Cug-bp1蛋白或其基因在制备调控治疗肌肉萎缩疾病产品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了CUG-BP1蛋白或其基因在制备调控治疗肌肉萎缩疾病产品中的应用。本发明提供了沉默CUG-BP1蛋白或其编码基因表达的物质在制备治疗肌肉萎缩疾病产品中的应用；所述CUG-BP1蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列7。本发明的实验证明，本发明通过沉默切神经诱导的小鼠肌肉萎缩模型小鼠中CUG-BP1蛋白，发现肌肉萎缩程度降低，说明沉默该蛋白或其编码基因表达可以降低肌肉萎缩，而用于沉默该蛋白或其编码基因表达的物质可以用来制备治疗肌肉萎缩疾病的产品。
【专利说明】CUG-BP1蛋白或其基因在制备调控治疗肌肉萎缩疾病产品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种CUG-BPl蛋白或其基因在制备调控治疗肌肉萎缩疾病产品中的应用。
【背景技术】[0002]骨骼肌是人体最大的组织，骨骼肌的收缩和放松活动是人体运动功能的基础。骨豁肌的基本组成单位是骨豁肌细胞，骨豁肌细胞是一种特殊的多核细胞，呈纤维状，因此俗称骨骼肌纤维。骨豁肌纤维的类型、形态、数量以及代谢状态直接决定其运动能力。肌肉萎缩症(Muscular dystrophy, MD),指一组损坏人体肌肉的疾病。肌肉萎缩症表现为进行性骨骼肌萎缩，肌肉蛋白质缺失，和肌肉细胞或组织的死亡。随着肌肉萎缩发病率的逐年上升，受关注度也在不断提升。
[0003]肌肉萎缩可以分为不同的类型:(1)按发病机理分类:由全身营养障碍，废用，内分泌异常而引起的肌肉变性，肌肉结构异常等病因产生的肌肉萎缩；遗传、中毒、代谢异常、感染、变态反应等引起的肌肉萎缩。(2)根据肌肉萎缩分布分类:全身弥漫性肌肉萎缩；头面部肌肉萎缩；头和上肢或上下肢近端肌肉萎缩；上下肢远端肌肉萎缩；限局性肌肉萎缩。
[3]根据导致肌肉萎缩的原发病变分类:神经原性肌肉萎缩；肌原性肌肉萎缩；废用性肌肉萎缩。
[0004]肌肉萎缩作为一种常见疾病(并发症)，肌肉萎缩治疗性研究一直为人们所关注。在康复医学领域，运动锻炼已被普遍采用。它在很大程度上对肌肉萎缩起到积极的预防和治疗作用。但是，对于一些体弱、长期卧床或肢体固定的患者，由于受身体状况等因素的影响，自身活动受限，无法实现有效的运动锻炼，最终还是不可避免会导致骨骼肌萎缩的发生。当运动锻炼不能有效克服骨骼肌萎缩时，探索生物技术干预手段来实现有效预防和治疗就显得十分必要。
[0005]目前，利用现代生物技术治疗肌肉萎缩方面已经取得一些进展。例如:
[0006](I)神经干细胞移植延缓失神经肌肉萎缩；(2)近年来，Duchenne型肌营养不良患者治疗领域有了新的进展，方法学上有所创新:外显子剪接(exon skipping)治疗。
[0007]RNA结合蛋白(RNA binding protein)是一类通过结合特定RNA序列，调控pre-mRNA剪接的多家族、多形式的蛋白因子。通过pre-mRNA选择性剪接,单一的pre-mRNA可以形成不同的成熟mRNA，从而发挥不同功能。最近的研究发现大约92-94%人类基因存在选择性剪接(Kwan et al.2008 ；ffang et al.2008)。同DNA转录一样，基因选择性剪接是基因表达调控的一个重要层次。CUG-BP1 (cytosine-uridineguanine-binding proteinl)是一重要的RNA结合蛋白，通过结合富含UG的pre-mRNA序列,调控RNA稳定性(stability)、翻译(translation)以及剪接(splicing)等过程(Barreau et al.2006)。
[0008]切神经诱导肌肉萎缩小鼠模型可以模拟临床上偏瘫、截瘫、脊髓损伤、运动神经损伤或肿瘤压迫运动神经造成的肌肉萎缩。尾部悬吊诱导肌肉萎缩的小鼠模型，模拟了长期卧床、废用、宇航员失重引起的肌肉萎缩。
【发明内容】
[0009]本发明的一个目的是提供沉默CUG-BPl蛋白或其编码基因表达的物质的应用。
[0010]本发明提供的沉默CUG-BPl蛋白或其编码基因表达的物质在制备治疗肌肉萎缩疾病产品中的应用；所述CUG-BPl蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列10。
[0011]上述应用中，所述沉默CUG-BPl蛋白或其编码基因表达的物质为如下I)-3)中任一种:
[0012]1) shRNAl 或 shRNA2 ；
[0013]2)编码shRNAl的DNA分子或编码shRNA2的DNA分子；
[0014]3)含有编码shRNAl的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
