一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用荧光PCR技术定量检测Epstein-Barr病毒（EBV）核酸的试剂盒。它采用一对引物扩增EBV特异性核酸序列，并通过荧光探针定量检测EBVDNA；同时用人内源性基因特异性引物和荧光探针检测内参照DNA。本发明通过单管双波长荧光PCR技术同时检测EBV和内参照核酸的存在，能定量检测全血、血浆、鼻咽分泌物样品中EBVDNA，通过内参照核酸的检测结果判断样品是否存在PCR抑制剂或检测误操作引起的模板丢失。试剂盒操作简便快速、定量结果灵敏准确，可广泛应用于临床EBV病毒感染的定量检测。
【专利说明】—种含内参照的高灵敏Epste i n-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种含内参照的Epstein-Barr病毒(EBV)单管双波长荧光定量PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]Epstein-Barr病毒(EBV)是英国病毒学家于1964年从Burkitt淋巴瘤细胞系中分离到的病毒，为疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的DNA病毒。它在人群中具有广泛的传染性，传播途径主要为唾液，也可经输血传染，大多数人的初次感染发生在幼儿时期，且多数感染后无明显症状，或引起轻症咽炎和上呼吸道感染，但终生携带病毒，据研究95%以上成人有该病毒携带。本病毒是传染性单核细胞增多症的病原，尤为重要的是，由于它与在我国南方发病率相当高的鼻咽癌以及非洲儿童淋巴瘤、的发生有密切的相关性，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。当机体免疫功能低下时，潜伏在体内淋巴组织中的EBV再度活跃而形成复发感染，临床症状以发热、咽喉痛、肝脾和淋巴结肿大、外周血淋巴细胞增多并出现单核样异型淋巴细胞等为其特征。由于其症状、体征的多样化和不典型病例在临床上逐渐增多，给诊断治疗带来一定困难。因此，准确的检测EBV感染，以区别其它感染原因(巨细胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、风疹病毒均可有类似症状)所致疾病，就显得非常重要。
[0003]目前临床上检测EBV的方法有病毒分离、血清学试验、抗体检测、荧光定量PCR等。对于EBV急性感染如传染性单核细胞增多症，最早出现于临床标本中的是病原体本身，采用实时荧光PCR进行检测全血、血浆等类型标本，可以在感染的早期明确病因，相对其它检测方法具有检测窗口期短的优势；对鼻咽癌患者样本进行荧光PCR检测还能对病毒核酸进行定量分析，具有检测灵敏度高、特异性强的优点(Jebbink J et al, J MolDiagn, 2003，5:15-20 ;曹素梅等，癌症，2002，21:328-329)。 但是目前用于EBV荧光定量检测的方法均没有使用内参照监控核酸提取扩增中可能的PCR抑制物(Hill CE et al,Am J Clin Pathol，2006，125:665-67 ;刘涤瑕等，现代检验医学杂志，2009，24:93-95 ;专利CN201110165106、CN201110373390、CN201110177104)，当全血、血浆或鼻咽拭子中的 PCR 抑制物带入扩增反应检测时，容易造成病毒核酸定量结果不准备甚至出现“假阴性”现象，影响病毒感染后的药物治疗。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种单管检测Epstein-Barr病毒(EBV)核酸的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒反应体系同时采用一对EBV特异性引物和荧光探针、一对内参照特异性引物和荧光探针，EBV上下游引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列，EBV荧光探针具有SEQ ID NO:3序列且其5’端标记FAM荧光基团；内参照上下游引物具有SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5的序列，内参照荧光探针具有SEQ ID NO:6序列且其5’端标记HEX或JOE或VIC荧光基团；上述引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。本发明引入的内参照可以用于监控PCR扩增中可能的反应抑制物或从提取到或者全过程的误操作，可通过稀释提取的模板或改进样本处理方法复检获得正确结果，从而避免检测结果出现假阴性的作用，确定样本是否存在EBV病毒核酸和准确载量，适合临床推广使用。
