一种牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物及其试剂盒和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物及其试剂盒和应用。本发明所述引物组合物由引物组A和引物组B组成，所述引物组A由引物1和引物2组成，所述引物组B由引物3和引物4组成；引物1～引物4的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～4所示。本发明还提供了包含所述引物组合的试剂盒，本发明试剂盒应用于牛瓜氨酸血症有害基因检测的方法如下：提取牛血液中的全组DNA作为模板，进行巢式PCR（NestedPCR）扩增，所得PCR产物进行测序，根据测序结果可直接了解突变位点的碱基变化，确保了结果的准确性，满足快速、精准、高通量等特点的检测技术的需求。
【专利说明】一种牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物及其试剂盒和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】。更具体地，涉及一种牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物及其试剂盒和应用。
【背景技术】
[0002]随着人工授精和胚胎移植技术的推广和应用，奶牛优秀种质(胚胎、精液、种牛)在全球范围内的广泛应用，在显著提高遗传性能的同时，加速了牛隐性遗传疾病对牛群的危害。特别是一头优秀的种公牛一生可以生产几十万剂甚至上百万剂冷冻精液，如果携带隐性遗传缺陷基因，有可能在全世界范围内快速蔓延，给畜牧业的生产带来巨大的经济损失。我国主要从美国、加拿大、德国、澳大利亚、新西兰和乌拉圭等国进口大量奶牛优秀种质，进口时检疫重点在于防止动物传染病和寄生虫病的传入，却没有包括防止牛遗传缺陷的检疫要求，所以存在的牛遗传性缺陷携带者进入我国的风险。
[0003]遗传缺陷病是生殖细胞或受精卵内的遗传物质发生基因突变和染色体畸变导致的，从而使发育个体出现解剖结构上的异常或生理机能上的损害，常常导致某些器官的损害，形成畸形，影响生产性能，甚至导致死亡。具有先天性和家族性的特征。遗传缺陷性病分为常染色体遗传缺陷病和性染色体遗传缺陷病，其中常染色体遗传缺陷病根据致病原因又分为单基因遗传缺陷病、多基因遗传缺陷病和染色体畸变遗传缺陷病三种，性染色体遗传缺陷较少见。常染色体单基因遗传缺陷病是由一对等位基因控制的，隐性有害基因携带者表型正常，两个亲本都为携带 者时，后代有1/4可能出现隐性纯合子，即表型为患病，1/2可能为隐性杂合子，即为有害基因携带者。
[0004]瓜氨酸血症(Citrullinemia，CN)是荷斯坦牛尿素循环发生代谢紊乱的一种常染色体单基因隐性遗传缺陷病。该病最早于1986年在澳大利亚的荷斯坦牛群中发现(Harper等，1986)。病牛出生时表现正常，但不久后出现精神沉郁、步态紊乱、惊厥、失明等症状，一般出生后5 d死亡，死亡率100%。瓜氨酸血症(CN)遗传学基础是由奶牛第11号染色体(BTAll)上的编码精氨酸琥拍酸合成酶的ASS基因(Argininosuccinate synthetase, ASS)第5外显子发生C — T的点突变，使密码子CGA转变为终止密码子TGA，从而其翻译产物精氨酸琥珀酸合成酶变成了截短了的85个氨基酸的蛋白质(正常为412个氨基酸)，而失去精氨酸琥珀酸合成酶活性。导致瓜氨酸不能转变为精氨酸琥珀酸而大量积蓄于组织及血液中，从而造成尿素循环发生代谢障碍，进而导致血清淀粉酶过高。患病牛主要症状为血液中瓜氨酸含量升高，尿素循环受阻引起高氨血症，导致出生后一周内死亡。
[0005]根据这一突变位点，目前主要有PCR-RFLP和AS-PCR两种方法检测瓜氨酸血症(CN)。PCR-RFLP方法是在突变点处设计酶切位点，对PCR产物进行酶切，根据酶切结果判断是否具有酶切位点用以判断是否含有突变点，但该方法引入错配碱基后，PCR的扩增效率会受到影响，另外存在假阳性的可能。AS-PCR方法根据突变位点设计特异的引物，其中一条链与突变位点的一种碱基状态互补，另一条链按常规方法进行设计，特异引物在一种基因型中有扩增产物，在另一种基因型中没有扩增产物，根据扩增产的有无，从而确定是否有喊基的突变，但是该方法有时会引起在引物的3’末端的喊基与|吴板的喊基不互补的情况下，延伸仍然可以进行，容易造成结果的误判。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是克服现有牛瓜氨酸血症有害基因检测检测技术的不足，提供一种牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物。
[0007]本发明要解决的另一技术问题是提供一种牛瓜氨酸血症有害基因检测的试剂盒。