[0015]或含有编码shRNA2的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
[0016]所述shRNAl的核苷酸序列为序列表中的序列I ;
[0017]所述shRNA2的核苷酸序列为序列表中的序列4。
[0018]上述应用中，所述含有编码shRNAl的DNA分子的重组载体为将所述编码shRNAl的DNA分子插入表达载体中得到的重组载体；
[0019]所述含有编码shRNA2的DNA分子的重组载体为将所述编码shRNAl的DNA分子插入表达载体中得到的重组载体。
[0020]上述应用中，所述表达载体为pSIREN-RetroQ。
[0021 ] 上述应用中，所述编码shRNAl的DNA分子为由单链DNA分子I和单链DNA分子2退火得到的双链DNA分子；
[0022]所述编码shRNA2的DNA分子为由单链DNA分子3和单链DNA分子4退火得到的双链DNA分子；
[0023]所述单链DNA分子1的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；
[0024]所述单链DNA分子2的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；
[0025]所述单链DNA分子3的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；
[0026]所述单链DNA分子4的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；
[0027]所述CUG-BPl蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列11。
[0028]上述应用中，所述产品为药物。
[0029]上述应用中，所述肌肉萎缩由神经损伤引起的肌肉萎缩。
[0030]本发明的另一个目的是提供一种沉默CUG-BPl蛋白或其编码基因表达的物质。
[0031]本发明提供的物质，为如下1) -3)中任一种:
[0032]1) shRNAl 或 shRNA2 ；
[0033]2)编码shRNAl的DNA分子或编码shRNA2的DNA分子；
[0034]3)含有编码shRNAl的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
[0035]或含有编码shRNA2的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
[0036]所述shRNAl的核苷酸序列为序列表中的序列1 ;
[0037]所述shRNA2的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；
[0038]所述CUG-BPl蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列10。[0039]上述物质中，所述含有编码shRNAl的DNA分子的重组载体为将所述编码shRNAl的DNA分子插入表达载体中得到的重组载体；
[0040]所述含有编码shRNA2的DNA分子的重组载体为将所述编码shRNAl的DNA分子插入表达载体中得到的重组载体。
[0041]上述物质中，所述表达载体为pSIREN-RetroQ。
[0042]上述物质中，所述编码shRNAl的DNA分子为由单链DNA分子I和单链DNA分子2退火得到的双链DNA分子；
[0043]所述编码shRNA2的DNA分子为由单链DNA分子3和单链DNA分子4退火得到的双链DNA分子；
[0044]所述单链DNA分子I的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；
[0045]所述单链DNA分子2的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；
[0046]所述单链DNA分子3的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；
[0047]所述单链DNA分子4的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；
[0048]所述CUG-BPl蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列11。
