一种植物胚芽鞘特异性表达启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种植物胚芽鞘特异性表达启动子及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物转基因工程中。本发明提供的启动子可以启动外源基因在植物胚芽鞘中特异性表达，适用于任何种子具有胚芽鞘的植物，尤其能够驱动外源基因在稻米胚芽鞘中特异性表达，因此可以用于提高和改善水稻的生长特性，从而培育出理想的、品质更加优良的水稻品种。
【专利说明】一种植物胚芽鞘特异性表达启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和植物基因工程【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种植物胚芽鞘基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在胚芽鞘中表达。
【背景技术】
[0002]水稻是最主要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米为主食。随着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来越高的要求。因而利用各种方法来提高水稻单产、改良稻米品质，有着积极重要的意义。通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中具有很好的应用前景。自1983年获得第一株转基因烟草以来，在近30年的时间里，植物基因工程的研究取得了突飞猛进的进展，已经成为现代生物学和育种学中一项重要的方法和技术。
[0003]高等生物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用的过程。在此过程中基因表达的开启、关闭、表达部位和表达量的闻低都将会受:到精细的调控，基因的表达调控是一个多层次的复杂过程，受不同的调节因素控制，也是在多阶段水平来实现的，即转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。尽管基因表达在高等生物中是多级调控系统，但是转录水平上的调控是最关键的环节。因为转录的起始及其发生频率是基因表达环节中最基本的一步。启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，是众多转录因子及RNA聚合酶的最终作用靶标，因此深入研究启动子的结构、功能、作用模式等对于回答分子生物学中的一些基本理论问题具有重大意义。因此，人们在开发一些新的转化技术如细胞器转化、定向转化等的同时，越来越注重通过控制目的基因的时空表达来达到相应的转化目的。研究者们通过寻找更为有效的组织、器官特异性表达启动子或者是诱导表达启动子来代替组成型启动子，以期更好地调控植物基因表达。正因为如此，组织特异性启动子在植物基因工程中的研究地位也越来越突出。
[0004]胚芽鞘是作物子叶应对生长初期逆境的保护组织，在成熟种子中完成分化。在种子萌发后期，随着细胞的伸长和扩大，胚芽鞘伸长使种子破土生长，保护胚芽露出地面并抵御逆境胁迫。由于胚芽鞘在作物生长初期具有重要意义，已有大量的关于胚芽鞘伸长及生理反应的机理研究报道。王玮等发现在干旱胁迫下小麦胚芽鞘长度与抗旱系数呈极显著正相关，可用作衡量小麦抗旱性的指标；并在小麦的抗旱育种中通过在早期世代对抗旱基因型进行筛选，取得了良好效果。周小梅等研究表明，渗透胁迫下水稻幼苗体内腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)含量的上升有利于提高水稻幼苗的抗渗透胁迫能力，并且水稻芽期的抗旱性可在一定程度上反应该品种的抗旱性。在水稻上已有研究表明在进行直播稻生产时选择长胚芽鞘类型的品种是有效利的，但未见有更深入的的研究报道。
[0005]水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是禾本科作物功能基因组学研究的模式植物。由于水稻幼苗的胚芽鞘不仅能在湿润空气中生长，也能够在水层中生长，而且生长的更快。水稻胚芽鞘所具有的这种特性，在水稻栽培中已加以利用，如我国双季稻地区晚稻育秧，常直接在蓄水田中播种，美国加利福尼亚州至今犹保持用飞机在蓄水田中播种的习惯。由于胚芽鞘在胚中已经分化完成，萌发后不再进行细胞分裂增殖，是研究生长机制的好材料，因此，对水稻胚芽鞘特异性表达基因的深入研究，具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻胚芽鞘中特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
[0007]为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物胚芽鞘特异性表达启动子，所述植物胚芽鞘特异性表达启动子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻胚芽鞘特异表达启动子，本文中称为PColel或启动子PColel。
[0008]优选地，本发明提供的植物胚芽鞘特异性表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，即PColel或启动子PColel。
[0009]另一方面，本发明提供一种植物胚芽鞘特异性表达启动子，其DNA序列与SEQ IDNo:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者，所述植物胚芽鞘特异性表达启动子为在SEQID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述植物胚芽鞘特异性表达启动子具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些植物胚芽鞘特异性表达启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物胚芽鞘中特异性表达。
[0010]另一方面，本发明还提供一种包含上述植物胚芽鞘特异性表达启动子的表达盒。
[0011]又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的植物胚芽鞘特异性表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物胚芽鞘特异性表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PColel，该重组 表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即PColel或启动子PColel构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-PColeI。
