番茄种传病原多重pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型属于生物【技术领域】，涉及一种番茄病害的检测试剂盒。一种番茄种传病原多重PCR检测试剂盒，番茄种传病原为马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒或烟草环斑病毒，其主要特点在于包括有在盒体内设有RT-PCRbuffer管，内装2×RT-PCR?buffer；引物管，分别装马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd上游引物，浓度为10μmol/L；马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd下游引物，浓度为10μmol/L；凤果花叶病毒PepMV上游引物，浓度为10μmol/L；凤果花叶病毒PepMV下游引物，浓度为10μmol/L；烟草环斑病毒TRSV上游引物，浓度为10μmol/L；烟草环斑病毒TRSV下游引物，浓度为10μmol/L；酶管，内装反转录酶及DNA聚合酶Mix，去离子水管，内装无RNA酶的去离子水；阳性对照管，内装马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd、凤果花叶病毒PepMV和烟草环斑病毒TRSV无侵染活性的阳性对照。
【专利说明】番茄种传病原多重PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物【技术领域】，涉及一种番茄病害的检测试剂盒，主要针对番茄的3种重要种传病原马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒和烟草环斑病毒的同时检测。
【背景技术】
[0002]番茄病毒病是由多种病毒引起的重要病害，是番茄上发生最普遍、最难防治的病害之一，分布于世界各番茄产地。马铃薯纺锤块茎类病毒、烟草环斑病毒和凤果花叶病毒均可引起番爺病毒病。马铃薯纺锤块莖类病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)是我国进境植物检疫性有害生物，在中国局部分布于黑龙江、江苏、河北和青海，主要寄主为马铃薯、番茄和鳄梨，还能感染其它茄科植物，包括辣椒、甘薯、茄、茄属观赏植物、龙葵、曼陀罗属、素馨茄、灯笼果、人参果、矮牵牛属植物等。类病毒是无蛋白质外壳保护的游离的共价闭合环状单链RNA分子，侵入宿主细胞后自我复制，具有高度的侵染活性，50?100分子的类病毒可以引起成功的侵染，并使宿主致病或死亡。烟草环斑病毒(Tobacco ringspotvirus,TRSV)为紅豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传病毒属(Nepovirus)的成员，可侵染番茄等54科246种草本和木本植物，在植物上引起环斑等症状，是我国进境植物检疫性有害生物。该病毒通过线虫、机械接种和种子等途径传播，在多种多年生植物及种子上越冬，成为来年的初侵染来源，种子传播是TRSV远距离传播的主要途径。凤果花叶病毒(Pepinomosaic virus, PepMV)为马铃薯X病毒(Potexvirus)属病毒，最初发现于凤果(又称人参果、香瓜茄)上，自然寄主为番茄，并可侵染茄子、烟草和马铃薯等茄科作物及苋属杂草、小花锦葵、粉蓝烟草、龙葵、罗勒和苦苣菜。番茄受侵染后叶部出现黄斑，叶脉轻微枯萎，有时畸形，果实表面通常有斑点，植物矮小并扭曲。PepMV主要分布在秘鲁、荷兰和英国，对欧洲及美洲的番茄生产造成了毁灭性影响，被欧洲及地中海植物保护组织(EPPO)列于警戒目录，我国尚无分布情况的报道。PSTVd、TRSV和PepMV均可侵染番茄，具有寄主范围广泛、可种传、传播途径多样的特点，一旦随生产性引种传入、扩散和蔓延，将对番爺生产构成严重障碍，对我国的生态安全、农业生产的正常发展造成严重影响。
[0003]目前番茄病毒病和类病毒病的主要检测方法有生物学测定、血清学测定、电子显微镜技术和分子生物学技术。生物学方法的鉴别寄主法简单易行，反应灵敏，但工作量比较大，常常受温室条件和时间的限制，加之症状反应常受环境、土壤和气候条件的影响，在一定程度上制约了鉴别寄主方法的应用。采用ELISA方法检测植物病毒，操作过程简便、快捷，但由于交叉反应等问题，可能出现假阳性。利用电子显微镜检测病毒，可直接观察病毒的大小、形态，但存在设备昂贵，技术要求高，准确性和灵敏度较低的弱点。对PSTVd而言，其侵染植物隐症现象比较普遍，症状表现受环境温度的影响较大，而且几种鉴别植物对不同类病毒的反应症状相似，所以难于应用生物学方法进行诊断；类病毒不产生蛋白质，无法使用血清学方法检测。与血清学方法相比较，RT-PCR技术不需要制备抗体，而且检测所需的病毒量少，具有灵敏、快速、特异性强等优点，已成功地用于各种病毒的快速检测。由于常规PCR技术一次只能扩增一个模板，如果反应体系中含有两种以上的病原物，则需进行多次PCR，不但操作复杂，而且费用高，耽误时间。多重PCR法使用多对引物，可在一个反应中扩增多种靶序列，其优点是可以在一种样品中同时鉴别多种病毒，并将PCR的敏感性和快速性结合起来，避免了逐一扩增待测样品中每种病原的麻烦，可提高诊断的敏感性，同时降低检测费用。
