设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及病原菌检验试剂盒。设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒，包括一盒体，盒体内装有无菌取样器、裂解液，盒体内还装有一一次性微流控芯片，一次性微流控芯片包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，上层基板和下层基板键合在一起；上层基板、下层基板中的至少一个上设有一PCR通道和一CE通道，PCR通道与CE通道存在至少一个交叉点，PCR通道和CE通道的端口处均开有一槽，上层基板、下层基板中的至少一个在与槽相对应的位置开有用于填充试剂和安置电极的孔。本使用新型材料和制备成本都很低，可一次性使用；而且支持PCR和CE同步测试，可提高检测效率。
【专利说明】设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及分子生物检测【技术领域】，尤其涉及病原菌检验试剂盒。
【背景技术】
[0002]牙周病仅次于龋病，是危害人类牙齿健康的第二大口腔疾病。人口腔内的细菌会附着在牙齿表面形成牙菌斑，这些细菌及其产物进入牙龈后，会引起牙龈纤维溶解及炎症，炎症导致牙槽骨吸收，最终出现牙齿松动甚至脱落等症状。牙周病不仅给患者的日常生活造成痛苦，影响咀嚼和消化能力，而且也与中风、冠心病、糖尿病等重大疾病有一定的关系。及时发现牙周病，并加以控制和治疗，对提高生活质量和降低健康风险都具有重要意义。
[0003]目前常用的临床检验方法大多基于传统问诊方式，通过肉眼观察牙周袋的形貌，牙齿松动症状等，而常用的X光检验则只能检测牙周病造成的骨组织破坏。这些方法都只能适用于对中晚期的、处于发病期的情况进行诊断，很难用于牙周病的预防和早期报告。在最近十年间，随着人们对牙周病致病菌的深入认识，微生物检测逐渐得到关注。例如牙龈卟啉菌(Porphyromonas Gingivalis,下文用 Pg表不)，齿密螺旋体(Treponema Denticola,下文用Td表示),福赛斯坦纳菌(Tannerella Forsythensis, Tf )等被认为是与牙周病发病密切相关的特异性细菌。但是，传统的细菌检测需要进行细菌培养，操作繁琐，耗时长，难以满足快速临床应用。
[0004]16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，集保守性与变异性于一身，是广泛应用的细菌检测靶基因。通过特定设计的引物，聚合酶链式反应(PolymeraseChain React1n, PCR)和毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE),可以有效地完成细菌的检测，并且具有特异性强、灵敏度高的优点。进一步的，运用微流控技术将PCR和CE所需的反应腔体或通道微型化，可极大减少试剂消耗和分析时间。将PCR和CE的通道集成在一个芯片上，可提高分析过程的自动化程度，简化操作，提高分析效率。微流控芯片大多使用具有一定机械强度且光学透明的材料，其中，聚合物材料质量轻、易于加工、成本低，可以制作成一次性器具，十分适合大规模应用。
实用新型内容
[0005]本实用新型的目的在于，利用上述特点，提供一种设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒。
[0006]本实用新型所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现:
[0007]设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒，包括一盒体，所述盒体内装有无菌取样器、裂解液，其特征在于，所述盒体内还装有一一次性微流控芯片，所述一次性微流控芯片包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，所述上层基板和所述下层基板键合在一起；
[0008]所述上层基板、所述下层基板中的至少一个上设有一 PCR通道和一 CE通道，所述PCR通道与所述CE通道存在至少一个交叉点，所述PCR通道和所述CE通道的端口处均开有一槽，
[0009]所述上层基板、所述下层基板中的至少一个在与所述槽相对应的位置开有用于填充试剂和安置电极的孔。
[0010]所述PCR通道是一条曲折通道，包含直线部分和弯曲部分；
[0011]所述直线部分包括平行排布的复数条直线通道，所述弯曲部分包括复数个弧形通道，一个直线通道的左端通过一个弧形通道与相邻的下一个直线通道的左端相连，右端通过一个弧形通道与相邻的上一个直线通道的右端相连。
[0012]以位于所述PCR通道的起始端的槽作为进样池，以位于所述PCR通道的末端的槽作为废液池。
[0013]所述CE通道，是一条直线通道，或者是如所述PCR通道式的曲折通道。以位于所述CE通道的起始端的槽作为分离液池，以位于所述CE通道的末端的槽作为废液池。
[0014]一次性微流控芯片的单侧或两侧贴有至少两个控温元件，控温元件的排列方向与PCR通道中的直线通道的排列方向垂直。控温元件优选金属片(例如铜、铝)。单侧控温元件的数量是2?3个。不同控温元件设置不同的温度，使得PCR通道中的每个直线通道都跨越多个不同的温度区，分别进行PCR反应的变性、延伸和退火。
[0015]所述PCR通道中填充有PCR反应液，CE通道中填充有电泳液。