[0012]另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物胚芽鞘特异性表达启动子、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。
[0013]另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物胚芽鞘特异性表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。
[0014]再一方面，本发明提供上述植物胚芽鞘特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物胚芽鞘特异性表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。待表达的基因即目标基因包括用于改良植物品质和积累的基因以及植物营养吸收相关的基因。
[0015]并且优选地，所述应用可以用于改良植物胚芽鞘性状，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻；更优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PColeI，以用于改良水稻胚芽鞘形状。
[0016]本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:1中相同):
[0017]GCGTGTTGCGGAGTATGAGGTCCCTTTTTGGGCTTAAAACTTAAAAGTCCTTTGAGCCGTCGAA
[0018]TCCTTTTTGTGGAGAAGCAATGGCTAGTAAGTTGTAACCTCTATCCAGTTCATATACTGGTAGTTT
[0019]ACAAGCGGGATTGATTGTTCCACTTAGATATTTTTTTCAGCTAATATTCTAAAAACTTTCCACACT
[0020]TTACTGGGTTAATCATCATCATGTAATCCTGAGTTTAAATGGAACAATTATCTGCATTGAAATTAG
[0021]TTAGAGCAGGTACAATAGCAGGCTATAAGCCAGCTGTAAACATATTTTAAGGAGATAAATAAGG
[0022]AGAGAAGAGCAGCGGGCTACATATTTGTAGTCAGCTGTAGTACGGACTCTAAGACGCAGTGTGT
[0023]ATATGACAGGTGGGACCATGTATTAATAGTATAGTATGTAACTATTGTATAAATGAGTTATTAGATT
[0024]GACTATAGATGAATTGGAGCTAGTAGTTGGCTATACTATTAATCTTGCTCTTATCGATGCACAGGT
[0025]AATAGTTGAACTAACTGCACCTATAATACCTTGTTCTTCTAGACTTGCTCGAAATTTAGGACTATC
[0026]TTCAATTAAAAGTATGGTGTAACACCTTTTATGCAATAGTACTCCGTCGACCGAAAAAATATGGA
[0027]AGAATACAATTTTTAGCTAAAATTTATCATAGTTTAATACGCCGAATTGACGGCCTAGTAAATCTA
[0028]TATCCCTTTAAAAGAAAAGAAATTAGAAATAAAGTAGTGATGGTAATAGTGAATTTGCTACTTCA
[0029]CCTACTGCATTGAGATTTTTGCAAGTTAACTCCTGAACTTTTTAATATTAAAAAGATCGAATCTA
[0030]AATGGGTAGCTCCTAAAAAAAATAAAAGTAGGATGAATATTCTCTATAGCAAAAAGTGAAAGTA
[0031]CATTAATACATTATTTTATCTGTAGCGAGCATGGACATTTAGATGGTTTCTAAAAATTATATAGTAT
[0032]TTTGTGTTTATCATGATTTTTTCTTAGGAAAACAACGCTTACTACACGTACTATTTTCAGAATGGG
[0033]CTTTCTTTATAGAAGAAAAATAATCCATCCTTTCGGAGGATCGGTTGTGGTCGTTAGCAGGCATT
[0034]GCTTCCTTTAGGGATTTGTTGAAAGTGTAGCGTGGCTTTGCCCTCTCCCGCTGATTGGAGTAGC
[0035]GTTACCTGTCGTACGAGTTATATTTTTCTTCCTTGGTTGTTTTTTTTCTCTCCTTGGTATAAGTTGG
[0036]TCTAGCTAATTACATTGAGTAATATATTGACGTATAATCTTTTTCGCGTTCATGAAAAAATTATAGA
[0037]AAAATAATTTTGGAGCGGAAACTAGTCTCCGCAGGAACTCTTTGATTTCTGACGGACTCAACGC
[0038]CTGCGGGCTGCAGCTTCTCCCTGCTATCCTCCTTCCCTTTTGATATCGGGTCGAACTTTCCAGGA
[0039]CCGGTGCTGCGCATGCAAGTGATCTTCTGGTTTACTAGATGTTCACATTTTCTCCTTTCCAGCCA
[0040]CGGCGAAATGTCAGTCCATCTTCGCCGGTTGACTAGCACCGGTCGCCAAACTTCAAGGAAACC
[0041]GACGTGCAGGATTCTTTCGTTGCCATGTTGTCACTCACCCGTGCCACCATCGCGCAGCAGAATC
[0042]CTTCAGCGGCAAACCAAGAAACGACATCCCGTTGAAAGGTCAGGTCAACCGTAATCCTCATCA
[0043]CGGCATCAGTGCATCACCTGAGGCCGACCTGCTCTCCCGATCCCTCGCGAACTCCCCGGGAAG
[0044]ACGACGAAGACCAGTTACTTCTACAACGCAAATCGAACTATAGCCGCCCTGCTCTGTCCAGGA
[0045]AGCAACGCGCCGGCGCGGGATGCTCCACTATAAAACGCACCCGCTAATCACATCGACCCGCCA [0046]CACCACCTATCACAGCAACACAAGCCAACCACAAAGAATT
