荧光重组病毒竞争实验体系的建立的制作方法
【专利摘要】荧光重组病毒竞争实验体系的建立，本发明属基因工程【技术领域】。在该体系中，分别以表达绿色荧光蛋白（EGFP）和红色荧光蛋白（DsRed2）的B亚型标准株NL4.3（△Env）为骨架，将源自两种不同HIV-1病毒的env基因通过同源重组的方法，构建荧光重组嵌合病毒。两种携有不同荧光蛋白的竞争病毒分别单独感染及共感染靶细胞U87。不同的荧光蛋白作为区分两种竞争病毒的标签，通过流式细胞技术分别计算带有不同荧光的细胞个数，可以快速准确地获得不同病毒感染的细胞数量。经过相应计算可以得到两种竞争病毒的相对适应性。HIV-1复制适应性可以通过一系列统计计算得到，其成为反应HIV-1对特定宿主细胞环境适应能力的量化指标。
【专利说明】荧光重组病毒竞争实验体系的建立
【技术领域】
[0001 ] 本发明属基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS),由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)感染引起,是最严重的感染性疾病之一。艾滋病传播的途径有三种:血液传播、性传播和母婴传播。在HIV-1传播过程中，只有一小部分病毒被传播，目前，对限制性传播与病毒的生物学特征之间的关系还缺乏了解，病毒复制适应性在HIV-1选择性传播中变化特点引起较大关注。而HIV-1的复制适应性在很大程度上由糖蛋白Env决定。关于HIV-1适应性的研究，在目前所采用的病毒竞争实验中，多采用异源双链示踪检测(heteroduplex tracking assay, ΗΤΑ)法和real-time PCR定量的方法来测定病毒的产量。HTA需放射性同位素检测，昂贵、费时；real-time PCR批量间差异比较大，重复性相对较差；而且二者均需要提取感染宿主细胞基因组，之后对其进行相应的目的基因的检测。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是建立新型荧光重组病毒竞争实验体系，以便检测受糖蛋白Env影响的HIV-1复制适应性。
[0004]在该体系中，分别以表达绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(DsRed2)的B亚型标准株NL4.3 (Δ Env)为骨架，将源自两种不同HIV-1病毒的env基因通过同源重组的方法，构建荧光重组嵌合病毒，见附图1。两种携有不同荧光蛋白的竞争病毒分别单独感染及共感染靶细胞U87-CD4-CCR5，见附图2。单独感染的两种不同病毒分别作为两种竞争病毒的自身对照，不同的荧光蛋白作为区分两种竞争病毒的标签，通过流式细胞技术分别计算带有不同荧光的细胞(已感染病毒)个数，可以快速准确地获得不同病毒感染的细胞数量，见附图3。经过相应的计算可以得到两种竞争病毒的相对适应性(relative fitness)。HIV-1复制适应性可以通过一系列统计计算得到，其成为反应HIV-1对特定宿主细胞环境适应能力的量化指标。
[0005]本发明首先提供了构建表达EGFP或者DsRed2荧光蛋白标记的重组HIV-1病毒的方法，通过PCR方法扩增出基因；使用限制性内切酶Xba I (New England Biolabs)酶切 NL4.3 Δ EnvEGFP 或 NL4.3 Δ EnvDsRed2 载体使其线性化。使用 FuGENE 6 (Roche,Indiana polis, IN)将相同分子数的PCR扩增产物片段与线性化的NL4.3 Λ EnvEGFP或NL4.3 Δ EnvDsRed2载体共转染293T细胞(2.5 X IO6个细胞/IOcm培养皿)，由于PCR引物(EnvB-F:5-AGAAAGAGCAG A AG ACAGTGGC AAT GA-3 ；EnvB-R: 5-TTGT ACTACTTCTATAACCTTATCTGT-3)与线性 NL4.3 Δ EnvEGFP 或 NL4.3 Δ EnvDsRed2 (本研究领域常用质粒，序列网上可以查到)的5’及3’端具有相同的核苷酸序列，利用细胞的重组酶和NL4.3ΛEnvEGFP或NL4.3ΛEnvDsRed2进行同源重组，得到了 HIV荧光重组病毒。转染后60h收获病毒上清，并用0.45μπι的滤膜(Millipore)过滤，_80°C保存用于病毒滴度测定和生长竞争分析。