[0016]所述PCR反应液可以是一用于对Pg细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖的PCR反应液。用于对Pg细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖的PCR反应液包括:IX Tris 缓冲液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2.5nM, DNA 聚合酶，以及 Pg 细菌的特异性引物200nM，上述溶液均以去离子水配制。所述引物序列为:
[0017]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0018]下游引物:3’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5’。
[0019]所述PCR反应液还可以是一用于对Td细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖的PCR反应液。用于对Td细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖的PCR反应液包括:1X Tris 缓冲液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2.5nM, DNA 聚合酶，以及Td细菌的特异性引物200nM，上述溶液均以去离子水配制。所述引物序列为:
[0020]上游引物:5’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3 ’
[0021]下游引物:3’-TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5’
[0022]所述PCR反应液还可以是一用于同时对Pg和Td细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖的PCR反应液。用于同时对Pg和Td细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖的 PCR 反应液包括:1X Tris 缓冲液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2.5nM,DNA聚合酶，以及Pg细菌和Td细菌的特异性引物各200nM，上述溶液均以去离子水配制。所述引物序列为:
[0023]Pg 细菌
[0024]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0025]下游引物:3’ -ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5 ’
[0026]Td 细菌
[0027]上游引物:5’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3 ’
[0028]下游引物:3’ -TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5 ’。
[0029]试剂盒保存条件优选为-20 V。
[0030]作为一种优选方案，所述上层基板、所述下层基板的长度为72mm、宽度为22mm，所述PCR通道的直线通道的长度为13mm，所述CE通道的总长度为17mm。所述进样池直径5mm，深0.5mm ;所述分离液池直径4mm,深0.5mm。所述直线部分包括平行排布的58条直线通道。
[0031]有益效果:本使用新型材料和制备成本都很低，可一次性使用；而且支持PCR和CE同步测试，可提高检测效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为一次性微流控芯片的一种结构示意图，其中，I 一芯片基板，2 — PCR通道，3 一电泳通道,4 一进样池,5 —控温兀件，6 —试剂池。
[0033]图2是采用(I)所述试剂盒，经过取样、裂解、PCR反应和电泳后得到的检测信号，其中，(a)是PCR反应的引物产生的信号，(b)是197bp的Pg细菌特异性序列产生的信号。
[0034]图3是采用(2)所述试剂盒，经过取样、裂解、PCR反应和电泳后得到的检测信号，其中，Ca)是PCR反应的引物产生的信号，(b)是311bp的Td细菌特异性序列产生的信号。
【具体实施方式】
[0035]为了使本实用新型实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示进一步阐述本实用新型。
[0036](I) Pg快速检验试剂盒
[0037](1.1)所述Pg快速检验试剂盒内装有:无菌取样器，裂解液，一次性微流控芯片。
[0038](1.2)所述无菌取样器用于从口腔中采集细菌样本，例如无菌棉签、吸潮纸尖。
[0039](1.3)所述裂解液用于破坏采集到的细菌的细胞壁，使得细菌细胞的内容物，包括细菌的DNA释放到溶液中。例如PBS (Phosphate Buffered Saline)。
[0040](1.4)所述一次性微流控芯片是PCR-CE集成芯片，用于完成细菌特异性基因序列的增殖和检测，且在使用后可抛弃。芯片由两块聚合物(例如聚甲基丙烯酸甲酯，聚二甲基硅氧烷)基板键合而成，一块基板上制作有通道和槽孔结构，另一块基板是平板或制作有槽孔结构。芯片可采用注塑、印模等工艺实现大规模生产制作。
[0041]芯片上的通道包含有PCR通道和CE通道，PCR通道的末端与CE通道是交叉的(例如，可以是十字交叉，或双T形交叉)。槽孔结构制作于PCR通道和CE通道的端点，作为试剂池，用于填充试剂和放置电极。
[0042]PCR通道是一条曲折的通道，由平行排列的直线通道，以及连接相邻直线通道的弯曲通道构成。
