~ 26岁女孩和妇女HPV16、18、6、11型感染所引起 的宫颈癌、癌前病变和生殖器疣，这是FDA通过的世界上第一个肿瘤疫苗（Villa，Costa et al. 2005，Villa，Ault et al. 2006，Bryan 2007，Olsson，Villa et al. 2007，Goldstone and Vuocolo 2012)。随后英国葛兰素史克（GSK)公司生产的商品名为Cervarix的HPV预 防性疫苗也成功上市，它是由来源于昆虫表达系统的HPV16/18 LI VLP二价宫颈癌预防性 疫苗。但这两种预防性疫苗价格昂贵，极大限制了在发展中国家和落后地区的使用，因此 开发一种低成本的高效价HPV疫苗就显得尤为重要（Jansen and Shaw 2004，Buonaguro, Tornesello et al. 2009, Campo and Roden 2010, Frazer, Leggatt et al. 2011, Hariri, Dunne et al. 2011, Lehtinen and Dillner 2013, Shaw 2013) 〇
[0003] HPV属乳头多瘤空泡病毒科（Papovaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。 病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为7. 2?8kb，具有8个开放框。基因组按功能的不同 可以分为三个区域：早期区（E)，约4. 5kb，编码E1、E2、E4?E7共6个与病毒复制，转录及 转化有关的非结构蛋白；晚期区（L)，约2. 5kb，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2; 长调控区（LCR)，位于L区末端与E区起始端之间，长约800?900bp，不编码任何蛋白，含 DNA复制、表达调控元件。
[0004] HPV病毒颗粒直径为55?60nm，核衣壳呈20面体对称，由72个主要衣壳蛋白L1 的五聚体及次要衣壳蛋白L2组成。大量研究证实，HPV L1蛋白是HPV疫苗的主要靶蛋白。在 多种表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构与天然病毒颗粒 相似的类病毒颗粒（Virus-LlkeParticle，VLP)。重组HPV L1-VLP疫苗已经成功上市并用于 预防HPV感染及由此导致的宫颈癌、尖锐湿疣等疾病，并充分证明了 L1-VLP具有与野生同 型病毒相同的抗原性和免疫原性。从组成VLP的三级结构看，其抗原决定簇均分布于组成 VLP 的基本结构单兀五聚体的表面（Xiaojiang S. Chen, Robert L. Garcea, Ilya Goldberg ,Gregory Casini and Stephen C. (2000) . HarrisonStructure of Small Virus-like Particles Assembled from the LI Protein of Human Papillomavirus 16. Molecular Cell, Vol. 5, 557 - 567. Brooke Bishop, Jhimli Dasgupta, Michael Klein, Robert L. Garcea, Neil D. Christensen, Rui Zhaoand Xiaojiang S. Chen. (2007). Crystal Structures of Four Types of Human Papillomavirus LI Capsid Proteins. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 282, NO. 43, pp. 31803 - 31811)，说明 HPVL1-VLP 的抗原性和免疫原性来 源于或取决于L1组成的五聚体。因此，重组L1蛋白五聚体与VLP -样具备完整的抗原表 位，也可以作为抗原用来制备疫苗。
[0005] HPV疫苗研制的关键是能够大量高效制备HPV L1蛋白。目前较为常用的表达系统 可以分为真核表达系统及原核表达系统。常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆 状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少， 能自发的形成VLP，往往只需进行简单的纯化即可获得VLP。但是由于真核表达系统的表达 量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。原核表达系统中利用大肠杆菌表 达系统表达HPVL1蛋白已有报道。但是由于大肠杆菌所表达的HPVL1蛋白大多失去其天 然构象，不能产生针对HPV的保护抗体。或者上述蛋白虽然通过包含体纯化，复性等步骤也 可得到HPV VLP，但是在复性过程中蛋白损失量大，得率低，难以在大规模生产上应用。HPV L1全长序列蛋白虽然也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达，溶解于菌体的裂解上 清中，但是表达量较低，而且上清中杂蛋白种类多且量大，要从中纯化出目的蛋白难度相当 大，依然无法应用于大规模生产。