[0008]本发明还有一要解决的技术问题是提供所述引物组合物和试剂盒的应用。
[0009]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种新的引物组合物，为牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物，由引物组A或引物组B组成；所述引物组A由引物I和引物2组成；所述引物组B由引物3和引物4组成；引物I~4的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1~4所示。
[0010]所述引物组A为外引物，引物组B为内引物，内引物是设计在外引物扩增的片段上的。
[0011]优选地，所述 牛瓜氨酸血症有害基因是精氨酸琥珀酸合成酶基因的第86个氨基酸密码子发生无义突变的基因。
[0012]优选地，引物I和引物2的摩尔比为1: 1，引物3和引物4的摩尔比为1:1。
[0013]本发明提供所述牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物在采用巢式PCR方法检测牛瓜氨酸血症有害基因方面的应用。
[0014]本发明同时提供一种含有所述牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物的试剂盒。
[0015]在所述试剂盒中，优选地，所述引物组A或引物组B为完整独立包装。
[0016]优选地，所述试剂盒，包含有如下组分:本发明所述牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和灭菌水。
[0017]优选地，所述试剂盒除了包含所述牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物，还包含有 Pfu DNA Polymerase 酶(2.5U/ul)和 IOXPfu Buffer、dNTP Mixture (2.5 mmol /L)，以及 ddH20。
[0018]本发明同时提供所述试剂盒在检测牛瓜氨酸血症有害基因方面的应用。
[0019]本发明牛瓜氨酸血症有害基因检测方法是利用巢式PCR方法进行两次PCR反应，第一次PCR反应的模板为牛血液中的全组DNA，引物为引物组A ;第二次PCR反应的模板为第一次PCR反应产物的稀释液(无菌水稀释)，引物为引物组B ;对PCR产物进行测序，根据测序结果检测牛瓜氨酸血症有害基因。
[0020]优选地，所述第一次PCR反应扩增得到精氨酸琥珀酸合成酶基因的一个420bp的片段，如SEQ ID N0.5所示；第二次PCR反应扩增得到精氨酸琥珀酸合成酶基因的一个162bp的片段，如SEQ ID N0.6所示；根据测序结果检测牛瓜氨酸血症有害基因具体方法为根据测序图查看精氨酸琥珀酸合成酶基因的第86个氨基酸密码子是否发生无义突变。如果测序图中该位点为单峰C，则为非瓜氨酸血症有害基因；该位点为双峰，同时含有C和T，则为牛瓜氨酸血症有害基因；该位点为单峰T,则为牛瓜氨酸血症患者。[0021]优选地，所述第一次PCR反应的扩增体系中各组分的比例:引物1:引物2: PCR反应缓冲液:dNTP: DNA聚合酶:灭菌水=2: 2: 10: 10:1: 73 ;
优选地，第二次PCR反应的扩增体系中各组分的比例:引物3:引物4: PCR反应缓冲液:dNTP: DNA 聚合酶:灭菌水=2: 2: 10: 10:1: 73。
[0022]本发明具有以下有益效果:
本发明科学设计一组新的引物组合物，具有优良的扩增特异性，扩增效率高，有效避免假阴性的结果，应用于检测牛瓜氨酸血症(CN)有害基因准确性高。
[0023]本发明同时提供了检测牛瓜氨酸血症(CN)有害基因的方法，创造性地研究牛的基因，根据牛的基因组较大的特点，总结出两次的巢式PCR检测方法，通过两次PCR，避免了现有技术只通过一次PCR，由于DNA模板的浓度和纯度的关系，扩增效率不高，而且容易发生错误片段的问题。而且第二次PCR反应出现引物配对在错误片段上并扩增的概率极低。
[0024]本发明最终结果的判定是通过测序进行，可直接测出突变位点的碱基变化，进一步确保了结果的准确性。
[0025]本发明克服了现有技术所需要的凝胶电泳等繁琐操作，本发明具有快速、精准、高通量的优点，为检测牛瓜氨酸血症(CN)有害基因提供了有力的技术基础，并特别适用于进出口贸易中对牛瓜氨酸血症(CN)有害基因的检测技术需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为非瓜氨酸血症有害基因携带者(正常型)奶牛ASS基因测序图，箭头处为突变位点。
[0027]图2为瓜氨酸血症有害基因携带者奶牛ASS基因测序图，箭头处为突变位点。
[0028]图3为CN基因均一化的HRM温度变化图。
[0029]图4为CN基因的HRM差异视图。
