一株淡水小球藻Chlorella sorokiniana GS03 及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物质能源【技术领域】，具体涉及一株淡水小球藻Chlorella?sorokiniana?GS03及其在固定工业烟道气CO2和生产微藻生物柴油中的应用。本发明保藏号为CCTCC?M2013607的小球藻藻株C.sorokiniana?GS03，与已报道的微藻藻株相比具有更高的二氧化碳耐受性、更高的高浓度二氧化碳固定效率及生物量产率和油脂产率。因此可以大大降低微藻油脂生产成本，为高效固定典型工业烟道气环境中CO2及微藻油脂制备生物柴油提供了一株优良的生产藻种，在生物能源领域具有极大的应用前景。
【专利说明】—株淡水小球藻Ch I ore I I a sorokiniana GS03及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及生物质能源【技术领域】，具体涉及一株淡水小球藻ChlorelIasorokiniana GS03及其在工业烟道气CO2固定和生产微藻生物柴油中的应用。
【背景技术】
[0002]因全球化石燃料的大量使用，“温室效应”日益加重，化石燃料燃烧带来的CO2约占总“温室效应”气体的65%以上。因此，石化、冶炼、电力等行业CO2减排成为可持续发展的重点。
[0003]近些年来，一些发达国家采用各种物理、化学和生物方法研究CO2的收集、浓缩及固定和转化。但比起传统物理化学CO2固存方法成本高、能耗大、环境友好性差等特点，生物CO2固定法是地球上最主要和最有效的固碳方式，且最为符合自然界碳循环规律，是环境友好型与资源节约型的可持续发展方法。
[0004]随着社会经济发展及对能源需求的持续增长，石化资源的匮乏日渐突显，因此寻找一种持续可再生、环境友好型的能源形式成为各国科学家关注的重点。在众多的可再生能源(风能、地热能、水能、太阳能等)中，生物柴油以其在能量密度、燃烧性等方面与石化柴油具有极高相似性，甚至超过石化柴油，且具有易降解、基本不含硫及芳烃类化合物、对环境友好等特性，受到世界各国的广泛关注。一些发达国家于20世纪90年代初便开始了生物柴油的商业化生产，并主要以大豆和菜籽油为生产原料。我国生物柴油产业兴起较晚，目前，我国生产生物柴油的原料主要是大豆、油菜等油料作物、油棕和麻风树等油料木果实及废餐饮油等。但是，这种以传统农业为基础的生物柴油生产方式，不仅产量低、成本高，而且不符合“不与农业争粮争地”的根本原则，同时废气油脂目前的回收问题也难以很好的解决，也不能满足将来能源市场的需求，因此不能满足生物柴油产业对原料持续增长的需求。研究发现许多藻类可以快速生长并在体内产生大量的油脂，被称为产油藻。产油微藻即在一定条件下，微藻将CO2、碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等碳源转化为微藻细胞内大量贮存的油脂，且油脂含量超过生物总量20%的微型藻类。微藻因含油量高、易于培养、单位面积产量大等优点而被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油原料。
[0005]通过微藻减排典型工业烟道气CO2的同时生产油脂以制备生物柴油技术已成为世界各国研究的热点。美国，澳洲、日本、西欧、印度和南非的政府或企业投入巨资进行微藻生物柴油的研究。美国著名实验室和科学家组成的National Alliance,该联盟中的LiveFuels公司宣布了由国家能源局支持的“微型曼哈顿计划”，即微藻能源计划，计划在2010年实现微藻制备生物柴油的工业化。日本国际贸易和工业部曾资助了一项名为“地球研究更新技术计划”的项目。该项目利用微藻来生物固定C02，并着力开发密闭式光生物反应器技术，通过微藻吸收火力发电厂烟气中的CO2来生产生物质能源。2008年，英国碳基金公司启动了目前世界上最大的藻类生物燃料项目，投入2600万英镑用于发展相关技术和基础设施，该项目预计到2020年实现商业化。荷兰AlgaeLink公司是一家拥有工业化藻类培养设备和藻油加工技术的跨国公司，该公司向全球销售其反应器，并提供相关技术支持。2008年4月该公司与荷兰航空公司签订了利用藻油开发航空燃油的协议。此外，以色列一家公司于2007年对外展示了利用海藻吸收CO2，将太阳能转化为生物质能的技术，每5千克藻类可生产I升燃料。
[0006]近年来，微藻生物柴油技术也引起了我国政府科研机构和企业的重视，被列为科技部863计划、973基础规划、十二五生物技术发展规划的重点项目之一。各高校和科研院所都开展了这方面的研究，主要集中于藻种的筛选、微藻培养生物反应器设计及下游加工技术。目前，一些企业及研究机构也正在进行微藻生产生物柴油的中试培养。新奥科技发展有限公司的“C02—微藻一生物柴油”关键技术研究项目已经通过中试，并在内蒙古达拉特旗建设280hm2的微藻养殖基地。2009年，中国石化股份有限公司与中科院联合启动了 “微藻生物柴油成套技术”项目，目标计划到2015年完成万吨级工业生产装置。