[0006]利用上述方法构建的荧光重组病毒通过生长竞争实验的方法来评价病毒复制适应性，该方法用流式细胞仪计数绿色或红色重组荧光病毒感染的细胞数，分别表示重组荧光病毒产生的子代病毒数；用公式(I)和公式(2)计算出病毒的适应性数值，
W (R) = [ (b/a) / (c/d+b/a) ] X 2(I)
和 W(G) = [(c/d)/(b/a+c/d)] X2 (2)
其中，W(R)、W(G)分别表示DsRed2和EGFP重组病毒的适应性，a为表达DsRed2重组病毒单独感染的阳性细胞率，d为表达EGFP荧光重组病毒单独感染的阳性细胞率，b、c分别为两种竞争病毒共同感染时，分别表达DsRed2和EGFP的阳性细胞率；
在这里选用表达红色或绿色不同荧光蛋白的NL4.3荧光重组病毒作为阳性对照，通过流式细胞仪测定单独感染和共同感染时带有不同荧光的细胞阳性率，将这些数值带入公式(I)和公式(2)即可得出病毒的适应性数值。具体内容包括:
1、评价病毒复制适应性的生长竞争实验的方法。
[0007]生长竞争实验涉及到两种不同HIV病毒共感染一种细胞培养物。在我们的系统中，用两种病毒共感染细胞或一种病毒分别感染细胞；感染多轮之后，在共感染中被一种病毒感染的细胞数与在单独感染中被一种病毒感染的细胞数比较。将U87- CD4 -CXCR4/CCR5按照5X IO4细胞/孔，铺于24孔板。分别使用两种不同荧光标记的病毒单独感染细胞(MOI=0.005)，同时等量混合，共同感染细胞，37°C 5% C02,培养24 h。使用PBS清洗三次，去除未和靶细胞受体结合病毒，加入新鲜培养基，继续培养直至收集细胞。
[0008]2、被EGFP或DsR ed2标记的HIV-1感染的细胞定量计数的方法。
[0009]用倒置广角荧光显微镜Eclipse TE300 (Nikon, Japan)每天监控荧光细胞的多少。EGFP或DsRed2标记的HIV-1感染细胞5天后荧光信号最强。这时收获细胞并用流式细胞仪FACSCalibur和Cell Quest Pro Software分析突光细胞数。
[0010]3、最后本发明提供了评价病毒适应性的方法。
[0011]适应性的计算以在共感染过程中产生的病毒数与单独感染产生的病毒数的比较为基础。在感染5天后,通过用流式细胞仪计算被绿色或者红色荧光病毒感染的细胞数来表示产生的病毒数。在我们的HIV-1竞争实验体系中，两种竞争性病毒的最初比例为1:1。带有DsRed2的荧光重组病毒的适应性数值用b/a表示，带有EGFP的荧光重组病毒的适应性数值有c/d表示。选用表达不同荧光蛋白的NL4.3荧光重组病毒作为阳性对照，以最适MOI=0.01感染表达⑶4及CXCR4和CCR5辅助受体的TZM_bl细胞，5天后收获细胞通过流式细胞仪测定单独感染和共同感染的荧光细胞阳性率见附图3。附图3中，A图和B图分别为用不同的重组荧光病毒感染TZM-bl细胞之后的流式结果，C图为共感染之后的流式结果。研究证实NL4.3荧光重组病毒具有相同的病毒复制适应性而不受不同荧光蛋白标签的影响。在竞争分析中，每种病毒的相对适应性值是三次重复结果的平均值。用两种HIV-1毒株的相对适应性值的比率表示这两种毒株之间的适应性差异。
[0012]本发明的优点和有益效果:
本发明运用DNA同源重组的原理设计了带有不同荧光标签的HIV重组病毒。通过流式细胞仪及相应的软件就可以很容易计算出病毒适应性数值，方便、快捷、花费低、安全和重复性好。
[0013]
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1:HIV-l-EGFP/DsRed2标记的荧光重组病毒的构建。
[0015]图2:竞争性实验示意图。 [0016]图3:病毒的相对适应性数值的计算。
[0017]图4:荧光重组病毒感染U87-⑶4 -CXCR4/CCR5的动力学曲线。
