一种检测端粒酶活性的探针、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测端粒酶活性的探针、试剂盒以及方法。本发明提供的端粒酶结合引物（TS）和反向引物设计简单，TS只需包括DNA酶的序列以及切刻酶的酶切位点，不需要任何的修饰；反向引物只需包括与端粒酶延伸的多G序列互补的序列，这使得引物易于设计，可行性强。本发明的检测端粒酶活性的方法，反向引物只结合结果端粒酶延伸的TS引物，减少了非特异性扩增，而且在化学发光反应中，只有扩增出来的端粒酶多G序列和DNA酶可与hemin结合形成四聚体，产生化学发光信号，因此，本发明提供的检测端粒酶活性的方法特异性和灵敏度较高。此外，本发明提供的检测端粒酶活性的试剂盒成本低、操作简单、省时。
【专利说明】一种检测端粒酶活性的探针、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种检测端粒酶活性的探针、试剂盒及方法。【背景技术】
[0002]高灵敏地检测端粒酶活性对于癌症等相关疾病的早期诊断和药物筛选有重要的意义。传统检测端粒酶活性的技术主要是建立在聚合酶链反应(PCR)基础上的对端粒酶重复片段(TTAGGG)进行扩增(TRAP)来检测端粒酶活性，但是这些方法耗时、操作繁琐，且特异性不好。为了克服基于聚合酶链反应(PCR)的方法的缺点，近年来也发展出了一些不需要聚合酶链反应(PCR)的检测方法，如光纤敏感器，表面等离子共振技术，荧光，电化学等，但这些方法存在检测灵敏度低、操作繁琐、耗时或需将端粒酶结合引物固定在特别的支持物上的缺点。[0003]因此，有必要提供一种简单易行、且能快速、高灵敏地检测端粒酶活性的方法。
【发明内容】
[0004]为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种检测端粒酶活性的探针。本发明第二方面提供了一种检测端粒酶活性的试剂盒。本发明第三方面提供了一种检测端粒酶活性的方法。本发明提供的检测端粒酶活性的探针不需要任何的标记和修饰，本发明提供的检测端粒酶活性的试剂盒采用的试剂成本低，本发明提供的检测端粒酶活性的方法具有很高的灵敏度和特异性，本发明提供的基于化学发光反应的端粒酶活性的检测探针、检测试剂盒和检测方法在疾病早期诊断和药物筛选方面具有广阔的应用价值。
[0005]第一方面，本发明提供了一种检测端粒酶活性的探针，所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，
[0006]所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15~24个碱基处具有切刻内切酶的识别位点；
[0007]所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；
[0008]所述反向引物具有与(TTAGGG)n互补的序列，其中，η为6~10的自然数，所述反向弓丨物与所述端粒酶结合引物不互补。
[0009]优选地，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0010]具体地，所述SEQ ID NO: 1 为 PW17 序列，即 GGGTAGGGCGGGTTGGG ；
[0011 ]所述 SEQ ID NO: 2 为 T30695 序列，即 GGGTGGGTGGGTGGGT ；
[0012]所述SEQ ID NO: 3 为 PS2.Μ 序列，即 GTGGGTAGGGCGGGTTGG ；
[0013]所述SEQ ID NO: 4 为 PS5.Μ 序列，即 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG ；[0014]所述SEQ ID NO:5 为 AGR0100 序列，
[0015]即GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。
[0016]可形成分子内平行型G-四联体，该G-四联体可与氯高铁血红素(hemin)结合形成血红素-G四聚体，该血红素-G四聚体是一种DNA过氧化物酶，具有过氧化物酶的催化作用，其在3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)和过氧化氢存在条件下，可催化鲁米诺发生氧化反应并产生化学发光信号；此外，除鲁米诺外，还可催化其他氧化还原发光底物发生氧化还原反应并产生化学发光信号，如3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)、N，N 二甲基二吖啶硝酸盐(光泽精)、2，4，5-三苯基咪唑(洛粉碱)、3，4，5-三羟基苯甲酸(没食子酸)或双(2，4，6-三氯苯基)草酸盐(过氧草酸盐)。
[0017]此外，端粒酶在端粒酶结合引物的3'端不断添加多G重复序列(TTAGGG)，该多G重复序列也能形成分子内平行型G-四联体，该G-四联体可与氯高铁血红素(hemin)结合形成血红素-G四聚体，该血红素-G四聚体是一种DNA过氧化物酶，也具有过氧化物酶的催化作用，能进一步放大化学发光信号。
[0018]优选地，所述DNA酶序列两端的切刻内切酶为Nt.BspQ1、Nb.Bsm1、Nt.Alwl或Nt.BstNBI 切刻酶。
[0019]优选地，所述C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。具体地，所述SEQ ID NO:6为AA ACC TAC AAT CCG TCG AGC AGA GTT。
[0020]优选地，在所述C的核苷酸序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点后得到所述A的核苷酸序列。
[0021]在此优选条件下，所述A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