[0007]虽然微藻生物柴油目前在技术上是可行的，但是与化石柴油相比，微藻生物柴油的生产面临着两大“瓶颈”，使得微藻生物柴油的生产严重受阻。其一是微藻生物柴油生产成本高，故产品价格也较高，还无法适应当前的市场需求，且因微藻的大规模培养水平尚有限，这也使得微藻生物柴油的价格居高不下；二是微藻生物质自养培养细胞密度低导致后续加工处理过程成本高。而将“微藻生物柴油生产”及“co2减排”高度耦合研究，不仅可以降低微藻生物柴油生产成本，而且可以提高微藻细胞培养密度，更为重要的是可以实现温室气体的减排。这种新理念为缓解当前能源紧缺和温室效应的形势提供了新途径，也为微藻生物柴油的生产提供了一种可行性研究方案，能创造一种双赢的局面。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一株优势特色淡水小球藻，该小球藻藻株可以转化工业烟道气CO2为生物柴油制备的原材料，该发明可以有效解决当前工业源大气污染物的治理同时耦合微藻油脂生产降低微藻生物柴油生产成本过高的问题。
[0009]本发明首先公开了一种小球藻株C.sorokiniana GS03,其保藏号为:CCTCCM2013607。
[0010]本发明从取自甘肃天水发电厂附近微酸性废水样中分离筛选到一株淡水微藻，命名为Chlorella sorokiniana GS03，该菌株已于2013年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M2013607。
[0011]本发明分离的藻株C.sorokiniana GS03在以BG-11培养基为基础营养盐培养基培养时，该藻株呈球状或卵形，直径在2~4 μ m之间，每个细胞内有一个周生、杯状或片状的色素体，具有I个细胞核；细胞壁较薄。普通培养条件下，测定其蛋白含量为50%左右，油脂含量为22%~43%，多糖含量为25%左右，富含绿叶素。
[0012]经形态学鉴定和18S rRNA, ITS-2以及rbcL扩增序列发育树分析，确定该淡水微藻藻株为小球藻，(按照国际命名规则:属名+种名+株名对该藻株进行命名，属名、种名、株名分别为 Chlorella、sorokiniana 和 GS03),命名为 Chlorella sorokiniana GS03 (可简写为C.sorokiniana GS03)，保藏号为:CCTCC M2013607。该藻株适合培养温度和pH范围较广，适宜培养温度范围为10~45°C，适宜pH值范围为4.0~11，可以耐受的CO2浓度范围为0.03~45v/v%之间，优选为0.03~30v/v%。[0013]优选的，本发明所述小球藻C.sorokiniana GS03中，油脂含量为22~43wt%。
[0014]更优选的，所述小球藻C.sorokiniana GS03中，C16及C18短链脂肪酸的含量>93wt%0可见，油脂的脂肪酸组成主要为C16、C18短链脂肪酸，适合生物柴油的生产。
[0015]本发明第二方面公开了小球藻C.sorokiniana GS03发酵并固定CO2的方法,步骤如下:
[0016]I)种子液的制备:无菌条件下挑取小球藻C.sorokiniana GS03单藻落到灭菌的BG-1l培养液中培养至对数生长期，获得微藻种子液；
[0017]2)生物发酵:将经过对数期培养的微藻种子液接种到灭菌的BG-1l培养液中进行培养，培养温度为10~45°C，培养基pH值4.0~11，光照强度为2500~150001ux，光暗比为8~24:16~0，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm，其中CO2含量为
0.03~30v/v%，培养10-14天后结束培养，收获小球藻C.sorokiniana GS03发酵液。
[0018]种子液培养条件与发酵培养条件基本相同。
[0019]优选的，步骤I)所述藻株种子液的培养条件为:培养温度为10~45°C，培养基pH值4.0~11，光照强度为2500~150001ux，光暗比为8~24:16~0，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm，其中CO2含量为0.03v/v%。
[0020]优选的,步骤2)所述藻株种子液的接种量为5~15v/v%。
[0021]本发明所述光暗比为8~24:16~0，是指每天光照时间为A小时，黑暗时间为B小时，A:B为8~24:16~0，并且A+B=24小时。
[0022]优选的，步骤2)所述发酵培养的条件为:温度28 V，培养基pH值8.0，光照强度75001ux，光暗比为12:12，，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.33vvm, CO2含量优选为
0.03~15v/v%，培养14天后发酵结束,获得发酵液。
[0023]本发明第三方面公开了小球藻C.SOTokiniana GS03发酵制备生物柴油的工艺，工艺步骤如下:
[0024]1.采用前述小球藻C.sorokiniana GS03发酵并固定CO2的方法制备获得小球藻
C.sorokiniana GS03 发酵液；
[0025]2.发酵液进行固液分离，收集微藻细胞获得藻泥；
[0026]3.将前一步骤所得的藻泥干燥，获得藻粉；
[0027]4.将前一步骤获得的藻粉通过三氟化硼催化法制备脂肪酸甲酯。
[0028] 优选的，步骤2还包括检测藻泥的CO2固定效率，以及藻株生物量产率的检测。微藻生物量及微藻产率的检测为常规分析过程，具体方法可参考现有技术。CO2固定效率的测定，可以利用微藻细胞平均碳含量及生物量产率间接计算得知。