[0043]电泳通道是一条直线通道，也可以是由弯曲通道连接起来的几段直线通道。
[0044]芯片的单侧或两侧贴合有控温元件，控温元件是具有良好导热性能的金属片(例如铜、铝)。控温元件的排列方向与PCR通道中的直线通道的排列方向垂直，单侧控温元件的数量是2?3个。不同控温元件设置不同的温度，使得PCR通道中的每个直线通道都跨越多个不同的温度区，分别进行PCR反应的变性、延伸和退火。
[0045]微流控芯片的PCR通道中填充有PCR反应液，CE通道中填充有电泳液。
[0046](1.5)所述PCR反应液用于对Pg细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖。其中包括:1X Tris 缓冲液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2.5nM，DNA 聚合酶，以及Pg细菌的特异性引物200nM，上述溶液均以去离子水配制。所述引物序列为:
[0047]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0048]下游引物:3，-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5，
[0049]试剂盒保存条件:_20°C
[0050](1.6)所述电泳液用于将采用所述PCR反应液得到的DNA分子进行电泳分离，使得DNA分子的电泳时间与其分子长度呈现正相关的关系。
[0051](2) Td快速检验试剂盒
[0052](2.1)所述Td快速检验试剂盒内装有:无菌取样器，裂解液，一次性微流控芯片。
[0053](2.2)所述无菌取样器用于从口腔中采集细菌样本，例如无菌棉签、吸潮纸尖。
[0054](2.3)所述裂解液用于破坏采集到的细菌的细胞膜，使得细菌细胞的内容物，包括细菌的DNA释放到溶液中，例如PBS (Phosphate Buffered Saline)。
[0055](2.4)所述一次性微流控芯片是PCR-CE集成芯片，用于完成细菌特异性基因序列的增殖和检测，且在使用后可抛弃。芯片由两块聚合物(例如聚甲基丙烯酸甲酯，聚二甲基硅氧烷)基板键合而成，一块基板上制作有通道和槽孔结构，另一块基板是平板或制作有槽孔结构。芯片可采用注塑、印模等工艺实现大规模生产制作。
[0056]芯片上的通道包含有PCR通道和CE通道，PCR通道的末端与CE通道是交叉的(例如，可以是十字交叉，或双T形交叉)。槽孔结构制作于PCR通道和CE通道的端点，作为试剂池，用于填充试剂和放置电极。
[0057]PCR通道是一条曲折的通道，由平行排列的直线通道，以及连接相邻直线通道的弯曲通道构成。
[0058]电泳通道是一条直线通道，也可以是由弯曲通道连接起来的几段直线通道。
[0059]芯片的单侧或两侧贴合有控温元件，控温元件是具有良好导热性能的金属片(例如铜、铝)。控温元件的排列方向与PCR通道中的直线通道的排列方向垂直，单侧控温元件的数量是2?3个。不同控温元件设置不同的温度，使得PCR通道中的每个直线通道都跨越多个不同的温度区，分别进行PCR反应的变性、延伸和退火。
[0060]微流控芯片的PCR通道中填充有PCR反应液，CE通道中填充有电泳液。
[0061](2.5)所述PCR反应液用于对Td细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖。其中包括:1X Tris 缓冲液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2.5nM，DNA 聚合酶，以及Td细菌的特异性引物200nM，上述溶液均以去离子水配制。所述引物序列为:
[0062]上游引物:5’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3 ’
[0063]下游引物:3’ -TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5 ’
[0064]试剂盒保存条件:_20°C
[0065](2.6)所述电泳液用于将采用所述PCR反应液得到的DNA分子进行电泳分离，使得DNA分子的电泳时间与其分子长度呈现正相关的关系。
[0066](3)同时快速检验Pg和Td的试剂盒
[0067](3.1)所述同时快速检验Pg和Td的试剂盒内装有:无菌取样器，裂解液，一次性微流控芯片。
[0068](3.2)所述无菌取样器用于从口腔中采集细菌样本，例如无菌棉签、吸潮纸尖。
[0069](3.3)所述裂解液用于破坏采集到的细菌的细胞膜，使得细菌细胞的内容物，包括细菌的DNA释放到溶液中，例如PBS (Phosphate Buffered Saline)。
[0070](3.4)所述一次性微流控芯片是PCR-CE集成芯片，用于完成细菌特异性基因序列的增殖和检测，且在使用后可抛弃。芯片由两块聚合物(例如聚甲基丙烯酸甲酯，聚二甲基硅氧烷)基板键合而成，一块基板上制作有通道和槽孔结构，另一块基板是平板或制作有槽孔结构。芯片可采用注塑、印模等工艺实现大规模生产制作。
[0071]芯片上的通道包含有PCR通道和CE通道，PCR通道的末端与CE通道是交叉的(例如，可以是十字交叉，或双T形交叉)。槽孔结构制作于PCR通道和CE通道的端点，作为试剂池，用于填充试剂和放置电极。
[0072]PCR通道是一条曲折的通道，由平行排列的直线通道，以及连接相邻直线通道的弯曲通道构成。
[0073]电泳通道是一条直线通道，也可以是由弯曲通道连接起来的几段直线通道。