[0006] 因此，本领域仍然需要成本低、纯度高、产量高、效果好的HPV L1蛋白生产技术和 大规模工业化生产治疗宫颈癌疫苗的新方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种新的HPV16L1蛋白，及由其组成的五聚体蛋白颗粒及含 该五聚体蛋白颗粒的疫苗。
[0008] 本发明涉及提供一种新的编码重组的HPV16 L1蛋白的多核苷酸基因片段、包含该 基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该基因片段翻译表达的HPV16 L1蛋白五聚 体和由该五聚体组成的抗HPV16型感染的疫苗。
[0009] 本发明公开了一种重组的HPV16 L1蛋白的氨基酸序列，所述蛋白的氨基酸序列在 N端8-15个氨基酸全部或任意部分被2-10个氨基酸序列所取代，其氨基酸序列由G、S、A 三者的任一组合方式；H4结构域被2-10个氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的 任一组合方式。
[0010] 本发明涉及的HPV16 L1蛋白，进一步是其氨基酸序列C端截短0个、1个、2个至 21个氨基酸。
[0011] 本发明所述的HPV16 L1蛋白，优选的被其氨基酸序列N端前8-15个氨基酸被 GSGGG、ASASG或GSGAG取代，H4结构域优选的被GGGSG或GAGAS取代。
[0012] 如实施例所述的HPV16 L1蛋白，优选其氨基酸序列在N端前8、10、12或15个氨基 酸优选被GSGGG或ASASG氨基酸序列取代。C端优选截短10-21个氨基酸，更优选截短10 个、21个氨基酸。
[0013] 如实施例所述的HPV16 L1蛋白，其序列包含序列SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8 或 SEQ ID NO :10。
[0014] 本发明公开一种编码蛋白的多核苷酸序列。本发明公开一种包含多核苷酸序列的 基因的表达载体。本发明公开一种包含表达载体的细胞。
[0015] 本发明公开一种HPV16 L1蛋白五聚体，该蛋白五聚体由五个HPV16 L1蛋白单体形 成。
[0016] 本发明公开一种HPV疫苗，该疫苗包括HPV16 L1蛋白五聚体和药用佐剂。
[0017] 本发明公开一种HPV疫苗的制备方法，该方法为： A. 克隆或合成重组HPV16 L1蛋白的基因片段； B. 在大肠杆菌或酵母表达系统中表达重组的HPV16 L1蛋白； C. 纯化由HPV16 L1蛋白组成的五聚体； D. HPV16 L1蛋白五聚体加入药用佐剂制成疫苗。
[0018] 上述方法中步骤C的纯化优选利用亲和层析色谱纯化HPV16 L1融合标签蛋白。
[0019] 本发明公开HPV疫苗在制备预防和/或治疗包括HPV16感染及导致疾病的药物中 的应用。
[0020] 本发明第一方面提供一种编码重组HPV16 L1蛋白的多核苷酸基因片段。
[0021] 本发明第二方面提供了一种构建的表达载体，其包含本发明第一方面的编码重组 HPV16 L1蛋白的多核苷酸基因片段。所述载体适合驱动异源DNA在细菌、昆虫或哺乳动 物细胞中翻译表达HPV16 L1蛋白。在一个实施方案中，所述表达载体优选pGEX-6p-l或 PGEX-4T-2。
[0022] 本发明的第三方面提供了一种构建的工程菌细胞，该细胞包含本发明第一方面的 多核苷酸基因片段，或第二方面的表达载体。所述的工程菌宿主细胞可以是细菌细胞，例如 大肠杆菌，可以是真核细胞，例如酵母细胞，或者是昆虫细胞。
[0023] 本发明第四方面提供了一种药用组合物，其包含本发明第一方面的多核苷酸基因 片段，或第二方面构建的表达载体或第三方面的工程菌细胞以及表达产物HPV16 L1五聚体 蛋白。
[0024] 本发明同时提供了制备上述编码重组HPV16 L1蛋白的多核苷酸序列、表达载体构 建、工程菌细胞转化和药用组合物的方法。
[0025] 本发明获得HPV16 L1蛋白的方法，其包括在表达系统中表达重组的HPV16 L1蛋白 及其五聚体，然后将含有该重组蛋白的裂解上清进行纯化处理。具体获得HPV16 L1蛋白五 聚体的方法包括： 1.从临床样本中克隆或人工合成编码HPV16 L1全长蛋白基因或截短蛋白基因的片 段。
[0026] 2.在大肠杆菌或酵母表达系统中表达重组的L1蛋白。
[0027] 3.纯化HPV16 L1重组蛋白。
[0028] 在一个实施方案中，获得重组HPV16 L1蛋白的优选方法包括： 1. N端1-15个氨基酸全部或任意部分被GSGGG取代、H4结构域被GGGSG序列取代的 HPV16 L1重组蛋白。