[0004]目前PSTVd、TRSV和P印MV已建立单一 RT-PCR分子检测技术，但尚未见这3种重要种传病原的多重PCR体系的报道。建立稳定灵敏的多重RT-PCR技术,可实现在同一反应管中同时对PSTVd、TRSV和P印MV三种病原进行鉴别检测，提高检测准确性，缩短检测周期，降低检测成本，降低病原物种传的危险性，为农业生产安全和制种业发展提供技术保障。
【发明内容】
[0005]本实用新型的目的提供一种番茄种传病原多重PCR检测试剂盒，番茄种传病原为马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒或烟草环斑病毒。
[0006]为实现上述目的，本实用新型的技术方案是一种番茄种传病原多重PCR检测试剂盒，番茄种传病原为马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒或烟草环斑病毒，其特征在于包括有在盒体内设有RT-PCR buffer管，内装2 X RT-PCRbuffer, 100-250 μ L ；引物管，分别装马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd上游引物V -ATTCCCGCCGAAACAGG-3 ’，浓度为10μπιΟ1/1，10-30μ?;马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd下游引物5' -CCCGAAGCAAAGAAGAT AGAGAAA-3 '，浓度为 10 μ mol/L, 10-30 μ L ;凤果花叶病毒 P印MV上游引物 5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'，浓度为 10 μ mol/L, 10-30 μ L ;凤果花叶病毒P印MV下游引物 5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3'，浓度为 10 μ mol/L，10-30 μ L ;烟草环斑病毒 TRSV 上游引物 5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3 '，浓度为 10 μ mol/L, 10-30 μ L ;烟草环斑病毒TRSV下游引物5' -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'，浓度为 10 μ mol/L, 10-30 μ L ；酶管，内装反转录酶及DNA聚合酶MixJOyL;去离子水管，内装无RNA酶的去离子水，100 μ L-1mL ;阳性对照管，内装马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd、凤果花叶病毒PepMV和烟草环斑病毒TRSV无侵染活性的阳性对照各20-60 μ L0
[0007]本实用新型根据PSTVd和PepMV的保守序列区设计了检测引物，建立并优化了多重RT-PCR反应体系和反应程序。
[0008]有益效果:本实用新型能同时检测番茄3种重要种传病原，快速准确，避免了常规PCR的重复检测。利用该检测方法能特异扩增出马铃薯纺锤块茎类病毒、烟草环斑病毒和凤果花叶病毒的基因片段且最低能检测到I μ g的总核酸模板，检测的稳定性好，特异性强，一致性高，可用于PSTVd、TRSV和PepMV的同时早期诊断和田间病原调查，实现了番茄多种病毒病和类病毒病的高效快速检测，有利于摸清田间3种病害发生状况，可为健康番茄种子的调运等提供有效的监控手段，确保番茄生产安全，还对番茄其它病原的检测具有一定的参考价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为本实用新型的主视图。
【具体实施方式】[0010]以下对本实用新型的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本实用新型，并非用于限定本实用新型的范围。所述【技术领域】的普通技术人员依据以上本实用新型公开的内容和各参数所取范围，均可实现本实用新型的目的。
[0011]实施例1:一种番茄种传病原多重PCR检测试剂盒，番茄种传病原为马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒或烟草环斑病毒，包括有在盒体I内设有RT-PCR buffer管2，内装2XRT-PCR buffer，250yL;装马铃薯纺锤块茎类病毒引物管3，PSTVd上游引物
-ATTCCCGCCGAAACAGG-3 ;，浓度为10 μ mol/L，30 μ L ;马铃薯纺锤块茎类病毒引物管4，PSTVd 下游引物 5 ' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3 '，浓度为 10 μ mol/L, 30 μ L ;凤果花叶病毒引物管 5，PepMV 上游引物 5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'，浓度为 10 μ mol/L，30y L ;凤果花叶病毒引物管6，P印MV下游引物5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3 '，浓度为10ymol/L，30yL;烟草环斑病毒引物管7，TRSV上游引物5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'，浓度为 10 μ mol/L, 30 μ L ;烟草环斑病毒 TRSV 下游引物引物管 8，5^ -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'，浓度为 10 μ mol/L，30 μ L ;酶管 9，内装反转录酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;去离子水管10，内装无RNA酶的去离子水，ImL ;阳性对照管，内装马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd对照管11、凤果花叶病毒PepMV对照管12和烟草环斑病毒TRSV对照管13无侵染活性的阳性对照各60 μ L0