[0018]图5:母亲、婴儿重组荧光病毒在U87-⑶4-CCR5细胞的体外竞争实验，
注:1084i6-lR:DsRed2标记的来自婴儿的病毒；1084M0_4G:EGFP标记的来自母亲的病毒；1084M0-4G+1084i6-lR:母、婴重组病毒共感染U87细胞。
[0019]图6 =HIV慢性感染母婴对荧光重组病毒的相对适应性数值。
[0020]图7:母亲、婴儿重组荧光病毒置换标签后在U87-⑶4-CCR5细胞的体外竞争实验， 注:1084i6-lG: EGFP标记的来自婴儿的病毒；1084M0_4R:DsRed2标记的来自母亲的
病毒；1084M0-4R+1084i6-lG:母、婴重组病毒共感染U87细胞。
[0021]图8 =HIV慢性感染母婴对置换荧光标签后重组病毒的相对适应性数值。
[0022]图9:母亲、婴儿重组荧光病毒在PBMC细胞的竞争实验，
注:1084i6-lR:DsRed2标记的来自婴儿的病毒；1084iM0_4G:EGFP标记的来自母亲的病毒；1084M0-4G+1084i6-lR:母、婴重组病毒共感染PBMC。
[0023]图10 =HIV慢性感染母婴对重组病毒在PBMC的Ex vivo适应性数值。
[0024]
【具体实施方式】
[0025]实施例1
通过建立的荧光重组病毒竞争性实验体系比较HIV母婴传播中供体(母亲)和受体(婴儿)来源的HIV病毒的Env对病毒复制适应性的影响。
[0026]一、荧光重组病毒的构建
PCR获得病毒全长基因片段，所用引物序列:EnvB-F (5-AGAAAGAGCAG A AGACAGTGGC AAT GA-3) ；EnvB-R (5-TTGTACTACTTCTATAACCTTATCTGT-3)。 将 NL4.3AEnvEGFP或NL4.3AEnvDsRed2载体，通过Xba I酶切，回收线性片段。使用FuGENE 6(Roche)将上述两种片段等摩尔转染293T细胞，由于PCR引物与线性NL4.3 Δ EnvEGFP和NL4.3 Δ envDsRed2 5’及3’端具有相同的核苷酸序列，利用细胞的重组酶env和NL4.3Λ Env EGFP或NL4.3AEnvDsRed2进行同源重组，得到了 HIV荧光重组病毒。培养60 h，收集上清，过0.45 μ m滤膜，得到病毒储液，保存于-80 °C。
[0027]二、病毒滴度的测定
4倍梯度稀释病毒储液，通过感染表达HIV-⑶4及辅助受体CXCR4和CCR5的TZM_bl细胞(3个复孔)，由于HIV-LTR能够启动TZM-bl β -gal的表达，通过底物显色反应及概率统计计算重组病毒TCID50。
[0028]三、重组荧光嵌合病毒复制动力学曲线(I)第I天将感染靶细胞U87-⑶4 -CXCR4/CCR5按照5 X IO4细胞/孔，铺于24孔板。
[0029](2)第2天将表达不同荧光蛋白的重组病毒以三种不同MOI (0.001，0.005,0.01)分别单独感染和共感染U87- CD4 -CXCR4/CCR5。
[0030](3)分别在感染后的第2，4，6，8，10，12天收获上清，进行病毒滴度测定，病毒滴度以TCID5tl表示。
[0031](4)根据以上病毒滴度绘制荧光重组病毒体外复制动力学曲线见附图4，以峰值的出现时间作为病毒竞争体系收获病毒的最佳时间，从附图4中我们可以得出结论收获病毒的最佳时间为5天。 [0032]四、HIV感染母婴对适应性分析系统的建立
(I)选用表达不同荧光蛋白的NL4.3荧光重组病毒作为阳性对照，以最适MOI感染表达⑶4及CXCR4和CCR5辅助受体的TZM-bl细胞，5天后收获细胞通过流式细胞仪进行测定单独感染和共同感染的细胞阳性率见附图3。图3中，A图和B图分别为用不同的重组荧光病毒感染TZM-bl细胞之后的流式结果，C图为共感染之后的流式结果。公式W(R) = [(b/a) / (c/d+b/a) ] X 2 和 W (G) = [ (c/d) / (b/a+c/d) ] X 2 中 a 为表达 DsRed2 重组病毒单独感染细胞的阳性细胞率，d为表达EGFP荧光重组病毒单独感染的阳性细胞率，b, c分别为两种竞争病毒共同感染时，分别表达DsRed2和EGFP的阳性细胞率。W(R)、W(G)分别表示DsRed2和EGFP重组病毒的相对适应性。研究证实NL4.3荧光重组病毒具有相同的病毒复制适应性而不受不同荧光蛋白标签的影响。