[0029] 2.在大肠杆菌或酵母表达系统中表达重组的L1蛋白。
[0030] 3.纯化HPV16 L1重组蛋白。
[0031 ] 在优选的实施例1方案中N端截短8个氨基酸被GSGGG取代，H4结构域被GGGSG 序列取代，同时C端截短21个氨基酸，SEQ ID NO :2。
[0032] 在一个优选的实施例2方案中N端截短8个氨基酸被GSGGG取代，H4结构域被 GGGSG序列取代，同时C端截短10个氨基酸，SEQ ID NO :4。
[0033] 在一个优选的实施例3方案中N端截短15个氨基酸被GSGAG取代，H4结构域被 GAGSG序列取代，同时C端截短10个氨基酸，SEQ ID NO :6。
[0034] 在一个优选的实施例4方案中N端截短15个氨基酸被ASASG取代，H4结构域被 GGGSG序列取代，同时C端截短21个氨基酸，SEQ ID NO :8。
[0035] 在一个优选的实施例5方案中N端截短8个氨基酸被GSGGG取代，H4结构域被 GGGSG序列取代，同时C端保留不截短，SEQ ID NO :10。
[0036] 在对比的实施例6方案中N端前8个氨基酸被GSGGG取代，H4结构域不取代，C端 保留不截短。
[0037] 本发明另提供了本发明药用组合物在制备预防或治疗HPV16型感染及导致疾病 药物中的应用。
[0038] 本发明还涉及一种预防宫颈癌或HPV感染的疫苗，其包含本发明重组的HPV16 L1 五聚体，或者由五聚体组成的多聚体，包括1、2、3、4、5......200个五聚体。优选该疫苗还 包含至少一种选自HPV16 L1五聚体，HPV16 L1五聚体HPV18 L1五聚体，HPV31 L1五聚体， HPV33 L1五聚体，HPV45 L1五聚体，HPV52 L1五聚体，HPV58 L1五聚体，以及由上述五聚体 组成的多聚体。该疫苗通常还包含疫苗用赋形剂或载体。
[0039] 优选地，所述疫苗每剂含有本发明重组的HPV16 L1五聚体蛋白的量为 1 μ g-200 μ g,优选5 μ g_50 μ g。所述疫苗含有本发明重组的HPV16 L1五聚体与HPV18 L1 按照0. 5-2 ：1比例组成的疫苗，重组的HPV16 L1与HPV31 L1按照0. 5-2 ：1比例组成的疫 苗，重组的HPV16 L1与HPV33 L1按照0. 5-2 ：1比例组成的疫苗，重组的HPV16 L1与HPV45 L1按照0. 5-2 ：1比例组成的疫苗，重组的HPV16 L1与HPV52 L1按照0. 5-2 ：1比例组成的 疫苗，重组的HPV16 L1与HPV58 L1按照0. 5-2 ：1比例组成的疫苗，以及由重组的HPV16 L1五聚体与上述各型HPV L1五聚体组成的二价、三价、四价、五价、六价、七价疫苗或在此基 础上进一步组合HPV6和11形成的九价疫苗。
[0040] 本发明还涉及一种制备用于预防宫颈癌或HPV感染疫苗的方法，其包含本发明重 组的HPV16 L1五聚体，或者由五聚体组成的多聚体与任选的一种或多种选自HPV16，16，18， 31，33，45，52，和58的HPV型别的五聚体及疫苗用载体或者赋形剂混合。
[0041] 本发明进一步涉及包含本发明重组的HPV16L1五聚体，或者由五聚体组成的多聚 体在制备用于预防宫颈癌或HPV16感染疫苗中的用途。
[0042] 本发明中相关术语的说明及解释 根据本发明，术语"大肠杆菌表达系统"是指由大肠杆菌(菌株）与表达载体组成，其中 大肠杆菌(菌株）来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：GI698，ER2566，BL21 (DE3)， B834 (DE3)，BLR (DE3)等。
[0043] 根据本发明，术语"载体"一词指的是，可将某编码蛋白的多核苷酸插入其中并使 蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带 的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒，噬菌体，柯斯质粒等。
[0044] 根据本发明，术语"疫苗用赋形剂或载体"是指选自一种或多种，包括但不限于：pH 调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液， 表面活性剂包括阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。举例但不限于：Tween-80。佐剂 举例但不限于氢氧化铝，磷酸铝、无定型羟基磷酸硫酸铝，氟氏完全佐剂。离子强度增强剂 举例但不限于氯化钠。
[0045] 根据本发明，术语"色谱层析"包括但不限于：离子交换色谱、疏水相互作用色谱、 吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻）层析、亲和层析法。
