使用菌根菌与腐生菌共同培养黄鳞鹅膏菌丝体的方法
【专利摘要】本发明涉及一种使用菌根菌与腐生菌共同培养黄鳞鹅膏菌丝体的方法，属于大型真菌培养【技术领域】。其特征为：直接在增殖培养基中加入菌根真菌石灰菌及人工培养的腐生菌香菇，即可使黄鳞鹅膏菌丝体的生长速度提高9～12倍，生长明显加快。本发明不需繁琐复杂的流程，只在培养基中加入两种菌体混合物，即加快了菌丝体繁殖速度，其效果明显、培养简单易实现、生产成本不高。鹅膏属毒素在开发新特效药如抗肿瘤、抗菌抗病毒、镇静或麻醉药等领域具有潜在地应用，但至今因其资源珍稀、难以人工驯化等瓶颈问题尚难以开发应用。本发明征对黄鳞鹅膏菌丝生长比较缓慢等制约纯培养的问题进行了创新研究，为菌丝的规模化培养及今后人工驯化栽培等提供了依据。
【专利说明】使用菌根菌与腐生菌共同培养黄鳞鹅膏菌丝体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种使用菌根菌与腐生菌共同培养黄鳞鹅膏菌丝体的方法，属于生物【技术领域】，具体地说是属于有毒大型真菌室内培养范畴。
【背景技术】
[0002]鹅膏菌属—)隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、鹅膏菌科 iaceae)，是有毒的大型真菌中较特殊、较有价值的一个世界性广布大属,其物种多
样性是非常丰富的。全球已报道近400种，中国已记录的近100种(含亚种、变种及变型)。据考证，目前中国仍有不少种尚未研究和命名。但是如今随着全球生态危机的出现，我国的许多大型真菌资源已告危，处于严重衰退及濒危状态，而部份种面临着可能还没有被人类认识或发现其价值时，就已灭绝的风险。
[0003]鹅膏菌属中的大部份种属于著名剧毒菌，据知，因误食野生蕈菌中毒死亡者95%是因鹅膏菌所致。科学家们对鹅膏菌真正感兴趣的是其毒性，因此，大约在140年前，人们就开始了鹅膏菌毒素的研究。鹅膏毒素的应用研究主要体现在以下几方面:①可用于研究真核生物基因的表达、调控及细胞定位；②可开发抗菌、抗病毒特效新药可筛选抗肿瘤药物；④可开发镇静、麻醉及其它特效药可用于生物防冶等。
[0004]目前导致鹅膏难以开发及可持续性利用的主要瓶颈问题有:①鹅膏资源珍稀，其种群小，个体少，产量低，分布数量极其有限，加之对生境敏感，一旦生境受到破坏，极易消失或灭绝，属于特殊的致危生物类群，这增加了其进一步被研究、利用的难度；②鹅膏菌属，大多属于外生菌根真菌，目前尚不能人工栽培。因此，至今国内外还没有一种能规模化开发的毒素产品，现作为生化试剂的肽类毒素依然价格昂贵(10多年前每克在10万美元左右—陈作红等，1999)，难以满足科研和应用所需。
[0005]鹅膏的纯培养是保证鹅膏资源可持续性利用的前提或关键，但此目前仍然属于难以攻克的问题，存在许多盲点，其中菌丝难以诱导、菌丝生长非常缓慢是制约及影响纯培养的重要环节或因素。
[0006]黄鱗鹅膏Cl,属于鹅膏亚属(Amanita subgen.Amanita)鹅膏组(sect.Amanita),其种群分布较少，目前已成功分离到了该种的菌丝,但菌丝的生长前期仍然很慢，难以扩繁，本发明征对这个问题，在培养基中加入菌根菌与腐生菌，大大提高了菌丝的生长速度，为鹅膏毒素的可持续性开发利用等奠定了重要基础。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于，提供一种简单、易实现、生产成本不高，能使鹅膏菌丝快速生长的培养方法。
[0008]本发明的技术任务是，直接在增殖培养基中同时加入鹅膏属以外的菌根真菌及人工培养的腐生菌，即可使黄鳞鹅膏菌丝体的生长速度提高9~12倍；
所述的增殖培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白冻1.00~1.25g/L、ZnSO40.40 ~0.60g/L、MgS040.40 ~0.60g/L、玉米素 ZT 0.80 ~1.00mg/L、粉碎的过 80 目分样筛的生境腐叶土 25~35g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6~6.0 ;
所述的菌根真菌为采自鹅膏生境中大量生长的石灰菌(JMCtarius piperatus),腐生菌为可室内规模化生产的香燕eiZoofes);石灰菌及香燕的制备及使用方法如下:分别将石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，将混合干粉，按1:7~1:8的重量体积比加入水，搅匀，用超声波处理30~40 min，再加入15~20倍水，调节PH值为5.4~
5.6，于45~50°C水浴中，按2.5~3.0%的重量体积比加入纤维素酶，酶解70~100 min后，将水浴温度升至90~93°C，至水分基本蒸干时移入65~70°C烘箱中，干燥25~30hr ；将酶解的干粉按25~35g/L加入到增殖培养基中；
所述的黄鳞鹅膏菌丝体为本发明前期诱导及培养，诱导及培养方法如下:野外采摘生长良好、未开伞的健康子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.35cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白冻1.00~1.25g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麦芽汁 100 ~125ml、琼脂10.00g/L,控制培养基PH值为5.6~6.0，在22~23°C下暗培养50~60天，组织块表面长出白色绒毛状菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代培养，即得本发明用菌丝。 [0009]本发明的有益效果是:直接在增殖培养基中加入特殊物质，即可使菌丝体的生长速度大大提高，其特点如下:
(1)效果明显:加入菌根菌与腐生菌的混合物后，生长速度为未加入以前的9~12倍，生长明显加快；
(2)培养简单易实现:不需繁琐复杂的流程，只要在培养基中加入经过酶解处理的菌体复合物即可；
(3)生产成本不高:本发明采用的两种菌体物质，一种采自野外，生长量大，易得；另一种市场上随处可买，价格便宜，二者皆不会造成培养成本的增高。
【具体实施方式】
[0010]以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0011]实例一:
野外采摘生长良好、未开伞的健康子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约
0.35cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖9g/L、蛋白冻
1.00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /L、KH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麦芽汁 100ml、琼脂10.00g/L,控制培养基PH值为5.6，在22~23°C下暗培养50天，组织块表面长出白色绒毛状菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代培养，即得本发明用菌丝；
将菌丝转入增殖培养基，所述的增殖培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖9g/L、蛋白冻
1.00g/L、ZnSO40.40g/L、MgSO40.40g/L、玉米素 ZT 0.80mg/L、粉碎的过 80 目分样筛的生境腐叶土 25g/L、石灰菌及香菇的酶解干粉25g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6 ;
所述石灰菌及香菇的制备方法如下:分别将石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，将混合干粉，按1:7的重量体积比加入水，搅匀，用超声波处理30min，再加入15倍水，调节PH值为5.4，于45°C水浴中，按2.5%的重量体积比加入纤维素酶，酶解70min后，将水浴温度升至90°C，至水分基本蒸干时移入65°C烘箱中，干燥25hr即可。[0012]实例二:
野外采摘生长良好、未开伞的健康子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.35cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖llg/L、蛋白冻 1.25g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 1.00g/L,KH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麦芽汁 125ml、琼脂10.00g/L,控制培养基PH值为6.0，在22~23°C下暗培养60天，组织块表面长出白色绒毛状菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代培养，即得本发明用菌丝；
将菌丝转入增殖培养基，所述的增殖培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖llg/L、蛋白冻 1.25g/L、ZnSO40.60g/L,MgSO40.60g/L、玉米素 ZT 1.00mg/L、粉碎的过 80 目分样筛的生境腐叶土 35g/L、石灰菌及香菇的酶解干粉35g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为6.0 ；所述石灰菌及香菇的制备方法如下:分别将石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，将混合干粉，按1:8的重量体积比加入水，搅匀，用超声波处理40 min，再加入20倍水，调节PH值为5.6，于50°C水浴中，按3.0%的重量体积比加入纤维素酶，酶解100 min后，将水浴温度升至93°C，至水分基本蒸干时移入70°C烘箱中，干燥30hr即可。
[0013]实例三:
野外采摘生长良好、未开伞的健康子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约
0.35cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖10g/L、蛋白冻 1.10g/L, MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麦芽汁 110ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6，在22~23°C下暗培养55天，组织块表面长出白色绒毛状菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代培养，即得本发明用菌丝；