[0022]具体地，所述SEQID NO:7为AAA CCT ACA ATC CGT GGA AGA GCCGAG CAG AGT T。
[0023]其中，下划线表示的部分为C的序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点。
[0024]本发明提供的端粒酶结合引物(TS)含有三个切刻内切酶的酶切位点。在有端粒酶存在时，端粒酶可在端粒酶结合引物(TS)的3'端不断添加多G重复序列(TTAGGG)，反向引物(RS)能与多G重复序列(TTAGGG)结合，并进行复制延伸，从而形成双链，此时内切酶酶切位点产生，在切刻内切酶的不断酶切的作用下和聚合酶的链置换复制作用下，该双链DNA会产生引物、DNA酶和端粒酶多G重复序列片段；而产生的引物又可与多余的端粒酶结合引物(TS)相结合，从而诱发整个反应的指数扩增，不断产生更多的引物、DNA酶和端粒酶多G重复序列。产物DNA酶和端粒酶多G重复序列能与氯高铁血红素(hemin)结合形成四聚体，在过氧化物酶检测试剂存在时，该复合物能够催化底物进行氧化还原反应，产生化学发光信号。
[0025]本发明提供检测端粒酶活性的探针不需要任何的修饰、价格低廉、且设计简单。
[0026]优选地，所述端粒酶结合引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0027]优选地，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0028]第二方面，本发明 提供了检测端粒酶活性的试剂盒，包括:
[0029]端粒酶检测试剂，及
[0030]DNA酶检测试剂，
[0031]其中，所述端粒酶检测试剂包括端粒酶结合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻内切酶及端粒酶检测缓冲液，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂；
[0032]所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，
[0033]所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15~24个碱基处具有切刻内切酶的识别位点；
[0034]所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；
[0035]所述反向引物具有与(TTAGGG)η互补的序列，其中，η为6~10的自然数，所述反向弓丨物与所述端粒酶结合引物不互补。
[0036]优选地，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0037]具体地，所述SEQ ID NO: 1 为 PW17 序列，即 GGGTAGGGCGGGTTGGG ；
[0038]所述SEQ ID NO:2 为 T30695 序列，即 GGGTGGGTGGGTGGGT ；
[0039]所述SEQ ID NO: 3 为 PS2.Μ 序列，即 GTGGGTAGGGCGGGTTGG ；
[0040]所述SEQ ID NO:4 为 PS5.Μ 序列，即 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG ；
[0041]所述SEQ ID NO:5 % AGR0100 序列，
[0042]即GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。
[0043]优选地，所述DNA酶序列两端的切刻内切酶为Nt.BspQ1、Nb.Bsm1、Nt.Alwl或Nt.BstNBI 切刻酶。
[0044]优选地，所述DNA聚合酶为Bst2.0热启动DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、或Vent(exo_ ) DNA 聚合酶。
[0045]优选地，所述C的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0046]具体地，所述SEQ ID NO:6 为 AA ACC TAC AAT CCG TCG AGC AGA GTT。
[0047]优选地，在所述C的核苷酸序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点后得到所述A的核苷酸序列。
[0048]在此优选条件下，所述A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
[0049]具体地，所述SEQID NO:7为AAA CCT ACA ATC CGT GGA AGA GCCGAG CAG AGT T。
[0050]其中，下划线表示的部分为C的序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点。
[0051]优选地，所述端粒酶结合引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0052]优选地，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0053]优选地，所述端粒酶检测缓冲液包括30毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(PH8.3)、3毫摩尔每升的氯化镁、70毫摩尔每升的氯化钾、1毫摩尔每升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.05%的吐温20、200毫摩尔每升的dNTPs(四种脱氧核糖核苷酸的混合物)。