[0046] 根据本发明，术语"HPV16 LI H4结构域"是指HPV16 LI DNA序列中"FGLQPPP GGTLEDTYRF VTSQAIACQK HTPPAP"，在Genebank登录号为ACN91182的L1序列中第404位氨基酸至 436位，或其它HPV16 L1序列中与之对应的氨基酸位置。
[0047] 根据本发明，在本发明获得的重组HPV16 L1蛋白的方法中，缓冲液是指可在一定 范围内维持pH值稳定的溶液，包括但不限于，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液， MOPS缓冲液等等。
[0048] 根据本发明，所述原核宿主细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、 超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现； 根据本发明，在本发明获得的重组HPV16 L1蛋白的方法中，所用的盐包括但不限于是 中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐,硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特 别是似(：1、1((：1、順4(：1、（順4)2504中的一种或几种。优选似(：1。所用的还原剂包括但不 限于DTT，2 -巯基乙醇。所用量包括但不限于10mM-100mM。
[0049] 根据本发明，所述的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于注射或鼻腔或 口腔吸入或者阴道给药，优选注射剂。
[0050] 根据本发明，术语"价"是指组成疫苗的组分所包含的基因型的数量。举例来说 HPV16和18型抗原组成的疫苗称为"二价"疫苗。
[0051] 本发明人经研究发现，经过对HPV16 L1蛋白N端、C端和H4区域的基因重组，再 利用大肠杆菌表达系统进行表达即可获得大量的重组GST-HPV16 L1五聚体融合蛋白，该 GST-HPV16 L1五聚体蛋白经亲和层析纯化后可得到高产率的HPV16 L1五聚体蛋白，纯度至 少85%以上。进一步纯化后的HPV16 L1五聚体蛋白可达到98%以上的纯度并可诱导针对 HPV16保护性抗体。本发明基于以上发明现已完成，为大规模工业化生产预防宫颈癌的疫 苗提供了 一种新方法。
[0052] 本发明中在N端增加 GSGGG或GSGAG，并且与GST蛋白相融合，可大大提高L1蛋白 的可溶性，以及提高酶切效率，降低纯化成本，同时利用蛋白酶酶解方法切除GST蛋白，去 除了外源杂质的引入；用GSGGG或GAGAS取代H4结构域，可以阻止L1五聚体蛋白进一步聚 合，从而得到均一、稳定的五聚体蛋白，例如通过实施例12的实验，发现不同氨基酸序列组 成的蛋白产物稳定性不同。其中序列H4结构域经过取代的蛋白产物与H4结构域未经取代 的蛋白产物相比更稳定；C端截断氨基酸能够有效避免C端降解、减少由于蛋白降解而导致 的产物不纯，从而影响五聚体蛋白疫苗的稳定性。
[0053] 本发明序列对H4结构域改造所得的HPV16 L1蛋白只能形成五聚体，而且此五聚 体具有良好的免疫原性，可以诱导高滴度的针对HPV16的中和抗体，预防HPV16对人体的感 染，是一种良好的疫苗形式。此外，本发明中采用的重组HPV16 L1蛋白在保留全长HPV16 L1蛋白的抗原性及五聚体颗粒组装能力的同时，易于在真核表达系统和原核表达系统中表 达，增加蛋白的溶解性、提高产量、降低生产成本，可应用于大规模工业化生产。
[0054] 在参考下列详述和附图后，本发明的这些和其它方面的有益效果将是显然的。此 处公开的所有参考文献在此均完整引用作为参考。
[0055]
【专利附图】
【附图说明】
[0056] 图1实施例1制备的HPV16 L1五聚体透射电镜观察（100,000倍）结果；结果显 示，视野中可见直径为12nm左右的五聚体，颗粒大小与理论大小相符，均匀一致。
[0057] 图2-A按照实施例1制备的HPV16 L1五聚体的动态光散射观测结果，结果显示五 聚体的粒径与粒度分布图。
[0058] 图2-B按照实施例6制备的五聚体的动态光散射观测结果，结果显示五聚体的粒 径与粒度分布图。
[0059] 图3实施例1 HPV16 L1五聚体蛋白的高压液相分子筛色谱图，图中显示经高度纯 化的五聚体蛋白纯度。
[0060] 图4实施例制备的HPV16 L1五聚体疫苗接种小鼠后，在第二次加强免疫3周后， 检测中和抗体的平均滴度水平。
[0061] 下面结合实施例对本发明进一步举例描述。这些实施例是非限制性的。
[0062] 实施例1 :具有HPV16 L1序列2的工程菌的构建 1、HPV16 L1基因全长由金唯智生物科技有限公司（GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQ ID NO : 1。