[0049]上述CUG-BPl蛋白或其编码基因作为靶点在开发、设计或制备具有治疗肌肉萎缩疾病功能的产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0050]本发明的实验证明，本发明通过沉默切神经诱导的小鼠肌肉萎缩模型小鼠中CUG-BPl蛋白，发现肌肉萎缩程度降低，说明沉默该蛋白或其编码基因表达可以降低肌肉萎缩，而用于沉默该蛋白或其编码基因表达的物质可以用来制备治疗肌肉萎缩疾病的产品。
【专利附图】
【附图说明】
[0051]图1为切神经诱导的小鼠肌肉萎缩模型中CUG-BPl蛋白表达检测结果图
[0052]图2为基因沉默CUG-BPl减轻肌肉萎缩程度。
【具体实施方式】
[0053]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0054]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0055]本实验所用动物及实验过程获得中国科学院生物物理所实验动物的使用和护理委员会的认证许可。出生八周、体重约为21g的雄性C57BL/6小鼠购自维通利华实验动物公司。
[0056]CUG-BPl蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列10，其编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列11。
[0057]实施例1、CUG-BPl蛋白或其基因在调控治疗肌肉萎缩疾病中的应用
[0058]一、切神经小鼠肌肉萎缩模型的构建
[0059]小鼠腹腔注射0.1ml5%水合氯醛麻醉，后肢表皮除毛，皮肤表面用75%乙醇擦拭消毒。将小鼠两后肢用胶布固定，在后肢内侧表皮剪开2-3mm切口，钝性分离表皮及骨骼肌组织，直至暴露后肢总运动神经簇。将总运动神经簇剪除2-3_的一段，随后立即缝合肌肉组织和表皮组织，得到切神经小鼠肌肉萎缩模型。对照组小鼠，同样暴露但不损伤后腿总运动神经簇，缝合肌肉及表皮。[0060]在切除小鼠后肢运动神经后的第3，7，10，14天收集模型萎缩的肌肉样本及对照组小鼠样本。
[0061]取20mg小鼠肌肉样本，在含1%β -巯基乙醇和2%SDS样品缓冲液中充分打碎匀衆。匀衆后的蛋白样品放于80°C加热5min, 12000rpm离心5min。取上清液加样于10%含
0.1%SDS的变性聚丙烯酰胺凝胶，设置20mA横流电泳。
[0062]电泳后将丙烯酰胺凝胶铺于硝酸纤维素(NC)薄膜上，胶和膜的两边各垫三张滤纸，以丙烯酰胺凝胶靠近负极、NC薄膜靠近正极的方式放置于电转槽中。将转膜槽置于冰水浴中，设置300mA衡流电转2小时。
[0063]转膜结束后将NC膜按分子量横向切开，放置于含有5%脱脂奶粉的TBST溶液中封闭I小时。封闭结束后，用TBST溶液洗膜3遍，每遍5min。洗膜结束后，用含有1%BSA和
0.01%NaN3 的 TBST 溶液稀释一抗(Ant1-CUG-BPl，Eptomics ；Ant1-GAPDH, Invitrogen)。NC膜放于一抗中4°C孵育过夜。用TBST溶液洗膜4遍，每遍lOmin。用含有5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭30min。以1:5000的稀释倍数稀释二抗，将膜放置于含有二抗的TBST封闭液里室温孵育I小时。用TBST溶液洗膜4遍，每遍lOmin。洗膜结束后，配置ECL显影底物溶液，按1:1的比例混合底物液。将底物溶液滴加在NC膜上，将膜迅速封于塑料保鲜膜中并固定于显影暗盒中。在暗室中将X-ray胶片压于显影暗盒中，显影5-10min。依次在显影液和定影液中显影和定影，室温晾干胶片。
[0064]室温晾干的X-ray胶片用Cannon super G3扫描仪扫描。用NIH imageJ的Analyze-gels功能进行蛋白条带面积和灰度积分计算。计算得到的蛋白表达量由同一个样品的GAPDH蛋白量作为内参进行标准化。
[0065]结果如图1所示，A为WB (western blot)分析表明CUG-BP1蛋白表达(control为对照组小鼠，3，7，10，14天为第3，7，10，14天收集切神经小鼠肌肉萎缩模型小鼠萎缩的肌肉样本);B,对A的统计结果(con为对照组小鼠，DenD3，DenD7为第3，7天收集切神经小鼠肌肉萎缩模型小鼠萎缩的肌肉样本)；可以看出，与对照组小鼠相比，切神经小鼠肌肉萎缩模型中CUG-BPl蛋白表达在萎缩发生后明显升高。
[0066]二、基因沉默转基因小鼠的制备
[0067]1、用于基因沉默的重组载体的构建
[0068]利用BLOCK-1TtmRNAi Designer(http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/)设计两个小鼠CUG-BPl基因沉默shRNA载体，具体如下:
[0069]合成沉默用RNA的基因序列:
[0070]shRNA-Ι 的核苷酸序列为 GCUCAAACGUUCGAAGAA (序列 I);
[0071 ] 编码shRNA-Ι的DNA分子由单链DNA分子I和单链DNA分子2退火得到的双链DNA分子；
[0072]单链DNA 分子 I 的核苷酸序列为 5’GATCACGCGT GCTCAAACGTTCGAAGAA TTCAAGAGATTCTTCGAACGTTTGAGC TTTTTTG3 ’(序列 2)
[0073]单链DNA 分子 2 的核苷酸序列为:5’ AATTCAAAAAA GCTCAAACGTTCGAAGAATCTCTTGAA TTCTTCGAACGTTTGAGC ACGCGT3’(序列 3)
[0074]shRNA-2 的核苷酸序列为 GAGCCAACCUGUUCAUCUA (序列 4)，
[0075]编码shRNA-Ι的DNA分子由单链DNA分子3和单链DNA分子4退火得到的双链DNA分子；
[0076]单链DNA分子 3 的核苷酸序列为 5’GATCACGCGT GAGCCAACCTGTTCATCTA TTCAAGAGATAGATGAACAGGTTGGCTC TTTTTTG3> (序列 5)
[0077]单链DNA 分子 4 的核苷酸序列为:5’ AATTCAAAAAA GAGCCAACCTGTTCATCTATCTCTTGAA TAGATGAACAGGTTGGCTC ACGCGT3’(序列 6)
[0078]eGFP 的核苷酸序列为 5’ -AAAGGACGGAGGACATTAT-3’(序列 7)。
[0079]编码eGFP的DNA分子也可以为由单链DNA分子5和单链DNA分子6退火得到的双链DNA分子；
[0080]单链DNA分子 5 的核苷酸序列为 5，GATCACGCGT AAAGGACGGAGGACATTAT TTCAAGAGAATAATGACCTCCGTCCTTT TTTTTTG3 ’(序列 8)
[0081]单链DNA 分子 6 的核苷酸序列为:5’ AATTCAAAAAA AAAGGACGGAGGACATTATTCTCTTGAA ATAATGACCTCCGTCCTTT ACGCGT3’(序列 9)
[0082]上述DNA寡聚核苷酸为上海生物工程公司合成。
[0083]I)重组干扰载体
[0084]重组干扰载体为将沉默CUG-BPl基因的RNA的基因克隆入pSIREN-RetroQ载体(购自Clontech，产品目录号为631526，其中CMV启动子驱动下表达的红色荧光蛋白可作为质粒转化的指示)，在U6启动子驱动下表达,具体如下:
[0085]将编码DNA分子I和DNA分子2溶解于适量IOmM TE (pH8.0)溶液中，终浓度为50uM。正向与反向DNA寡聚核苷酸在DNA退火缓冲液(IOuM Tris-HCllOOmM NaCllmMEDTAPH7.5)中稀释，至终浓度为5uM。加热至95°C 5min，l°C/min，缓慢降温至室温，得到退火产物。取IuL退火产物通过T4DNA连接酶克隆入经BamH I和EcoR I酶切回收的pSIREN-RetroQ载体。在卡那霉素平板筛选转化链接产物的DH5细菌。挑取克隆斑，摇菌，提取质粒，通过MluI和AgeI酶切鉴定(得到680bp片段的为阳性)，得到重组干扰载体pSIREN-RetroQ-shRNA-Ι。
[0086]按照上述的方法，将DNA分子3和DNA分子4退火后，连入pSIREN-RetroQ载体，得到重组干扰载体pSIREN-RetroQ-shRNA-2 (MluI和AgeI酶切鉴定，得到680bp片段的为阳性)。
[0087]2)对照重组载体
[0088]按照上述的方法，将DNA分子5和DNA分子6退火后，连入pSIREN-RetroQ载体，
[0089]按照上述的方法，将DNA分子5和DNA分子6退火后，连入pSIREN-RetroQ载体，得到克隆入pSIREN-RetroQ，构建对照载体pSIREN-RetroQ-eGFP (MluI和AgeI酶切鉴定，得到680bp片段的为阳性)。
[0090]2、电击法转化外源质粒DNA入FDB肌肉组织
[0091]小鼠脚掌FDB (Flexor digitorum brevis)肌肉组织电激转化外源质粒DNA的方法是参照Di Franco, Μ.等人的文献进行，将上述I制备的重组干扰载体pSIREN-RetroQ-shRNA-1、pSIREN-RetroQ-shRNA-2 和对照载体 pSIREN-RetroQ-eGFP，均电击导入切神经小鼠肌肉萎缩模型小鼠的脚掌FDB肌肉组织。
[0092]具体如下:
[0093]体重2Ig小鼠腹腔注射0.1ml5%水合氯醛麻醉。用针头直径为0.33mm(29.5gauge)的胰岛素注射器向小鼠脚掌皮下组织注射30μ 12mg/ml透明质酸酶。将小鼠放回鼠笼中，等候I小时。用胰岛素注射器将20 μ g(体积不超过40 μ I)质粒注射进小鼠脚掌皮下组织。轻轻揉捏小鼠脚掌lOmin，以保证含有质粒DNA的溶液在骨骼肌组织中扩散均匀，充分。将用电极固定于小鼠脚掌两端。按照下列电脉冲参数由程控电刺激器对小鼠脚掌电击:
[0094]电脉冲波形:方波；电压强度:100volts/cm ；电脉冲时程:20ms ；电脉冲频率:IHz ;重复次数:20。
[0095]电击结束后将小鼠放回鼠笼中，得到转基因小鼠。
[0096]上述I制备的重组干扰载体pSIREN-RetroQ-shRNA-Ι转入切神经小鼠肌肉萎缩模型小鼠，得到基因沉默转shRNA-Ι小鼠；
[0097]上述I制备的重组干扰载体pSIREN-RetroQ-shRNA-2转入切神经小鼠肌肉萎缩模型小鼠，得到基因沉默转shRNA-2小鼠；
[0098]上述I制备的对照载体pSIREN-RetroQ-eGFP转入切神经小鼠肌肉萎缩模型小鼠，得到对照转基因小鼠。
[0099]3、鉴定[0100]将上述2得到的3种转基因小鼠腹腔注射0.1ml5%水合氯醛麻醉，切除小鼠脚掌皮肤，钝性分离FDB肌肉组织。
[0101]取20mg小鼠肌肉样本，在含1%β -巯基乙醇和2%SDS样品缓冲液中充分打碎匀衆。匀衆后的蛋白样品放于80°C加热5min, 12000rpm离心5min。取上清液加样于10%含
0.1%SDS的变性聚丙烯酰胺凝胶，设置20mA横流电泳。
[0102]电泳后将丙烯酰胺凝胶铺于硝酸纤维素(NC)薄膜上，胶和膜的两边各垫三张滤纸，以丙烯酰胺凝胶靠近负极、NC薄膜靠近正极的方式放置于电转槽中。将转膜槽置于冰水浴中，设置300mA衡流电转2小时。
[0103]转膜结束后将NC膜按分子量横向切开，放置于含有5%脱脂奶粉的TBST溶液中封闭I小时。封闭结束后，用TBST溶液洗膜3遍，每遍5min。洗膜结束后，用含有1%BSA和
0.01%NaN3 的 TBST 溶液稀释一抗(Ant1-CUG-BPl，Eptomics ；Ant1-GAPDH, Invitrogen)。NC膜放于一抗中4°C孵育过夜。用TBST溶液洗膜4遍，每遍lOmin。用含有5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭30min。以1:5000的稀释倍数稀释二抗，将膜放置于含有二抗的TBST封闭液里室温孵育I小时。用TBST溶液洗膜4遍，每遍lOmin。洗膜结束后，配置ECL显影底物溶液，按1:1的比例混合底物液。将底物溶液滴加在NC膜上，将膜迅速封于塑料保鲜膜中并固定于显影暗盒中。在暗室中将X-ray胶片压于显影暗盒中，显影5-10min。依次在显影液和定影液中显影和定影，室温晾干胶片。
[0104]如图2C 所示，Denerv.+Con-shRNA 为对照转基因小鼠，Denerv.+GUG-BPlshRNAl为基因沉默转shRNA-Ι小鼠，看出，与对照组(eGFP)相比，基因沉默转shRNA-Ι小鼠中的CUG-BPl蛋白表达明显降低。
[0105]基因沉默转shRNA-2小鼠中的CUG-BPl蛋白表达与基因沉默转shRNA_l小鼠一样均明显降低。三、基因沉默转基因小鼠的的肌肉组织研究
[0106]利用小鼠骨骼肌成像计算肌纤维横截面积的分布，具体如下:
[0107]转基因10天后分别将基因沉默转shRNA-Ι小鼠、基因沉默转shRNA_2小鼠、对照转基因小鼠和切神经小鼠肌肉萎缩模型小鼠剥离FDB肌肉组织，用Leca SP5共聚焦显微镜，在543nm激光下激发DsRed蛋白红色荧光。对FDB肌肉组织扫描成像。长度标尺由显微镜成像软件自动计算生成。
[0108]肌纤维的宽度用NIH imagej软件先计算成像素单位,然后换算为μ m2为单位的面积单位。数据录入到Excel软件中，统计实验对照组与CUG-BPl基因沉默组肌纤维直径的变化。实验重复3次，结果取平均值土标准差。
[0109]结果如图2A所示，激光共聚焦成像分析FDB肌肉纤维细胞，可以看出，与切神经小鼠肌肉萎缩模型小鼠(Den+DsRed)相比，基因沉默转shRNA-Ι小鼠(Den+RNAi+CUGBPl)的FDB肌纤维细胞萎缩程度明显降低；
[0110]具体统计如图2B所示，为对A的统计结果；切神经小鼠肌肉萎缩模型小鼠(Den+DsRed) FDB肌纤维直径为24.8±0.9微米；基因沉默转shRNA-Ι小鼠(Den+RNAi+CUGBPl)肌纤维直径为 29.7±0.6 微米；
[0111]转ShRNA-2小鼠中的FDB肌纤维细胞萎缩程度与转shRNA_l小鼠结果无显著差异，与切神经小鼠肌肉萎缩模型小鼠(Den+DsRed)相比，一样均明显降低。
[0112]上述结果表明 基因沉默转shRNA-Ι小鼠、转shRNA-2小鼠均明显抑制肌肉萎缩。
【权利要求】