【具体实施方式】
[0030]以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本【技术领域】常规试剂、设备和方法。
[0031]本发明实施例所用Pfu DNA Polymerase 酶(2.5U/ul)和 IOXPfu Buffer、dNTPMixture (2.5 mmol/L),均购自天根生物科技有限公司。
[0032]实施例1制备筛查牛瓜氨酸血症的巢式PCR反应试剂盒 1、引物设计
根据NCBI上ASS基因序列(GenBank: AC_000168)结合本发明整体思路不断分析、总结和调整引物的设计，最终根据牛第11号染色体(BTAll)上的编码精氨酸琥珀酸合成酶的ASS基因(Argininosuccinate synthetase, ASS)第5外显子发生C —T的点突变，设计了一种检测牛瓜氨酸血症有害基因的巢式PCR方法，获得引物1、引物2、引物3和引物4。序列如SEQ ID N0.1~4所示:
引物 1:SEQ ID N0.1:actgcatttt caagaccacc ctg ；
引物 2:SEQ ID N0.2:tctgggcggg aaccaacgat tgtc ；引物 3:SEQ ID N0.3:attgaggaca tcagcaagga g ；
引物 4:SEQ ID N0.4:cacatacttg gctccttctc。
[0033]其中，引物I和引物2为引物组A(外引物)，引物3和引物4为引物组B(内引物)。
[0034]所有引物可以采用合成等常规方法获得。本实施例引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
[0035]以本发明所述引物组和PCR反应相关试剂组成试剂盒。所述引物组是引物组A和引物组B ;所述PCR反应相关试剂为DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和灭菌水。
[0036]本实施例以引物组A和引物组B同时使用(巢式PCR反应试剂盒)为例，说明检测牛瓜氨酸血症有害基因的试剂盒的制备。
[0037]2、本实施例制备的巢式PCR反应试剂盒包括两个部分:第一次PCR (外引物)试剂盒和第二次PCR (内引物)试剂盒。
[0038](I)第一次PCR (外引物)试剂盒
试剂盒除了包括外引物(引物I和引物2)，还包括PCR反应试剂:Pfu DNA Polymerase酶(2.5U/ul)、10XPfu Buffer,dNTP Mixture (2.5 mmol/L)、ddH20。PCR 反应的引物 I 为正向引物，引物2为反向引物，正反向引物浓度均为10pmol/L。
[0039]PCR反应体系以25 uL体系为例:引物I和引物2各0.5mL，IOXPfu Buffer
2.5mL、dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2.5mL> Pfu DNA Polymerase 酶(2.5U/ul) 0.25mL、ddH20 18.25mL,剩下的0.5mL体积为模板DNA。即用于第一次PCR反应的试剂混合液中各成分比例为，引物 1:引物 2:1OXPfu Buffer: dNTP Mixture: Pfu DNA Polymerase酶:ddH20=2: 2: 10: 10:1: 7`3。
[0040]实验时根据体系的总量按比例加入相关成分并混匀，加入模板DNA进行第一次PCR反应。
[0041](2)第二次PCR (内引物)试剂盒:
试剂盒包括外引物(引物3和引物4)，PCR反应的引物3为正向引物，引物4为反向引物，正反向引物浓度均为lOpmol/L。除引物外，其他相关成分和各成分的比例同第一次PCR试剂盒相同。即引物3:引物4:1OXPfu Buffer: dNTP Mixture: Pfu DNA Polymerase酶:ddH20=2: 2: 10: 10:1: 73。
[0042]实验时根据体系的总量按比例加入相关成分并混匀，以便加入模板DNA进行第二次PCR反应。
[0043]实施例2利用实施例1制备的巢式PCR反应试剂盒检测奶牛瓜氨酸血症 1、牛血液中全组DNA的提取
颈静脉采血法随机采集江苏某隔离场243头荷斯坦奶牛的血液样本5mL/头，并置于真空肝素钠抗凝管中摇匀后用离心管分装每管2ml，-20°C冻存备用。
[0044]采用Promega Maxwell 16核酸自动提取仪进行血液基因组DNA的提取，使用配套试剂盒(Promega 公司的 AS1010)。Promega 的 AS1010 试剂盒包含 Maxwell 16 Blood DNACartridges、Purification Plungers、Elution Tubes、Elution buffer。操作按试剂盒说明书进行，该仪器启动后大约每28min可以完成16个样品DNA的提取。DNA提取完毕后，将其从洗脱管中转移至离心管(Ep管)中，置于_20°C保存待用。