[0063] 2、含有SEQ ID N0 :1基因片段做PCR反应的模板。以正向引物序列：5' - CGCGGA TCCGGA AA AGAAGATCCCCTTAAAAAA -3' ；在H4结构的5'端引入限制性内切酶AccIII位点， AccIII位点序列为TCCGGA。下游包含Xhol内切酶位点，反向引物序列：5' -GCTCTCCTCGAG TTA TAATGTAAAT TTTGGTTTGG C -3'，其5'端引入限制性内切酶Xhol位点，Xhol位点序列 为CTCGAG。经PCR反应扩增得到HPV16B。
[0064] 3、含有SEQ IDN0 :1基因片段做PCR反应的模板。以含有引入的限制性内切酶BamH I 位点，BamH I 位点序列为 GGATCC, if 向引物序列:5' -CGCGGAGGATCC GGA GGA GGA GCCACT GTCTACTTGCCTCCT-3';在H4结构的3'端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列 为 TCCGGA,反向引物序列：GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC ATTCCAGTCC TCCAAAATAG ;经 PCR 反应 扩增扩增得到HPV16A。
[0065] 4、HPV16A片段与HPV16B共同用限制性内切酶AccIII酶切，形成特异粘性末端， 使用T4 DNA连接酶连接HPV16A和HPV16B片段，使之形成一个删除了 H4结构域的、原H4结 构域被编码连接多肽GGGSG的核苷碱基序列取代的HPV16C。
[0066] 5、表达质粒pGEX-4T-2用BamH I和Xhol酶切消化，再用T4连接酶连接 HPV16c和表达质粒。BamH I/Xhol酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆 PGEX-4T-2-HPV16C。利用M13(+V(_)引物，测得质粒中插入的目的核苷酸序列正确，其编 码的氨基酸序列为SEQ ID N0 :2。
[0067] 6、连接产物经电转化或CaC12法将重组质粒转化至大肠杆菌中，优选转化大肠杆 菌BL21宿主细胞。将转化的BL21细胞涂于含有氨苄青霉素的LB平板培养基上，经37°C培 养，挑取单克隆菌落接种于LB液体培养基中37°C培养12小时，从中取lml菌液制备甘油管 菌种于-70°C保存。
[0068] 上述各步骤中PCR反应体系包含20μ g DNA模板、lx PCR缓冲液、正向和反向特 异引物(浓度均为〇. 2μ M )、1.5mM镁离子、1.0单位的TaqDNA聚合酶；反应条件为：摄氏 95 °C变性5分钟，经36个PCR循环放大，每一循环为94°C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 2分钟， 反应产物在72°C下温育10分钟，然后停止反应。
[0069] 实施例2 :具有HPV16 L1序列4的工程菌的构建 UHPV16L1基因全长的目标基因片断购自北京安贞医院妇科门诊含有野生型HPV16病 毒的临床细胞样本废弃物，其核苷酸序列为SEQ ID N0 :3。
[0070] 2、含有SEQ ID NO :3基因片段做PCR反应的模板。以正向引物序列：5' - CGCGGATCCGGA AA AGAAGATCCCCTTAAAAAA -3 ' ；在 H4 结构的 5 ' 端引入限制性内切酶 AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA。下游包含Xhol内切酶位点，反向引物序列： 5' -GCTCTCCTCGAG TTA AGAGGTAGAT GAGGTGGTGG G -3'，其 5' 端引入限制性内切酶 Xhol 位 点，Xhol位点序列为CTCGAG。经PCR反应，扩增得到HPV16B。
[0071] 3、含有SEQ ID N0:3基因片段做PCR反应的模板。以含有引入的限制性内切酶 BamH I 位点正向引物序列：5' -CGCGGAGGATCC GGA GGA GGA GCCACT GTCTACTTGC CTCCT -3' ； 在H4结构的3'端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA，反向引物序 列：GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC ATTCCAGTCC TCCAAAATAG ;经 PCR 反应，扩增得到 HPV16A。
[0072] 4、HPV16A片段与HPV16B共同用限制性内切酶AccIII酶切，形成特异粘性末端， 使用T4 DNA连接酶连接HPV16A和HPV16B片段，使之形成一个删除了 H4结构域的、原H4结 构域被编码连接多肽GGGSG的核苷碱基序列取代的HPV16C。
[0073] 5、表达质粒pGEX-4T-2用BamH I和Xhol酶切消化，再用T4连接酶连接 HPV16c和表达质粒。BamH I/Xhol酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆 PGEX-4T-2-HPV16C。利用M13(+V(_)引物，测得质粒中插入的目的核苷酸序列正确，其编 码的氨基酸序列为SEQ ID N0 :4。