[0012]实施例2:—种番爺种传病原多重PCR检测试剂盒,番爺种传病原为马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒或烟草环斑病毒，包括有在盒体I内设有RT-PCR buffer管2，内装2XRT-PCR buffer，150 μ L ;装马铃薯纺锤块茎类病毒引物管3，PSTVd上游引物
-ATTCCCGCCGAAACAGG-3 ;，浓度为10 μ mol/L，20 μ L ;马铃薯纺锤块茎类病毒引物管4，PSTVd 下游引物 5 ' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3'，浓度为 10 μ mol/L, 20 μ L ;凤果花叶病毒引物管 5，PepMV 上游引物 5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'，浓度为 10 μ mol/L，20y L ;凤果花叶病毒引物管6，P印MV下游引物5' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3 '，浓度为10ymol/L，20yL;烟草环斑病毒引物管7，TRSV上游引物5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3`'，浓度为 10 μ mol/L, 20 μ L ;烟草环斑病毒 TRSV 下游引物引物管 8，5^ -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'，浓度为 10 μ mol/L，20 μ L ;酶管 9，内装反转录酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;去离子水管10，内装无RNA酶的去离子水，500 μ L ；阳性对照管，内装马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd对照管11、凤果花叶病毒PepMV对照管12和烟草环斑病毒TRSV对照管13无侵染活性的阳性对照各40 μ L0
[0013]实施例3:—种番爺种传病原多重PCR检测试剂盒,番爺种传病原为马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒或烟草环斑病毒，包括有在盒体I内设有RT-PCR buffer管2，内装2XRT-PCR buffer，IOOyL;装马铃薯纺锤块茎类病毒引物管3，PSTVd上游引物
-ATTCCCGCCGAAACAGG-3 ;，浓度为10 μ mol/L，10 μ L ;马铃薯纺锤块茎类病毒引物管4，PSTVd 下游引物 5 ' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3 '，浓度为 10 μ mol/L, 10 μ L ;凤果花叶病毒引物管 5，PepMV 上游引物 5' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3'，浓度为 10 μ mol/L，10yL;凤果花叶病毒引物管6，P印MV下游引物5 ' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3 '，浓度为10ymol/L，10yL;烟草环斑病毒引物管7，TRSV上游引物5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'，浓度为 10 μ mo 1/L，10 μ L ;烟草环斑病毒 TRSV 下游引物引物管 8，5^ -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'，浓度为 10 μ mol/L，10 μ L ;酶管 9，内装反转录酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;去离子水管10，内装无RNA酶的去离子水，100 μ L ；阳性对照管，内装马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd对照管11、凤果花叶病毒PepMV对照管12和烟草环斑病毒TRSV对照管13无侵染活性的阳性对照各20 μ L0
[0014]使用时，番茄种传病原多重PCR检测方法，步骤为:
[0015]I)总核酸提取:
[0016](I)取感染马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒或烟草环斑病毒的番茄叶片；称取0.1g感染病毒样品组织倒在洁净的研钵内，加液氮研磨成粉末状；