[0045]经过测定，提取的牛血液全组DNA样品的浓度为83ng/ μ L。[0046]2、第一次PCR (外引物)反应
以上述抽提得到的DNA为模板，用实施例1中的第一次PCR试剂盒进行扩增。体系为25U L:模板DNA 0.5mL (41.5 ng)、第一次PCR试剂混合物24.5mL (其中包括引物I和引物2各 0.5mL, IOXPfu Buffer 2.5mL、dNTP MixtureC2.5 mmol/L)2.5mL、Pfu DNA Polymerase酶(2.5U/ul) 0.25mL、ddH20 18.25mL)。扩增条件为:94°C 3min，94°C 30s、62.2°C 30s、70°C 15s,30cycles,70°C lmin。
[0047]以无菌水为模板作为阴性对照。
[0048]3、第二次PCR (内引物)反应
取5mL第一次PCR产物稀释100倍作为第二次PCR反应的模板，用实施例1中的第二次PCR试剂盒进行扩增。体系为50 ii L:模板DNA lmL、第二次PCR试剂混合物49mL。扩增条件为:94°C 3min,94°C 30s,61.2°C 30s,70.4°C 15s, 30 cycles, 70.4°C lmin。
[0049]4、分别对第一次PCR和第二次PCR产物进行测序(测序由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成)，扩增产物的测序结果用DNAMAN软件分析，附图中箭头所标位点为导致CN的SNP位点。根据测序图查看牛瓜氨酸血症有害基因携带者突变位点是否有变化，如果测序图中该位点为单峰C (如图1所示，箭头处为突变位点)，则为非瓜氨酸血症有害基因携带者(正常型);如果该位点为双峰，同时含有C和T (如图2所示，箭头处为突变位点)，则为瓜氨酸血症有害基因携带者(杂合子)；如果该位点为单峰T，则为瓜氨酸血症患者(突变型，筛查中未发现此类)。
[0050]统计结果显示，243份样品中，CN正常型238份，CN杂合子5份，CN突变型0份。
[0051]对 比例I利用HRM检测方法检测奶牛瓜氨酸血症
1、材料
(I)试验样本:同实施例2，颈静脉采血法随机采集江苏某隔离场243头荷斯坦奶牛的血液样本5ml/头，并置于真空肝素钠抗凝管中摇匀后用离心管分装每管2ml，-2(TC冻存备用。
[0052]DNA提取方法同实施例2。
[0053](2)试剂及试剂盒
普通Taq酶试剂盒，购自水源生物科技(上海)有限公司；
Gel extraction kit,购自上海捷瑞生物科技有限公司；
100 bp DNA Ladder Marker，购自水源生物科技(上海)有限公司；
Hot start Taq酶试剂盒,购自水源生物科技(上海)有限公司；
EverGreen Q-PCR Mix，购自水源生物科技(上海)有限公司；
T-载体，购自宝生物(大连)生物工程有限公司；
SYBR GREEN I，购自北京普博欣生物科技有限公司。
[0054](3)主要试剂的配制
电泳缓冲液(50 X TAE贮存液):称取Tris 242g，冰乙酸57.lmL，加入IOOmL 0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)，定容至1L，用前以蒸馏水稀释为IX工作液。
[0055]SYBR Green I染料(电泳级)工作液:按1:3的比例配置，取TAE电泳工作缓冲液与 SYBR Green I 染料。
[0056]2、标准质粒的构建采用全基因合成的方法(由上海捷瑞生物科技有限公司合成)，构建CN标准品，突变基因型质粒(T/T型)、野生基因型质粒(G/G型)，再以二者等比例混合做成杂合基因模版(G/T型)。
[0057]3、HRM引物的设计与合成
根据Genbank已发表的CN序列，应用DNAstar软件设计特异性PCR的引物。引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。具体引物如下:
Fl:5’ - AAGGAGTTTGTGGAGGAGTTCATC-3’ ；
Rl: 5’ -GAGAGGTGCCCAGGAGGTATC-3’。
[0058]引物的产物大小为82bp，退火温度为60°C。 [0059]4、HRM检测方法的初步建立
(1)243头荷斯坦奶牛的血液样本DNA的基因型的确定方法为，参照标准质粒的曲线形态来确定。
[0060](2)取I μ L各标准质粒的野生和突变的纯合性及混合质粒DNA分别做模板，按照如下体系进行PCR扩增。PCR体系为30yL，包括15yL的2XMix buffer、5 μ L的dNTP、上下游引物各0.5 μ LU μ L模板DNA、13 μ L的ddH20。