[0074] 6、连接产物经电转化或CaC12法将重组质粒转化至大肠杆菌中，优选转化大肠杆 菌BL21宿主细胞。将转化的BL21细胞涂于含有氨苄青霉素的LB平板培养基上，经37°C培 养，挑取单克隆菌落接种于LB液体培养基中37°C培养12小时，从中取lml菌液制备甘油管 菌种于-70°C保存。
[0075] 上述各步骤中PCR反应体系包含20μ g DNA模板、lx PCR缓冲液、正向和反向特 异引物(浓度均为〇. 2μ M )、1.5mM镁离子、1.0单位的TaqDNA聚合酶；反应条件为：摄氏 95 °C变性5分钟，经36个PCR循环放大，每一循环为94°C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 2分钟， 反应产物在72°C下温育10分钟，然后停止反应。
[0076] 实施例3 :具有HPV16 L1序列6的工程菌的构建 1、HPV16 L1基因全长由金唯智生物科技有限公司（GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQ ID N0 :5。
[0077] 2、含有SEQ ID NO :3基因片段做PCR反应的模板。以正向引物序列：5' - CGCGGATCCGGA AA AGAAGATCCCCTTAAAAAA-3' ；在 H4 结构的 5' 端引入限制性内切酶 AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA。下游包含Xhol内切酶位点，反向引物序列： 5' -GCTCTCCTCGAG TTA AGAGGTAGAT GAGGTGGTGG G-3'，其 5' 端引入限制性内切酶 Xhol 位 点，Xhol位点序列为CTCGAG。PCR反应，扩增得到HPV16B。
[0078] 3、含有SEQ ID N0:3基因片段做PCR反应的模板。以含有引入的限制性内切酶 BamH I 位点正向引物序列：5' -CGCGGAGGATCC GGA GCC GGA GTCCCAGTATCTAAGGTTGTA-3' ；在 H4结构的3'端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA,反向引物序列：5，-GCTCTCTCCGGA TCC GGC TCC ATTCCAGTCC TCCAAAATAG -3' ；经 PCR 反应，扩增得到 HPV16A。
[0079] 4、HPV16A片段与HPV16B共同用限制性内切酶AccIII酶切，形成特异粘性末端， 使用T4 DNA连接酶连接HPV16A和HPV16B片段，使之形成一个删除了 H4结构域的、原来的 H4结构域被编码连接多肽GGGSG的核苷碱基序列取代的HPV16C。
[0080] 5、表达质粒pGEX-4T-2用BamH I和Xhol酶切消化，再用T4连接酶连接 HPV16c和表达质粒。BamH I/Xhol酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆 PGEX-4T-2-HPV16C。利用M13(+V(_)引物，测得质粒中插入的目的核苷酸序列正确，其编 码的氨基酸序列为SEQ ID N0 :6。
[0081] 其余操作步骤参照实施例1的方法。
[0082] 实施例4 :具有HPV16 L1序列8的工程菌的构建 1、HPV16 L1基因全长由金唯智生物科技有限公司（GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQ ID N0 :7。
[0083] 2、含有SEQ ID NO :7基因片段做PCR反应的模板。以正向引物序列：5' - CGCGGATCCGGA AA AGAAGATCCCCTTAAAAAA-3' ；在 H4 结构的 5' 端引入限制性内切酶 AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA。下游包含Xhol内切酶位点，反向引物序列： 5' -GCTCTCCTCGAG TTA TTTTCCTAAT GTAAATTTGG G -3'，其 5' 端引入限制性内切酶 Xhol 位 点，Xhol位点序列为CTCGAG。经PCR反应，扩增得到HPV16B。
[0084] 3、含有SEQ ID N0:7基因片段做PCR反应的模板。以含有引入的限制性内切酶 Nhe I 位点正向引物序列：5' -CGCGGA GCTAGCGCC TCC GGA GTCCCAGTATCTAAGGTTGTA-3' ；在 H4结构的3'端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA,反向引物序列：5，-GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC ATTCCAGTCC TCCAAAATAG -3' ；经 PCR 反应，扩增得到 HPV16A。