[0033](2)选用NL4.3荧光重组病毒作为阳性对照，与来源于病人/感染者样本的荧光重组病毒进行竞争实验，方法同上所述，根据已有报道，NL4.3重组病毒具有比病人/感染者C亚型重组病毒更高的适应性。我们取得了与已有报道一致的结果。
[0034]来源于病人/感染者样本的荧光重组病毒的竞争实验以及相对适应性值
(I)将U87-⑶4 -CXCR4/CCR5按照5 X IO4细胞/孔，铺于24孔板。分别使用两种不同荧光标记的病毒单独感染细胞(MOI=0.005)，同时等量混合，共同感染细胞，37 V 5% C02,培养24 h。使用PBS清洗三次，去除未和靶细胞受体结合病毒，加入新鲜培养基，继续培养直至收集细胞。
[0035](2)感染病毒5天后，收集细胞，通过流式细胞仪，进行测定。病毒复制适应性的计算见附图3，通过病毒单独感染作为自身对照，对于竞争实验，起始病毒量为1:1。通过最终病毒的产量，即可得到病毒复制适应性的量化指标见附图5和附图6，Env来自婴儿的病毒复制适应性要高于来自母亲病毒的复制适应性。
[0036]五、荧光重组病毒竞争体系的验证
(I)为进一步验证传播病毒复制适应性与非传播病毒的不同是由于病毒本身所致，而并非由于不同荧光蛋白标签的作用，须将荧光重组病毒的荧光蛋白标签进行互换，进一步进行病毒竞争实验，步骤同上见附图7和附图8，说明荧光蛋白标签不影响病毒的复制适应性。
[0037](2)进一步明确传播病毒复制适应性与非传播病毒的不同是否存在细胞特异性，来自健康献血者的PBMC作为感染靶细胞进一步进行病毒竞争实验见附图9和附图10，表明传播病毒适应性与非传播病毒的不同不存在细胞特异性。
【权利要求】
1.表达EGFP或DsRed2荧光蛋白重组HIV-1病毒的构建方法，通过PCR方法扩增得到基因，使用限制性内切酶Xba I酶切NL4.3 Δ EnvEGFP或NL4.3 Δ EnvDsRed2载体使 NL4.3 Δ EnvEGFP 或 NL4.3 Δ EnvDsRed2 线性化，使用 FuGENE 6 (Roche,Indianapolis, IN)将相同分子数的PCR扩增产物env片段与线性化的NL4.3 Δ EnvEGFP或NL4.3 Δ EnvDsRed2载体共转染293T细胞，2.5 X 106个细胞/10cm培养皿，根据PCR引物与线性NL4.3 Δ Env EGFP或NL4.3 Δ Env DsRed2的5’及3’端具有相同的核苷酸序列，利用细胞重组酶将e/^和NL4.3ΛEnvEGFP或NL4.3ΛEnv DsRed2进行同源重组，得到HIV突光重组病毒。
2.利用权利要求1所述方法构建的荧光重组病毒通过生长竞争实验的方法来评价病毒的复制适应性，该方法用流式细胞仪计数绿色或红色重组荧光病毒感染的细胞数，分别表示重组荧光病毒产生的子代病毒数；用公式(1)和公式(2)计算出病毒的适应性数值，
W (R) = [ (b/a) / (c/d+b/a) ] X 2(1) 和 W(G) =[(c/d) / (b/a+ c/d) ] X 2 (2) 其中，W(R)、W(G)分别表示DsRed2和EGFP重组病毒的适应性，a为表达DsRed2重组病毒单独感染的阳性细胞率，d为表达EGFP荧光重组病毒单独感染的阳性细胞率，b、c分别为两种竞争病毒共同感染时，分别表达DsRed2和EGFP的阳性细胞率； 在这里选用表达红色或绿色不同荧光蛋白的NL4.3荧光重组病毒作为阳性对照，通过流式细胞仪测定单独感染和共同感染时带有不同荧光的细胞阳性率，将这些数值带入公式(1)和公式(2)即可得出病毒 的适应性数值。
【文档编号】C12N15/66GK103695450SQ201310707633
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】孔晓红, 刘畅, 赵学潮, 刘彬, 沈文远 申请人:南开大学