[0047]需要说明的是:上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“ GCGTGTTGCG GAGTATGAGG TC ”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp ;序列末尾以斜体并加粗表示的序列“CAAGCCAACCACAAAGAATT”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计20bp ；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。
[0048]综上所述,本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的1923bp的DNA序列，并将其命名为PColel (序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株整体上的Gus基因表达水平相对较低，仅在胚芽鞘处显蓝色，从而证明该1923bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻胚芽鞘中特异性表达。
[0049]本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化后可驱动靶标基因在胚芽鞘中的特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物胚芽鞘中的表达量，增加转基因的效果，减轻外源靶标基因由于过量表达而对作物性状的影响。
[0050]技术效果
[0051]本发明所克隆的水稻启动子PColel能够调控基因在胚芽鞘中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在胚芽鞘中特异性表达，可以提高和改善水稻的生长特性和机制，从而培育出理想的、品质更加优良的水稻新品种，由于其具有在胚芽鞘中特异性表达的特征，可用其代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。
【专利附图】
【附图说明】
[0052]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0053]图1A-1B为将PColel启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1A为pCAMBIA1391示意图，图1B为pCAMBIA1391-PColeI示意图，其中示出了利用PColel启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；
[0054]图2为利用PColel启动子驱动Gus基因表达的结果不意图,其中图中的a表不根；b表示莖；c表示叶；d表示叶鞘；e表示叶枕；f表示花；g表示果实；h表示种子；i表示胚芽鞘；j表示放大后的胚芽鞘，结果显示PColel启动子驱动Gus基因仅在胚芽鞘中明显表达，而在其它部位均不表达。
[0055]图3为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
【具体实施方式】
[0056]以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0057]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0058]含有酶切位点的PColel启动子的获得
[0059]步骤1、引物的设计
[0060]根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻PColel基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。[0061]本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1A，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为:正向引物(SEQ ID No:2) 5’端带Hindlll，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No: 3) 5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，引物序列如下:
[0062]正向引物:AAGCTTGCGTGTTGCGGAGTATGAGGTCHindIII
[0063]反向引物:GGATCCAATTCTTTGTGGTTGGCTTGTGBamHI
[0064]由深圳华大基因公司合成。
[0065]步骤2、启动子PColel的获得
[0066]以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子PCoIe I，按常规PCR体系，采用如下扩增程序:
[0067]95°C 预变性 5min ;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C 延伸 2min30s，35 个从 95°C 预变性到72°C延伸的循环；最后72°C延伸lOmin。
[0068]回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1923bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上,按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和BamHI进行双酶切验证，如图3所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子PColel,其核酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0069]植物表达载体的构建和农杆菌的转化