[0085] 4、HPV16A片段与HPV16B共同用限制性内切酶AccIII酶切，形成特异粘性末端， 使用T4 DNA连接酶连接HPV16A和HPV16B片段，使之形成一个删除了 H4结构域的、原来的 H4结构域被编码连接多肽GGGSG的核苷碱基序列取代的HPV16C。
[0086] 5、表达质粒pGEX-4T-2用BamH I和Xhol酶切消化，再用T4连接酶连接 HPV16c和表达质粒。BamH I/Xhol酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆 PGEX-4T-2-HPV16C。利用M13(+V(_)引物，测得质粒中插入的目的核苷酸序列正确，其编 码的氨基酸序列为SEQ ID N0 :8。
[0087] 其余操作步骤参照实施例1的方法。
[0088] 实施例5 :具有HPV16 L1序列10的工程菌的构建 1、HPV16 L1基因全长由金唯智生物科技有限公司（GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQ ID N0 :9。
[0089] 2、含有SEQIDN0:9基因片段做PCR反应的模板。以正向引物序列 ：5'- CGCGGATCCGGA AA AGAAGATCCCCTTAAAAAA-3' ；在 H4 结构的 5' 端引入限制性内切酶 AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA。下游包含Xhol内切酶位点，反向引物序列： 5' -GCTCTCCTCGAG TTA CAGCTTACGT TTTTTGCGTT T -3'，其 5' 端引入限制性内切酶 Xhol 位 点，Xhol位点序列为CTCGAG。经PCR反应，扩增得到HPV16B。
[0090] 3、含有SEQ ID N0:9基因片段做PCR反应的模板。以含有引入的限制性内切酶 BamH I 位点正向引物序列:5,-CGCGGAGGATCC GGA GGA GGA GCCACTGTCTACTTGCCTCCT -3';在 H4结构的3'端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA,反向引物序列：5，-GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC ATTCCAGTCC TCCAAAATAG -3' ；经PCR 反应，扩增得到 HPV16A。
[0091] 4、HPV16A片段与HPV16B共同用限制性内切酶AccIII酶切，形成特异粘性末端， 使用T4 DNA连接酶连接HPV16A和HPV16B片段，使之形成一个删除了 H4结构域的、原来的 H4结构域被编码连接多肽GGGSG的核苷碱基序列取代的HPV16C。
[0092] 5、表达质粒pGEX-4T-2用BamH I和Xhol酶切消化，再用T4连接酶连接 HPV16c和表达质粒。BamH I/Xhol酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆 PGEX-4T-2-HPV16C。利用M13(+V(_)引物，测得质粒中插入的目的核苷酸序列正确，其编 码的氨基酸序列为SEQ ID N0 :10。
[0093] 其余操作步骤参照实施例1的方法。
[0094] 实施例6 :具有HPV16 L1序列11的工程菌的构建 以合成的含有SEQ ID NO : 1基因片段做PCR反应的模板，N端前8个氨基酸被GSGGG 取代，C端不截短氨基酸，按照上述实施例1的方法PCR扩增，得到其目的氨基酸序列为SEQ ID NO ：11〇
[0095] 实施例7 :重组HPV16 L1蛋白的大量表达与纯化 蛋白表达：在_70°C中分别取出实施例1- 6的冻存菌种，平板活化，37°C培养14-20h， 挑菌苔于80mL种子培养基中，37°C培养10_12h ;然后接种于50L种子罐在37°C下培养 10-12h ;之后接种于500L发酵罐中，发酵培养、诱导表达；诱导表达结束后离心收集菌体。 用pH7. 4磷酸盐缓冲液重悬菌体，之后破碎，破碎方法可用但不限于：高压匀浆、超声波破 碎或溶菌酶溶解等化学或物理手段。离心，获得上清液。可采用Lowry法检测总蛋白量，用 Elisa法检测L1含量。
[0096] 蛋白纯化：上清液可用但不限于盐析、等电点沉淀、离子交换层析、亲和层析、分子 筛等分离纯化方法，得到纯度98%HPV16 L1的五聚体。用电镜观察纯化产物，直径均为10nm 左右的五聚体蛋白。