[0005]技术方案
通过对GenBank中EBV病毒和人内源性管家(House-keeping)基因序列查询,用VectorNTI,Oligo等软件对各种来源的基因序列进行比对设计，按照TaqMan荧光PCR设计的原则，优选了一对EBV特异性引物和荧光探针扩增EBV中高度保守、多拷贝重复基因(BamH1-W)上的 115bp 片段，一对人 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因特异性引物和荧光探针扩增其保守区域144bp片段，6条引物和探针核苷酸序列(5’ -> 3’)如下:
EBV 上游引物:CCCATAgACTCCCATgTAAgC，序列记为 SEQ ID NO:1。
[0006]EBV 下游引物=CCCTggACATCTggACAAAg，序列记为 SEQ ID NO:2。
[0007]EBV 荧光探针=CgAgTAggTgCCTCCAgAgCC，序列记为 SEQ ID NO:3，其中探针 5’ 端标记 FAM (6-carboxy-fluorescein)突光基团、3’端标记 TAMRA (5-Carboxy-tetramethyl-rhodamine)或 BHQ-1 (Black hole quencher I)淬灭基团。
[0008]内参照上游引物=TgCTTTTAACTCTggTAAAgTgg，序列记为SEQ ID NO:4。
[0009]内参照下游引物:ATgACAAgCTTCCCgTTCTC，序列记为SEQ ID NO:5。
[0010]内参照荧光探针:TTgTTgCCATCAATgACCCCTTCA，序列记为SEQ ID NO:6，其中探针5 ’ 端标记 JOE (5-dichloro-dimethoxy-fluorescein)或 HEX (5-hexachloro-fIuorescein)或VIC荧光基团、3’端标记TAMRA或BHQ-1淬灭基团。
[0011]EBV检测靶序列选择病毒基因组中的多拷贝重复序列基因，有利于提高试剂盒检测灵敏度；上述引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。
[0012]所述扩增反应体系各成分组成如下:10mM Tris-HCl (pH8.3)、50mM KC1、0.2mMdNTPs、1.5~5 mM MgCl2、各0.1~0.5μΜ EBV和内参照引物和荧光探针(SEQ ID NO:1 ~6)、1~5 U Taq DNA聚合酶和0.01~I U UNG酶，提取的模板10 μ 1，总反应体积30 μ I。更具体的，扩增反应液各成分终浓度为:Tris-HCl (pH8.3)10 mM、KCl 50 mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2 mM、MgCl2 3.5 mM、EBV引物和荧光探针各0.3 μ M、内参照引物和荧光探针各 0.15 μ M、Taq DNA 聚合酶 2 U、UNG 酶 0.5 U。
[0013]所述EBV荧光定量PCR试剂盒使用扩增程序如下:50°C 2min、94°C 5min后按照94°C 10sec、60°C 45sec循环扩增45次，循环步骤中60°C时采集FAM和JOE波长荧光信号。
[0014]所述EBV荧光定量PCR试剂盒包括I个阴性对照、5个线性梯度浓度的EBV核酸定量校准品，5 个校准品 EBV 浓度分别为 2.0xlO7 copy/ml、2.0xlO6 copy/ml>2.0xlO5 copy/ml、2.0xlO4 copy/ml,2.0xlO3 copy/ml，校准品为含有EBV病毒扩增片段的人工构建培养的假病毒，这5个呈浓度梯度的校准品在使用时用于制备EBV DNA定量标准曲线。
[0015]所述EBV荧光定量PCR试剂盒还包括基于磁珠法核酸梯度的病毒DNA提取试剂，在核酸提取仪上实现样本核酸自动化提取。
[0016]通过上述设计优选获得的一对EBV引物和荧光探针、一对内参照引物和荧光探针，本发明提供了实时荧光定量PCR检测的试剂盒，优化了 PCR反应体系和扩增程序。当然本研究领域技术人员根据荧光PCR的一般要求可以调整PCR反应体系和程序，也同样能实现检测的目的。
[0017]有益效果
本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成EBV核酸荧光PCR定量检测试剂盒，其主要特点如下:
(I)设计的EBV引物探针检测病毒中的多拷贝重复序列基因，提高了试剂盒检测灵敏度。
[0018](2)引入的内参照能监控反应体系中是否存在因PCR抑制物等引起的假阴性，可以避免检测结果不准确造成的误诊。
[0019](3)试剂盒使用了非竞争性内参，EBV和内参照基因序列特异、两种荧光探针采用不同荧光基团标记，荧光信号之间不会相互干扰，保证了检测特异性。
[0020](4)扩增体系中的dUTP - UNG酶系统更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。
[0021 ] (5)试剂盒采用磁珠法自动化提取样本核酸、单管同时检测EBV和内参照，操作简便快速，可在2小时内报告检测结果。
[0022]试剂盒的上述特点，均为采用特异性设计的EBV和内参照引物探针并与荧光PCR技术组合应用而直接引起。从原理上说，本发明试剂盒在EBV病原体临床样本检测中通过对实时荧光PCR扩增两个通道荧光信号的分析，判断EBV核酸特异性片段的存在和病毒载量，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于临床EBV病毒感染的定量检测。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0024]实施例1:EBV核酸荧光PCR定量检测试剂盒引物探针的设计
根据NCBI GenBank数据库中查询的EBV、GAPDH基因序列，采用Vector NT1、01igo等引物设计软件，优选获得的引物探针序列如表1所示，EBV引物扩增的是该病毒BamH1-W基因上115bp片段、内参照引物扩增的是人GAPDH基因上的144bp片段。
[0025]表1设计的试剂盒EBV和内参照检测弓丨物探针
【权利要求】
1.一种单管检测Epstein-Barr病毒(EBV)核酸的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒反应体系同时采用一对EBV特异性引物和荧光探针、一对内参照特异性引物和荧光探针，EBV上下游引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列，EBV荧光探针具有SEQ ID NO:3序列且其5’端标记FAM荧光基团；内参照上下游引物具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的序列，内参照荧光探针具有SEQ ID NO:6序列且其5’端标记JOE或HEX或VIC荧光基团；上述引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。
2.如权利要求1所述的EBV荧光定量PCR试剂盒，所述扩增反应体系各成分组成如下:IOmM Tris-HCl (pH8.3)、50mM KC1、0.2mM dNTPs、1.5~5 mM MgCl2、各 0.I ~0.5 μ M 具有上述SEQ ID NO:1~6序列的EBV和内参照引物和荧光探针、I~5 U Taq DNA聚合酶和0.01~I U UNG酶，提取的模板10 μ 1，总反应体积30 μ I。
3.如权利要求1所述的EBV荧光定量PCR试剂盒，更具体地，其扩增反应液各成分终浓度为:Tris-HCl (pH8.3) 10 mM, KCl 50 mM，dATP、dGTP、dVP、dUTP 各 0.2 mM, MgCl2 3.5mM，EBV引物和荧光探针各0.3 μ M，内参照引物和荧光探针各0.15 μ M,Taq DNA聚合酶2U, UNG 酶 0.5 U。
4.如权利要求1所述的EBV荧光定量PCR试剂盒，使用的扩增程序如下:50°C2min、94°C 5min后按照94°C 10sec、60°C 45sec循环扩增45次，循环步骤中60°C时采集FAM和JOE波长荧光信号。
5.如权利要求1所述的试剂盒，包括I个阴性对照、5个浓度梯度的EBV核酸定量校准品，5 个校准品 EBV 浓度分别为 2.0xlO7 copy/ml>2.0xlO6 copy/ml>2.0xlO5 copy/ml、2.0xlO4 copy/ml、2.0xlO3 copy/ml。
6.如权利要求1所述的试剂盒，还包括病毒DNA提取试剂。
【文档编号】C12Q1/70GK103642945SQ201310742857
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】吴大治, 夏懿, 吴梅 申请人:上海星耀医学科技发展有限公司, 上海复星医药（集团）股份有限公司