[0061]反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，40个循环，反应在Roche480荧光定量PCR仪上进行，反应结束后进行HRM分析。HRM分析采用Roche480荧光定量PCR仪，检测条件为95°C变性lmin，40°C复性lmin，50°C保持IOs,从50°C开始，以0.01°C /s升温速度采集熔解曲线数据，每秒采集40次数据，至95°C结束荧光米集。
[0062]5、数据分析
采用Roche 480自带的HRM分析软件进行分析。首先对原始熔解曲线进行均一化(normalization)，软件会自动对曲线类型进行分组，具有相同或接近的曲线形态的样品将被归为一组，然后通过软件的差别显示功能显出分组的结果。与已知标准质粒同组的样品即具有该质粒基因类型的基因型。
[0063]结果如附图3和附图4所示，CN基因的正常型(T/T)和突变型(C/C) 二者差异明显。
[0064]统计结果显示，243份样品中，CN正常型238份，CN杂合子5份，CN突变型O份。
[0065]结果与本发明巢式PCR方法结合测序的检测方法所得的结果一致。
[0066]综上所述，本发明利用巢式PCR方法结合测序检测牛瓜氨酸血症有害基因的方法简单、易操作，且准确性高，适合快速、精准、高通量的检测技术的需要。
【权利要求】
1.一种牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物，其特征在于，由引物组A和引物组B组成；所述引物组A由引物I和引物2组成；所述引物组B由引物3和引物4组成；引物I~4的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1~4所示。
2.根据权利要求1所述牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物，其特征在于，所述牛瓜氨酸血症有害基因是精氨酸琥珀酸合成酶基因的第86个氨基酸密码子发生无义突变的基因。
3.根据权利要求1所述牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物，其特征在于，引物I和引物2的摩尔比为1: 1，引物3和引物4的摩尔比为1:1。
4.权利要求1~3所述牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物在巢式PCR法检测牛瓜氨酸血症有害基因方面的应用。
5.一种含有权利要求1~3任一所述牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物的试剂盒。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，包含有如下组分:权利要求1~3任一所述牛瓜氨酸血症有害基因检测的引物组合物、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和灭菌水。
7.权利要求5所述试剂盒在检测牛瓜氨酸血症有害基因方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，检测方法是利用巢式PCR方法进行两次PCR反应，第一次PCR反应的模板为牛血液中的全组DNA，引物为引物组A ;第二次PCR反应的模板为第一次PCR反应产物的稀释液，引物为引物组B ;对PCR产物进行测序，根据测序结果判定是否为牛瓜氨酸血症缺乏症有害基因。
9.根据权利8所述应用，其特征在`于，第一次PCR反应扩增得到精氨酸琥珀酸合成酶基因的一个420bp的片段，如SEQ ID N0.5所示；第二次PCR反应扩增得到精氨酸琥珀酸合成酶基因的一个162bp的片段，如SEQ ID N0.6所示；所述判定的方法为根据测序图查看精氨酸琥珀酸合成酶基因的第86个氨基酸密码子是否发生无义突变来判断，如果测序图中该位点为单峰C,则为非瓜氨酸血症有害基因；该位点为双峰，同时含有C和T,则为牛瓜氨酸血症有害基因。
10.根据权利8或9所述应用，其特征在于，所述第一次PCR反应的扩增体系中各组分的比例为模板:引物1:引物2: PCR反应缓冲液:dNTP: DNA聚合酶:灭菌水=2: 2: 10: 10: I: 73 ； 第二次PCR反应的扩增体系中各组分的比例为模板:引物3:引物4: PCR反应缓冲液:dNTP: DNA 聚合酶:灭菌水=2: 2: 10: 10:1: 73。
【文档编号】C12Q1/68GK103740816SQ201310708022
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】郭霄峰, 吴晓薇, 洪洁心, 代元元 申请人:华南农业大学, 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心