[0097] 纯化方法具体步骤为将上清溶液中的L1蛋白经亲和色谱纯化：预装谷胱甘 肽-琼脂糖树脂（GE公司生产的Glutathione Sepharose 4 B)色谱柱。取浓度为50%的 Glutathione Sepharose 4 B树脂勻楽放入色谱柱中（每200ml蛋白清液需要5-10ml树脂 匀浆）。用5-10倍的柱床体积的缓冲液A (组分为：50mmol/LTric-HCl，200mmol/L NaCl， lmmol/LEDTA，pH 8.0)洗涤树脂，然后将蛋白清液加入色谱柱中，与树脂混合均匀并在室 温下作用20分钟后放出滤过液，用10倍柱床体积的缓冲液A洗涤树脂柱。将精确蛋白酶 (Prescission Protease,简称PP酶）用缓冲液A稀释，上样并柱上循环酶切120min。放出 酶切液，用适量的缓冲液A洗脱并收集目的蛋白。
[0098] 离子交换色谱纯化：将上述收集的目的蛋白用Source Q或Mono Q (GE公司）阴离 子交换柱进行离子交换层析，收集目的蛋白。
[0099] 分子筛色谱纯化：将离子交换色谱收集的目的蛋白用分子量在10-600kDa的凝胶 过滤介质进行分子筛层析，最终获得纯度大于98%的高纯度HPV16 L1五聚体蛋白。
[0100] 实施例8 :HPV16 L1五聚体的形态学检测 将实施例1-6构建的工程菌株送上海生工公司测序，测得质粒中插入的目的DNA序列， 其编码的氨基酸序列为 SEQID N0 :2、SEQID N0 :4、SEQID N0 :6、SEQID N0 :8、SEQID N0 :10、 SEQID N0 :11所示，其中实施例1-5结果表明原来全长序列中H4结构域不复存在，取而代之 的是编码连接多肽 GGGSG 或 GAGSG 序列的"GGA GGA GGA TCC GGA" 或"GGA GCC GGA TCC GGA" 核苷酸序列。
[0101] 将实施例1-6方法获得的工程菌株采用实施例7的方法表达纯化得到的产物 HPV16 L1五聚体蛋白，透射电镜观察（100,000倍），结果显示，视野中可见直径为10nm左右 的五聚体，颗粒大小与理论大小相符，均匀一致。其中实施1序列所得样品的电镜照片见附 图1。
[0102] 进行颗粒粒径测定。仪器为马尔文Zetasizer NanoZS的动态光散射粒径仪，使用 算法为Regulation算法。样品经0.22 um滤膜过滤后进行测量，结果见表1。结果表明， 六种五聚体平均粒径基本一致12. 85-13. 96nm，但分散性指数Pdl (表明蛋白的均一性）存 在显著差异，其中实施例1-5样品的分散性指数较小，说明样品很均一。实施例6样品的分 散性指数较大，说明样品不均一。
[0103] 表1五聚体平均粒径和分散性指数
【权利要求】
1. 一种重组的HPV16 L1蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列在N端8-15个氨基 酸全部或任意部分被2-10个氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一组合方 式；H4结构域被2-10个氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一组合方式。
2. 如权利要求1所述的HPV16 L1蛋白，其特征在于其氨基酸序列C端截短0-21个氨 基酸，优选截短10个或21个氨基酸。
3. 如权利要求1或2所述的HPV16 L1蛋白，其特征在于其氨基酸序列N端前8-15个 氨基酸被GSGGG、ASASG或GSGAG取代，H4结构域被GGGSG或GAGAS取代。
4. 如权利要求3所述的HPV16 L1蛋白，其特征在于其氨基酸序列在N端前8、10或15 个氨基酸优选被GSGGG或GAGA氨基酸序列取代。
5. 如权利要求4所述的HPV16 L1蛋白，其特征在于其序列包含序列SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8 或 SEQ ID NO :10。
6. 编码权利要求1-5任一项的蛋白的多核苷酸。
7. 包含权利要求5的多核苷酸的表达载体。
8. 包含权利要求7的表达载体的细胞。
9. 一种HPV16 L1蛋白五聚体，其特征在于该蛋白五聚体由权利要求1至5任一所述的 蛋白形成。
10. -种HPV疫苗，其特征在于该疫苗包括权利要求9所述的HPV16 L1蛋白五聚体和 药用佐剂。
11. 如权利要求10所述的HPV疫苗的制备方法，其特征在于该方法为： 克隆或合成重组HPV16 L1蛋白的基因片段； 在大肠杆菌或酵母表达系统中表达重组的HPV16 L1蛋白； 纯化由HPV16 L1蛋白组成的五聚体； HPV16 L1蛋白五聚体加入药用佐剂制成疫苗。
12. 如权利要求9所述的HPV16 L1蛋白五聚体在预防和/或治疗包括HPV16感染及导 致疾病的药物中的应用。
13. 如权利要求10所述的HPV16 L1疫苗在预防和/或治疗包括HPV16感染及导致疾 病的药物中的应用。
【文档编号】C12N15/37GK104045696SQ201310696233
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2012年12月18日
【发明者】刘永江, 陈小江, 陈林, 盖大海, 许铮, 曹科, 陈建平, 潘勇昭, 银飞, 阮芳勇 申请人:北京康乐卫士生物技术股份有限公司