[0054]在此优选情况下， 所述端粒酶检测试剂中端粒酶结合引物的浓度为100纳摩尔每升，反向引物的浓度为50纳摩尔每升，DNA聚合酶的浓度为1个单位每20微升，切刻内切酶的浓度为5个单位每20微升，采用所述端粒酶检测试剂进行反应的方式优选为:取体积比为1~2:19的待测端粒酶样品和端粒酶检测试剂混合，先在30~40°C下孵育8~15分钟，然后在50~60°C下孵育15~30分钟。
[0055]进一步优选地，所述DNA聚合酶为Bst2.0热启动DNA聚合酶。
[0056]进一步优选地，所述切刻内切酶为Nt.BspQI切刻酶。
[0057]进一步优选地，所述端粒酶检测试剂进行反应的方式中，所述反应条件为:先在37°C下孵育10分钟，然后在55°C下孵育20分钟。
[0058]优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂包括鲁米诺、光泽精、洛粉碱、没食子酸或
过氧草酸盐。
[0059]进一步优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂还包括:105微升含有0.5毫摩尔每升的鲁米诺、15微升的去离子水、75微升2XHEPES缓冲液(40毫摩尔每升的HEPES、600毫摩尔氯化钠、PH8.0)。
[0060]在此优选条件下，所述DNA酶检测试剂中的氯高铁血红素(hemin)优选为75纳摩尔每升，采用所述DNA酶检测试剂进行检测的方式优选为:将15微升的扩增产物(与扩增反应同时进行的有切刻内切酶酶切反应)加入到105微升的所述DNA酶检测试剂中得到混合物，将混合物放入GloMax96微型板块光度计检测化学发光的信号，使用自动加样的程序加入过氧化氢，时间间隔设置为1.5秒，得到化学发光信号。
[0061]本发明第三方面提供了一种检测端粒酶活性的方法，包括如下步骤:
[0062]1)提供端粒酶检测试剂，及
[0063]DNA酶检测试剂，
[0064]其中，所述端粒酶检测试剂包括端粒酶结合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻内切酶及端粒酶检测缓冲液，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂；
[0065]所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，
[0066]所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15~24个碱基处具有切刻内切酶的识别位点；
[0067]所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；
[0068]所述反向引物具有与(TTAGGG)η互补的序列，其中，η为6~10的自然数，所述反向引物与所述端粒酶结合引物不互补；及
[0069]2)取待测端粒酶样品，加入所述端粒酶检测试剂进行两步恒温扩增反应，得到含所述DNA酶的产物；及
[0070]3)取所得含DNA酶的产物加入DNA酶检测试剂，并检测化学发光信号。
[0071]优选地，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0072]具体地，所述SEQ ID NO: 1 为 PW17 序列，即 GGGTAGGGCGGGTTGGG ；
[0073]所述SEQ ID NO:2 为 T30695 序列，即 GGGTGGGTGGGTGGGT ；
[0074]所述SEQ ID NO: 3 为 PS2.Μ 序列，即 GTGGGTAGGGCGGGTTGG ；
[0075]所述SEQ ID NO:4 为 PS5.Μ 序列，即 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG ；[0076]所述SEQ ID NO:5 为 AGR0100 序列，
[0077]即GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。
[0078]优选地，所述DNA酶序列两端的切刻内切酶为Nt.BspQ1、Nb.BsmI, Nt.Alwl或Nt.BstNBI 切刻酶。
[0079]优选地，所述DNA聚合酶为Bst2.0热启动DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、或Vent(exo_ ) DNA 聚合酶。
[0080]优选地，所述C的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0081]具体地，所述SEQ ID NO:6 为 AA ACC TAC AAT CCG TCG AGC AGA GTT。
[0082]优选地，在所述C的核苷酸序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点后得到所述A的核苷酸序列。
[0083]在此优选条件下，所述A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
[0084]具体地，所述SEQID NO:7为AAA CCT ACA ATC CGT GGA AGA GCCGAG CAG AGT T。
[0085]其中，下划线表示的部分为C的序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点。
[0086]优选地，所述端粒酶结合引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0087]优选地， 所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0088]优选地，所述步骤(2)中，所述两步恒温扩增反应的条件为:先在30~40°C下孵育8~15分钟，然后在50~60°C下孵育15~30分钟。