[0070]从上面“启动子PColel的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和BamHI双酶切，回收启动子PColel片段。同时利用HindIII和BamHI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收PCAMBIA1391，将上述的PColel片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子PColel与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-PColel(图1B)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105 (安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，从冻融法所得产物中提取阳性质粒，用HindIII和BamHI进行酶切验证，验证结果如图3中所示。
[0071]利用启动子PColel驱动Gus报告基因在水稻中表达
[0072]步骤1:农杆菌介导的水稻遗传转化
[0073]成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有I滴TWeen20的50%次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4%)溶液浸泡种子40min (150r/min)o倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于农杆菌转化。
[0074]采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照 Yongbo Duan (Yongbo Duan, Chenguang Zhai, et al.An efficient andhigh-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice (Oryza sativa L.)[J], Plant Cell Report, 2012.D0I10.1007/s00299-012-1275_3.)等提出的方法。
[0075]共获得27 株 PColel_pCAMBIA1391 植株(PColel::gus 转基因水稻植株)。
[0076]步骤2、⑶S组织化学染色
[0077]参照Jefferson (Jefferson RA 等人.GUS fusion: β -Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.,1987,6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37°C染色24小时。脱色时在37°C条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。
[0078]通过⑶S组织染色，检测启动子PColel在水稻转基因植株中对⑶S的启动活性。结果显示，PColel::gus转基因水稻种子的胚芽鞘经⑶S染色后呈现蓝色，而其它部分组织无染色。结果说明，启动子PColel能够驱动Gus基因在水稻胚芽鞘中特异性高水平的表达，结果见图2。
[0079]以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
【权利要求】
1.一种植物胚芽鞘特异性表达启动子，其特征在于，所述植物胚芽鞘特异性表达启动子包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的植物胚芽鞘特异性表达启动子，其特征在于，所述植物胚芽鞘特异性表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的植物胚芽鞘特异性表达启动子，其特征在于，所述植物胚芽鞘特异性表达启动子的DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述植物胚芽鞘特异性表达启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物； 或者，所述植物胚芽鞘特异性表达启动子具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。
4.一种表达盒,其特征在于,所述表达盒包含权利要求1-3中任意一项所述的植物胚芽鞘特异性表达启动子。
5.—种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体包含权利要求1-3中任意一项所述的植物胚芽鞘特异性表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物胚芽鞘特异性表达启动子连接于载体中待表达的基因序列的上游； 优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PColel，其中pCAMBIA1391为植物双元表达载体。
6.—种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求1-3中任意一项所述的植物胚芽鞘特异性表达启动子、权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5所述的重组表达载体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。
7.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1-3中任意一项所述的植物胚芽鞘特异性表达启动子、权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5所述的重组表达载体、或者权利要求6所述的宿主菌。
8.一种根据权利要求1-3中任意一项所述的植物胚芽鞘特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用， 其特征在于，所述应用包括:将根据权利要求1-3中任意一项所述的植物胚芽鞘特异性表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物胚芽鞘性状，所述植物为单子叶植物:水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。
【文档编号】C12N1/21GK103740721SQ201310752156
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】魏鹏程, 杨剑波, 李莉, 许蓉芳, 李 浩, 秦瑞英, 杨亚春, 宋丰顺, 张银萍, 倪大虎 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所