将菌丝转入增殖培养基，所述的增殖培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖10g/L、蛋白冻 1.10g/L、ZnSO40.50g/L,MgSO40.50g/L、玉米素 ZT 0.90mg/L、粉碎的过 80 目分样筛的生境腐叶土 30g/L、石灰菌及香菇的酶解干粉30g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6 ；所述石灰菌及香菇的制备方法如下`:分别将石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，将混合干粉，按1:7的重量体积比加入水，搅匀，用超声波处理35 min，再加入18倍水，调节PH值为5.4，于48°C水浴中，按2.8%的重量体积比加入纤维素酶，酶解90 min后，将水浴温度升至91°C，至水分基本蒸干时移入68°C烘箱中，干燥28hr即可。
[0014]实例四:
野外采摘生长良好、未开伞的健康子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约
0.35cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖10g/L、蛋白冻 1.20g/L, MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麦芽汁 120ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为6.0，在22~23°C下暗培养58天，组织块表面长出白色绒毛状菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代培养，即得本发明用菌丝；
将菌丝转入增殖培养基，所述的增殖培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖10g/L、蛋白冻 1.20g/L、ZnSO40.55g/L,MgSO40.55g/L、玉米素 ZT 0.85mg/L、粉碎的过 80 目分样筛的生境腐叶土 28g/L、石灰菌及香菇的酶解干粉28g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为6.0 ；所述石灰菌及香菇的制备方法如下:分别将石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，将混合干粉，按1:8的重量体积比加入水，搅匀，用超声波处理38 min，再加入17倍水，调节PH值为5.6，于47°C水浴中，按2.6%的重量体积比加入纤维素酶，酶解80 min后，将水浴温度升至92°C，至水分基本蒸干时移入67°C烘箱中，干燥26hr即可。
【权利要求】
1.一种使用菌根菌与腐生菌共同培养黄鳞鹅膏菌丝体的方法，其特征为，在增殖培养基中同时加入鹅膏属以外的菌根真菌及人工培养的腐生菌，能使黄鳞鹅膏菌丝体的生长速度提高9~12倍。
2.根据权利要求1所述的使用菌根菌与腐生菌共同培养黄鳞鹅膏菌丝体的方法，其特征为，所述的增殖培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白冻1.0O~1.25g/L、ZnSO40.40 ~0.60g/L、MgS040.40 ~0.60g/L、玉米素 ZT 0.80 ~1.00mg/L、粉碎的过 80 目分样筛的生境腐叶土 25~35g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.6~6.0。
3.根据权利要求1所述的使用菌根菌与腐生菌共同培养黄鳞鹅膏菌丝体的方法，其特征为，菌根真菌为采自鹅膏生境中大量生长的石灰菌腐生菌为可室内规模化生产的香eiZoofes);石灰菌及香燕的制备及使用方法如下:分别将石灰菌、香菇烘干，粉碎，二者按1:4比例混合，将混合干粉，按1:7~1:8的重量体积比加入水，搅匀，用超声波处理30~40 min,再加入15~20倍水，调节PH值为5.4~5.6，于45~50°C水浴中，按2.5~3.0%的重量体积比加入纤维素酶，酶解70~100 min后，将水浴温度升至90~93°C，至水分基本蒸干时移入65~70°C烘箱中，干燥25~30hr ;将酶解的干粉按25~35g/L加入到增殖培养基中。
4.根据权利要求1所述的使用菌根菌与腐生菌共同培养黄鳞鹅膏菌丝体的方法，其特征为，黄鳞鹅膏菌丝体为本发明前期诱导及培养，诱导及培养方法如下:野外采摘生长良好、未开伞的健康子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.35cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述培养基成分为:马铃薯200g/L、果糖9~llg/L、蛋白冻1.00~1.25g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /L、KH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麦芽汁 100 ~125ml、琼脂.10.00g/L，控制培养基PH值为5.6~6.0，在22~23°C下暗培养50~60天，组织块表面长出白色绒毛状菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代培养，即得本发明用菌丝。
【文档编号】C12N1/14GK103667084SQ201310701996
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】李宗菊, 张曦予, 程霞, 唐萍, 曹玉, 冯辽辽, 赵昱, 左奎 申请人:云南大学