1.沉默CUG-BPl蛋白或其编码基因表达的物质在制备治疗肌肉萎缩疾病产品中的应用；所述CUG-BPl蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列10。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于: 所述沉默CUG-BPl蛋白或其编码基因表达的物质为如下I)-3)中任一种:
1)shRNAl 或 shRNA2 ； 2)编码shRNAl的DNA分子或编码shRNA2的DNA分子； 3)含有编码shRNAl的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 或含有编码shRNA2的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述shRNAl的核苷酸序列为序列表中的序列I ; 所述shRNA2的核苷酸序列为序列表中的序列4。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于: 所述含有编码shRNAl的DNA分子的重组载体为将所述编码shRNAl的DNA分子插入表达载体中得到的重组载体； 所述含有编码shRNA2的DNA分子的重组载体为将所述编码shRNAl的DNA分子插入表达载体中得到的重组载体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述表达载体为pSIREN-RetroQ。
5.根据权利要求2-4中任一所述的应用，其特征在于:所述编码shRNAl的DNA分子为由单链DNA分子I和单链DNA分子2退火得到的双链DNA分子； 所述编码shRNA2的DNA分子为由单链DNA分子3和单链DNA分子4退火得到的双链DNA分子； 所述单链DNA分子I的核苷酸序列为序列表中的序列2 ； 所述单链DNA分子2的核苷酸序列为序列表中的序列3 ； 所述单链DNA分子3的核苷酸序列为序列表中的序列5 ； 所述单链DNA分子4的核苷酸序列为序列表中的序列6 ； 所述CUG-BPl蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列11。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于:所述产品为药物。
7.一种沉默CUG-BPl蛋白或其编码基因表达的物质，为如下I)-3)中任一种:
1)shRNAl 或 shRNA2 ； 2)编码shRNAl的DNA分子或编码shRNA2的DNA分子； 3)含有编码shRNAl的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 或含有编码shRNA2的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述shRNAl的核苷酸序列为序列表中的序列I ; 所述shRNA2的核苷酸序列为序列表中的序列4 ； 所述CUG-BPl蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列10。
8.根据权利要求7所述的物质，其特征在于: 所述含有编码shRNAl的DNA分子的重组载体为将所述编码shRNAl的DNA分子插入表达载体中得到的重组载体； 所述含有编码shRNA2的DNA分子的重组载体为将所述编码shRNAl的DNA分子插入表达载体中得到的重组载体。
9.根据权利要求8所述的物质,其特征在于:所述表达载体为pSIREN-RetroQ； 所述编码shRNAl的DNA分子为由单链DNA分子I和单链DNA分子2退火得到的双链DNA分子； 所述编码shRNA2的DNA分子为由单链DNA分子3和单链DNA分子4退火得到的双链DNA分子； 所述单链DNA分子I的核苷酸序列为序列表中的序列2 ； 所述单链DNA分子2的核苷酸序列为序列表中的序列3 ； 所述单链DNA分子3的核苷酸序列为序列表中的序列5 ； 所述单链DNA分子4的核苷酸序列为序列表中的序列6 ； 所述CUG-BPl蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列11。
10.CUG-BPl蛋白或其编码基因作为靶点在开发 、设计或制备具有治疗肌肉萎缩疾病功能的产品中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103705945SQ201310731175
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】王会文, 姬广聚, 唐迎龙 申请人:中国科学院生物物理研究所