[0089]优选地，所述端粒酶检测缓冲液包括30毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(PH8.3)、3毫摩尔每升的氯化镁、70毫摩尔每升的氯化钾、1毫摩尔每升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.05%的吐温20、200毫摩尔每升的dNTPs(四种脱氧核糖核苷酸的混合物)。
[0090]在此优选情况下，所述端粒酶检测试剂中端粒酶结合引物的浓度为100纳摩尔每升，反向引物的浓度为50纳摩尔每升，DNA聚合酶的浓度为1个单位每20微升，切刻内切酶的浓度为5个单位每20微升，采用所述端粒酶检测试剂进行反应的方式优选为:取体积比为1~2:19的待测端粒酶样品和所端粒酶检测试剂混合，先在30~40°C下孵育8~15分钟，然后在50~60°C下孵育15~30分钟。
[0091]进一步优选地，所述DNA聚合酶为Bst2.0热启动DNA聚合酶。
[0092]进一步优选地，所述切刻内切酶为Nt.BspQI切刻酶。
[0093]进一步优选地，所述采用所述端粒酶检测试剂进行反应的方式中，所述反应条件为:先在37°C下孵育10分钟，然后在55°C下孵育20分钟。
[0094]优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂包括氧化还原底物，所述氧化还原底物为鲁米诺、光泽精、洛粉碱、没食子酸或过氧草酸盐；其中，氧化还原底物的浓度为0.5毫摩尔每升。
[0095]进一步优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂还包括:15微升的去离子水、75微升2XHEPES缓冲液(40毫摩尔每升的HEPES、600毫摩尔氯化钠、pH8.0)。
[0096]在此优选条件下，所述DNA酶检测试剂中的氯高铁血红素(hemin)优选为75纳摩尔每升，采用所述DNA酶检测试剂进行检测的方式优选为:将15微升的扩增产物(与扩增反应同时进行的有切刻内切酶酶切反应)加入到105微升的所述DNA酶检测试剂中得到混合物，将混合物放入GloMax96微型板块光度计检测化学发光的信号，使用自动加样的程序加入过氧化氢，时间间隔设置为1.5秒，得到化学发光信号。
[0097]本发明提供的检测端粒酶活性的方法主要分为三步:(1)端粒酶的延伸；(2)端粒酶介导的两步恒温扩增；(3)化学发光检测。首先构建了一个含有切刻内切酶位点的端粒酶结合引物(TS)，有端粒酶存在时，端粒酶会在TS的3'端不断添加多G序列(TTAGGG)。因此反向引物(RP)就会与添加的多G序列(TTAGGG)进行结合，并开始复制，形成双链后，新的扩增模板和内切酶酶切位点形成，剪切，聚合酶以新的扩增模板进行链置换复制，从而产生端粒酶延伸产物-多G序列(TTAGGG)，DNA酶以及引发指数扩增的引物(trigger)。而产生的引物可引发指数扩增反应，从而产生更多的端粒酶多G序列、DNA酶和引物，如此循环往复,就会产生大量的端粒酶多G序列和DNA酶。端粒酶多G序列和DNA酶能与氯高铁血红素(hemin)结合形成血红素多G四联体结构，在鲁米诺等氧化还原底物和过氧化氢存在条件下，发生化学发光，从而检测光信号。
[0098]本发明提供的检测端粒酶活性的方法不需要标记、低成本、快速、简单、灵敏，并且特异性好。
[0099]优选地，本发明提供的检测端粒酶活性的方法的能在30分钟内完成端粒酶活性的检测。
[0100]本发明提供检测端粒酶活性的探针、检测端粒酶活性的试剂盒及检测端粒酶活性的方法具有如下有益效果:
[0101]1.端粒酶结合引物(TS)设计简单。本发明提供的端粒酶结合引物只需包括DNA酶的序列以及切刻酶的酶切位点，不需要任何的修饰；反向引物只需包括与端粒酶延伸的多G序列互补的序列，这使得引物易于设计，可行性强。
[0102]2.特异性高。本发明的技术方案中的两步恒温扩增过程中，采用本说明提供的错配的反向引物(如SEQ ID NO:9所示)与端粒酶延伸的TS引物结合，减少了非特异性扩增，而且在化学发光反应中，只有扩增出来的端粒酶多G序列和DNA酶可与hemin结合形成四聚体，产生化学发光信号，因此，本发明提供的检测端粒酶活性的方法的特异性较高。
[0103]3.灵敏度高。本发明的技术方案将端粒酶诱导的恒温指数扩增反应的高效率与化学发光信号显著增强的两种优势串联起来，极大地提高了检测灵敏度。
[0104]4.成本低。化学发光具有灵敏度高和线性范围广的特点，而且价格低廉，在生物医学研究和疾病诊断方面具有广阔的应用价值。
[0105]5.操作简单、省时:由于本发明的技术方案中的扩增反应是恒温扩增，因而不涉及控温；而且该反应是在一管中进行反应后直接测化学发光信号的，因而不涉及分离、洗涤步骤。
【专利附图】
【附图说明】
[0106]图1为本发明实施例1提供的端粒酶结合引物结构示意图；
[0107]图2为本发明实施例2提供的检测端粒酶活性的方法流程图；
[0108]图3~图5为本发明实施例2提供的TCP8样品的检测结果；
[0109]图6~图9为本发明实施例2提供的细胞提取物样品的检测结果；
·[0110]图10为本发明对比实施例提供的样品的化学发光信号检测结果。【具体实施方式】
[0111]下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J., Russell, David ff., MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由宝生物工程大连有限公司合成。
[0112]实施例1
[0113]图1为本发明实施例提供的端粒酶结合引物的结构示意图，该端粒酶结合引物依次包括A、B、C。其中，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点(如图中X’所示)，所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15~24个碱基处具有切刻内切酶的识别位点(如图中X所示)；所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；
