用于敲低dll4的小分子干扰rna、重组载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于敲低DLL4的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒和宿主细胞及其应用，所述小分子干扰RNA具有与翻译Notch配体蛋白DLL4的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。本发明提供的重组慢病毒载体能在宿主细胞内稳定、长期地转录得到DLL4-shRNA；本发明提供的DLL4-shRNA经过宿主细胞加工后可生成能沉默DLL4表达的小分子干扰RNA；本发明提供的小分子干扰RNA能靶向Notch配体蛋白DLL4的mRNA，并导致所述mRNA降解，并导致基因沉默效应，降低DLL4的表达水平。
【专利说明】用于敲低DLL4的小分子干扰RNA、重组载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学、基因工程技术以及生物医药领域，具体涉及一种用于敲低DLL4的小分子干扰RNA、重组载体及其应用。
【背景技术】
[0002]Notch配体又被称为DSL蛋白，脊椎动物的Notch配体包括两类，Delta like和Jagged 两类，前者包括 DLLl、DLL3、DLL4，后者包括 Jaggedl 和 Jagged2。其中，DLL4(Deltalike4)是一种含保守分子结构的跨膜蛋白，在血管发育中起着重要的作用，研究发现阻断DLL4/Notch信号通路是一种很有希望的癌症治疗方法，而研究DLL4在DLL4/Notch信号通路中的作用有必要提供一种敲低DLL4的表达水平的方法以及稳定敲低DLL4的表达水平的细胞系。
[0003]RNA干扰(RNA interference, RNAi)可诱发的基因沉默。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种降低目标蛋白表达水平的有效途径。
[0004]因此，有必要提供一种采用RNA干扰技术对DLL4进行基因沉默的方法以及一种稳定敲低DLL4的表达水平的细胞系。
【发明内容】
[0005]为解决上述问题，本发明提供了一种用于敲低DLL4的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒和宿主细胞及应用。
[0006]本发明提供的小分子干扰RNA能直接特异性靶向DLL4的mRNA并导致mRNA降解，产生基因沉默效应；本发明提供的shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒能通过促使宿主细胞中DLL4的mRNA降解间接地沉默DLL4的表达，降低DLL4的表达水平。
[0007]本发明涉及的英文缩写及其中文释义如下:
[0008]DLL4 =Notch 配体蛋白的一种，所述 DLL4 的 Genebank 登录号为 ΝΜ_019074.3 ；
[0009]mRNA:信使 RNA ；siRNA:小分子干扰 RNA ；shRNA:短发夹 RNA ；
[0010]DLL4-shRNA:具有靶向DLL4的信使RNA的短发夹RNA ；
[0011]第一方面，本发明提供了一种小分子干扰RNA，所述小分子干扰RNA具有与翻译Notch配体蛋白DLL4的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~27bp。
[0012]优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21~27bp。
[0013]优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0014]第二方面，本发明提供了一种shRNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
[0015]优选地，本发明第二方面提供了的一种shRNA，为具有茎环结构的单链RNA，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，其中，所述小分子干扰RNA具有与翻译Notch配体蛋白DLL4的 信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~27bp。[0016]优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21~27bp。
[0017]优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0018]第三方面，本发明提供了一种shRNA的编码DNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
[0019]优选地，本发明第三方面提供了的一种shRNA的编码DNA，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，其中，所述小分子干扰RNA具有与翻译Notch配体蛋白DLL4的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~27bp。
[0020]优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21~27bp。 [0021]优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0022]优选地，所述编码shRNA的DNA的含有SEQ ID NO: 3或4所示的核苷酸序列。
[0023]具体地，在此优选条件下，所述SEQ ID NO:3 (5，_3，)为:
[0024]GCGCTACTCTTACCGGGTCATCTCGAGATGACCCGGTAAGAGTAGCGCTTTTT ；
[0025]所述SEQ ID NO:4 (5，_3，)为:
[0026]AAAAAGCGCTACTCTTACCGGGTCATCTCGAGATGACCCGGTAAGAGTAGCGC。
[0027]进一步优选地，所述SEQ ID N0:3和4所示的核苷酸序列的5’端或3’端具有酶切位点。
[0028]更进一步优选地，所述SEQ ID NO: 3和4所示的核苷酸序列的5’端的酶切位点分别为Age I和EcoR I。
[0029]在此优选条件下，所述编码shRNA的DNA具有如SEQ ID NO: 5或6所示的核苷酸序列。
[0030]具体地，所述SEQ ID NO:5 (5，_3，)为:
[0031 ]
【权利要求】
1.一种小分子干扰RNA，其特征在于，所述小分子干扰RNA具有与翻译Notch配体蛋白DLL4的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~27bp。
2.如权利要求1所述的小分子干扰RNA，其特征在于，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 2 所示。
3.一种shRNA，为具有茎环结构的单链RNA，其特征在于，所述shRNA具有如权利要求1或权利要求2所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
4.一种编码shRNA的DNA，其特征在于，所述shRNA具有如权利要求1或权利要求2所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的编码shRNA的DNA，其特征在于，所述编码shRNA的DNA的含有SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的编码shRNA的DNA，其特征在于，所述编码shRNA的DNA还包括RNA聚合酶III启动子。
7.—种重组载体，其特征在于，所述重组载体为在pLK0.1质粒的多克隆位点、pEN-hHlc质粒的多克隆位点或pDSL-hpUGIP质粒的重组位点插入如权利要求4~6任一所述的编码shRNA的DNA得到的重组载体。
8.—种重组慢病毒，其特征在于，是如权利要求7的b)所述的重组载体与包膜载体psPAX2和包装载体pMD2.G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。
9.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求3所述的shRNA、如权利要求4所述的编码shRNA的DNA、如权利要求7的b)所述的重组载体和如权利要求8的所述的重组慢病毒中的至少一种。
10.如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求3所述的shRNA、如权利要求4所述的编码shRNA的DNA、如权利要求7的b)所述的重组载体和如权利要求8的所述的重组慢病毒中的至少一种在制备抑制Notch配体蛋白DLL4基因表达的药物中的应用。
【文档编号】C12N15/867GK103695424SQ201310744174
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】杨诗涵, 俞谦, 李红昌 申请人:深圳先进技术研究院