[0017](2)移入1.5mL离心管中，然后加入ImL的TRIzol，剧烈振荡3min以上；
[0018](3)在4°C下，12000rpm离心IOmin以除去不溶成分,将上清液转入另一新的1.5mL离心管中；
[0019](4)在室温下静置5min,加0.2mL氯仿/mL TRIzol,剧烈振荡15s,然后在室温下静置15min,再于4°C、12000rpm的条件下离心15min ；
[0020](5)将上层水相转移到新的1.5mL离心管中，加0.5mL异丙醇/mLTRIzol，上下颠倒混匀，室温静置15min ；
[0021](6) 4°C、12000rpm 离心 IOmin ;
[0022](7)弃上清，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4°C、7500rpm离心2min，弃乙醇；
[0023](8)沉淀在室温下干燥IOmin或在冷冻离心浓缩机上浓缩5min，加入30 μ L无RNase水溶解，_70°C保存备用。
[0024]2) RT-PCR 反应体系为 50 μ L，其中 2X RT-PCR buffer25 μ L, RT/Taq Mix2 μ L,10 μ mol/L PSTVd 上下游引物各 1.5 μ L, 10 μ mol/L PepMV 上下游引物各 0.5 μ L, 10 μ mol/L TRSV上下游引物各0.25 μ L，总RNA模板3 μ L，灭菌去离子水补足反应总体积；
[0025]3).RT-PCR 反应条件为:
[0026]cDNA 合成:50°C 30min, I 个循环；
[0027]PCR 扩增:94°C预变性 3min ;94°C变性 30s，50°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35 个循环；最后72°C延伸IOmin ；
[0028]4 ).RT-PCR扩增产物电泳检测:
[0029]用TAE电泳缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶，在室温下进行水平电泳。加10 μ LPCR扩增产物，以健康番茄总核酸的反转录物PCR产物为阴性对照，以DLlOOOMarker为标准分子量；100V/80mA下电泳30分钟，用SYBR Safe代替EB染色，用凝胶成像系统观察并拍照，马铃薯纺锤块茎类病毒扩增产物为一条163bp的条带，凤果花叶病毒扩增产物为一条625bp的条带，烟草环斑病毒扩增产物为一条348bp的条带。
[0030]以上所述仅为本实用新型的较佳实施例，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种番茄种传病原多重PCR检测试剂盒，番茄种传病原为马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒或烟草环斑病毒，其特征在于包括有在盒体内设有RT-PCR buffer管，内装2XRT-PCR buffer, 100-250 μ L ;引物管，分别装马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd上游引物V -ATTCCCGCCGAAACAGG-3 '，浓度为10 μ mol/L, 10-30 μ L ;马铃薯纺锤块茎类病毒 PSTVd 下游引物 5 ' -CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3 '，浓度为 10 μ mol/L，10-30 μ L ；凤果花叶病毒P印MV上游引物5 ' -ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3 '，浓度为10 μ mol/L，。10-30 yL;凤果花叶病毒P印MV下游引物5 ' -AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3 '，浓度为。10 μ mol/L, 10-30 μ L ;烟草环斑病毒 TRSV 上游引物 5' -CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3'，浓度为 10 μ mol/L, 10-30 μ L ;烟草环斑病毒 TRSV 下游引物 5 ' -ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3'，浓度为10 μ mol/L, 10-30 μ L ;酶管，内装反转录酶及DNA聚合酶Mix，20 μ L ;去离子水管，内装无RNA酶的去离子水，100 μ L-1mL ;阳性对照管，内装马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVcUM果花叶病毒P印MV和烟草环斑病毒TRSV无侵染活性的阳性对照各20-60 μ L。
【文档编号】C12Q1/70GK203582881SQ201320605630
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年9月28日 优先权日:2013年9月28日
【发明者】文朝慧, 王军平, 王肃军, 刘雯 申请人:甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心