[0114]结合图1，本实施例提供了一种检测端粒酶活性的引物，包括如下步骤:
[0115](1)体外合成端粒酶结合引物(TS)，核苷酸序列(5’端到3’)如SEQ ID N0:8所示；
[0116](2)根据TS的序列以及多G序列(TTAGGG)设计反向引物(RP)，所述RP的核苷酸序列(5，端到3，)如SEQ ID N0:9所示；
[0117](3)根据TS的序列以及多G序列(TTAGGG)设计端粒酶产物(TPC8)，所述TPC8的核苷酸序列(5，端到3’)如SEQ ID NO: 10所示；
[0118]具体地，所述TS、RP和TPC8的核苷酸序列如下表1所示:
[0119]表1.TS、RP和TPC8的核苷酸序列
[0120]
【权利要求】
1.一种检测端粒酶活性的探针，其特征在于，所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15~24个碱基处为切刻内切酶的识别位点；所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；所述反向引物具有与(TTAGGG)n互补的序列，其中，η为5~10的自然数，所述反向引物与所述端粒酶结合引物不互补。
2.如权利要求1所述的检测端粒酶活性的探针，其特征在于，所述DNA酶序列为如SEQID NO: 1~SEQ ID NO:5任一所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的检测端粒酶活性的探针，其特征在于，所述DNA酶序列两端的切刻内切酶为 Nt.BspQ1、Nb.Bsm1、Nt.Alwl 或 Nt.BstNBI 切刻酶。
4.如权利要求1所述的检测端粒酶活性的探针，其特征在于，所述A或C的核苷酸序列如 SEQ ID NO:6 所示。
5.一种检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，包括:端粒酶检测试剂，及DNA酶检测试剂，其中，所述端粒酶检测试剂包`括端粒酶结合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻内切酶及端粒酶检测缓冲液，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂；所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15~24个碱基处具有切刻内切酶的识别位占.所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；所述反向弓丨物具有与(TTAGGG)η互补的序列，其中，η为6~10的自然数，所述反向弓丨物与所述端粒酶结合引物不互补。
6.如权利要求5所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO:5任一所示的核苷酸序列。
7.如权利要求5所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst2.0热启动DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、或Vent excTDNA聚合酶；所述DNA酶序列两端的切刻内切酶为Nt.BspQ1、Nb.Bsm1、Nt.Alwl或Nt.BstNBI切刻内切酶。
8.如权利要求5所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，所述A或C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
9.如权利要求5所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，所述DNA过氧化物酶检测试剂包括3-氨基邻苯二甲酰肼、N，N二甲基二吖啶硝酸盐、2，4，5-三苯基咪唑、3，4，5_三羟基苯甲酸或双(2，4，6-三氯苯基)草酸盐(过氧草酸盐)。
10.一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤:1)提供端粒酶检测试剂，及DNA酶检测试剂，其中，所述端粒酶检测试剂包括端粒酶结合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻内切酶及端粒酶检测缓冲液，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂；所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15~24个碱基处具有切刻内切酶的识别位占.所述反向弓丨物具有与(TTAGGG)η互补的序列，其中，η为6~10的自然数，所述反向弓丨物与所述端粒酶结合引物不互补；及2)取待测端粒酶样品，加入所述端粒酶检测试剂进行两步恒温扩增反应，得到含所述DNA酶的产物；及3)取所得含DNA酶 的产物加入DNA酶检测试剂，并检测化学发光信号。
11.如权利要求10所述的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述两步恒温扩增反应的条件为:先在30~40°C下孵育8~15分钟，然后在50~60°C下孵育15~30分钟。
【文档编号】C12Q1/68GK103667513SQ201310746446
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】王黎娟, 张春阳, 张艳 申请人:深圳先进技术研究院