[0029]优选的，步骤2所述干燥的方法为60~90°C烘干，或者真空冷冻干燥。
[0030]优选的，步骤3还包括对藻粉的油脂含量进行检测。油脂含量的测定方法为常规分析方法，具体可采用氯仿甲醇法分析油脂含量。
[0031]优选的，步骤4还包括对制备的脂肪酸甲酯的组成进行分析，为通过气象色谱质谱技术分析脂肪酸甲酯的种类和相对含量。
[0032]本发明最后一方面公开了小球藻C.sorokiniana GS03在生物质能源领域的应用。
[0033]优选的，小球藻C.sorokiniana GS03的应用为固定二氧化碳并生产生物柴油。
[0034]有益效果:本发明提供的淡水小球藻C.sorokiniana GS03能够耐受0.03%~45%(v/v) CO2,能够高效固定0.03%~15% (v/v) CO2, CO2固定效率为110~660mg/L/d,生物量(干重)浓度为680~4000mg/L。本发明分离的淡水小球藻C.sorokiniana GS03还能在高效减排高浓度工业烟道气CO2的基础上高产生物量及微藻油脂。该株淡水小球藻可以在气升式光合生物反应器中，高效利用CO2、快速的形成生物量并积累微藻油脂，油脂含量可达22%~43%，其油脂脂肪酸组成主要为C16、C18短链脂肪酸(> 93%)，其油脂脂肪酸组成主要为C16、C18短链脂肪酸，适合生物柴油的生产。
[0035]此淡水小球藻与已报道的微藻藻株相比具有更高的二氧化碳耐受性、更高的高浓度二氧化碳固定效率及生物量产率和油脂产率。因此可以大大降低微藻油脂生产成本，为高效固定典型工业烟道气环境中CO2及微藻油脂制备生物柴油提供了一株优良的生产藻种。
[0036]本发明藻株保藏信息如下:
[0037]藻株名称:小球藻C.sorokiniana GS03 ；
[0038]保藏号为:CCTCCM2013607 ；
[0039]保藏日期:2013年11月27日；
[0040]保减单位名称:中国典型培养物保减中心；
[0041]保藏单位简称:CCTCC ;
保藏单位地址:武汉市 武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1:淡水小球藻C.sorokiniana GS03的藻细胞扫描电镜照片
[0043]图2:淡水小球藻C.sorokiniana GS03的藻细胞光学显微镜照片
[0044]图3:淡水小球藻C.sorokiniana GS03的藻细胞内部脂肪滴染色显微照片
[0045]图4:生物柴油脂肪酸甲酯组成的HPLC分析
【具体实施方式】
[0046]通过以下具体实施例对本发明进行进一步的阐述，以下实施例仅用于说明，而不用于限制本发明的保护范围。
[0047]实施例1
[0048]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌BG-1l培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，75001ux光照强度下，培养12天，生长到指数末期以1:10接种比例扩大培养。
[0049]配制BG-1l培养基2.4L，接入已扩大培养的细胞，接种细胞光密度0D_=1.2。初始ρΗ4.0，温度15°C，光暗比为8:16,150001ux光照强度下，通入0.5vvm的空气(CO2含量为 0.03% (v/v))，培养 14 天。
[0050]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为680mg/L，生物量产率为70mg/L/d，CO2固定效率为110mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为22%。生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16、C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的98%以上，微藻细胞的扫描电镜照片、光学显微镜照片，以及脂肪滴染色照片见图1-3。
[0051]实施例2
[0052]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，75001ux光照强度下，培养12天，生长到指数末期以5%接种比例扩大培养。
[0053]配制BG-1l培养基3.1L，接入已扩大培养的细胞。初始pH7.0，温度45°C，光暗比为24:0,25001ux光照强度下，通入Ivvm的30%C02 (v/v)，培养10天。
[0054]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为2400mg/L，生物量产率为360mg/L/d，CO2固定效率为660mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为35%，生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16、C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的93%以上。通过经典三氟化硼催化法制备获得脂肪酸甲酯。
[0055]实施例3
[0056]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，75001ux光照强度下，培养12天，生长到指数末期以1:10接种比例扩大培养。
[0057]配制BG-1I培养基3.1L，接入已扩大培养的细胞。初始pHll.0，温度10°C，光暗比为12:12，950011?光照强度下，通入0.2—111的45%0)2 (v/v)，培养14天。
[0058]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为2500mg/L，生物量产率为26 0mg/L/d，CO2固定效率为480mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为36%，生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16、C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的98%以上。
[0059]实施例4
[0060]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001uX，培养12天，生长到指数末期以1:10接种比例扩大培养。
[0061]配制BG-1l培养基，按15%接种量接入已扩大培养的细胞。初始pH8.0，温度28°C，75001ux光照强度下，通入0.33vvm的15%C02 (v/v)，培养14天。
[0062]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为2700mg/L，生物量产率为250mg/L/d，CO2固定效率为460mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为43%，生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16、C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的98%以上，色谱分析图见图4。
【权利要求】
1.一种小球藻株 Chlorella sorokiniana GS03，其保藏号为:CCTCC M2013607。
2.—种小球藻Chlorella sorokiniana GS03发酵并固定CO2的方法,步骤如下: 1)种子液的制备:无菌条件下挑取权利要求1所述小球藻ChlorellasorokinianaGS03单藻落到灭菌的BG-1l培养液中培养至对数生长期，获得微藻种子液； 2)生物发酵:将经过对数期培养的微藻种子液接种到灭菌的BG-1l培养液中进行培养，培养温度为10~45°C，培养基pH值4.0~11，光照强度为2500~150001ux，光暗比为8~24:16~0，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm，其中CO2含量为0.03~30v/v%,培养10~14天后结束培养，收获小球藻Chlorella sorokiniana GS03发酵液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤I)所述藻株种子液的培养条件为:培养温度为10~45°C，培养基pH值4.0~11，光照强度为2500~150001ux，光暗比为8~24:16~0，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm，其中CO2含量为0.03v/v%。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述发酵培养的条件为:温度28°C，培养基pH值8.0，光照强度75001UX，光暗比为12:12，，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.33vvm, CO2含量优选为0.03~15v/v%，培养14天后发酵结束，获得发酵液。
5.一种小球 藻株Chlorella sorokiniana GS03发酵制备生物柴油的工艺,步骤如下: (1)采用权利要求2-4任一权利要求所述小球藻株Chlorellasorokiniana GS03发酵并固定CO2的方法制备获得小球藻Chlorella sorokiniana GS03发酵液； (2)发酵液进行固液分离，收集微藻细胞获得藻泥； (3)将前一步骤所得的藻泥干燥，获得藻粉； (4 )将前一步骤获得的藻粉通过三氟化硼催化法制备脂肪酸甲酯。
6.权利要求1所述小球藻株Chlorellasorokiniana GS03在生物质能源领域的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为固定二氧化碳并生产生物柴油。
【文档编号】C12R1/89GK103952312SQ201310753837
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】缪晓玲, 巩三强 申请人:上海交通大学