[0074]芯片的单侧或两侧贴合有控温元件，控温元件是具有良好导热性能的金属片(例如铜、铝)。控温元件的排列方向与PCR通道中的直线通道的排列方向垂直，单侧控温元件的数量是2?3个。不同控温元件设置不同的温度，使得PCR通道中的每个直线通道都跨越多个不同的温度区，分别进行PCR反应的变性、延伸和退火。
[0075]微流控芯片的PCR通道中填充有PCR反应液，CE通道中填充有电泳液。
[0076](3.5)所述PCR反应液用于同时对Pg和Td细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖。其中包括:ix Tris 缓冲液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2.5nM，DNA聚合酶，以及Pg细菌和Td细菌的特异性引物各200nM，上述溶液均以去离子水配制。所述引物序列为:
[0077]Pg 细菌
[0078]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0079]下游引物:3，-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5’
[0080]Td 细菌
[0081 ]上游引物:5 ’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3，
[0082]下游引物:3，-TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5’
[0083]试剂盒保存条件:_20°C
[0084](3.6)所述电泳液用于将采用所述PCR反应液得到的DNA分子进行电泳分离，使得DNA分子的电泳时间与其分子长度呈现正相关的关系。
[0085](4)检测方法
[0086](I)、(2)或(3)所述的检验试剂盒的使用步骤，以及检测方法如下:
[0087]步骤一，使用(1.2),(2.2)或(3.2)所述的无菌取样器，例如无菌棉签或吸潮纸尖，擦拭龈沟或牙周袋I分钟，取得含有口腔细菌的龈缝液。
[0088]步骤二，将无菌取样器沾有龈缝液的部分浸泡在(1.3)、(2.3)或(3.3)所述的裂解液中，浸泡时间例如3分钟，使得样本中的口腔细菌的内容物充分释放在溶液中。
[0089]步骤三，取步骤二所得到的溶液适量(例如I μ L)，添加到(1.4)、( 2.4)或(3.4)所述集成芯片的PCR通道起始端点的芯片进样池中。给控温元件设置适当的温度，例如单侧采用2个控温元件，并分别设置成95°C (变性)和64°C (退火和延伸)。
[0090]步骤四，给PCR通道两端的电极施加电压，驱动PCR反应液中的DNA序列沿PCR通道流动，反复经过95°C (变性)和64°C (退火和延伸)两个温度区，对Pg、Td或两者同时进行特异性的PCR增殖。
[0091]步骤五，当PCR反应液中的DNA序列已穿越PCR通道与CE通道的交叉部分后，自动取消PCR通道两端的电压，同时在CE通道的两端施加电压，进行DNA序列的电泳分离，并进行DNA分子的诱导荧光检测。诱导荧光是本领域人员所知晓的一种技术。当使用(I)所述的试剂盒，若检测到197bp的DNA，即表明口腔中有Pg细菌，反之则没有。当使用(2)所述的试剂盒，若检测到311bp的DNA，即表明口腔中有Td细菌，反之则没有。当使用(3)所述的试剂盒，若检测到197bp，表明口腔中含有Pg细菌；若电泳检测到31 Ibp，表明口腔中含有Td细菌；若197bp和311bp都被检测到，表明同时含有Pg和Td两种细菌。反之，若没有197bp，则没有Pg细菌；若没有311bp，则没有Td细菌；若197bp和31 Ibp都没有，则两种细菌都没有。上述步骤三?五都在微流控芯片上完成，并且电压的施加和取消，以及荧光检测均自动控制。
[0092]本实用新型的有益效果在于:
[0093]特异性强，灵敏度高。通过PCR反应和特异性引物，样本中对应于Pg和Td的DNA序列数量得到极大增加，其增殖倍数可达I O9，样本中的少量Pg和Td细菌就可被检测到，十分适合早期预报和发现。而样本中其它来源的DNA数量则不会得到增加，不会干扰目标细菌的检验。
[0094]速度快，效率高，操作简便。使用本实用新型所述的检验试剂盒，从口腔取样到获得检测结果，整个过程不超过20分钟。检验过程中的人工操作仅需从口腔中取样浸入裂解液，以及从裂解液中取样加入微流控芯片。
[0095]试剂盒以及运行成本低。本实用新型所述试剂盒包含的试剂体积很小，通常不超过200 μ L ;所述微流控芯片采用聚合物材料，材料和制备成本都很低，可一次性使用；因此整个试剂盒的成本，以及分析检测的运行成本都很低。
[0096]实施例1.口腔中Pg细菌的快速检验
[0097]①为快速检验Pg细菌设计的试剂盒包含:
[0098]无菌取样器:吸潮纸尖。
[0099]裂解液:PBS，100yL。
[0100]一次性PCR-CE集成芯片:结构如图1示意(单位:mm)，基板I的材料为聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)，尺寸 22X72。PCR 通道 2 截面 0.1X0.1，弯曲折叠的PCR通道包含58段以弯道连接的平行直线通道，每一段的长度为13。电泳通道3截面0.1X0.1，总长度17。芯片进样池4直径5，深0.5。试剂池6直径4，深0.5。2个控温元件5，温度分别为95°C和64°C。
[0101]PCR 反应液:含有 IX Tris 缓冲液(pH=8) 5 μ L ；dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各2.5nM，共4 μ L ;DNA聚合酶0.25 μ L ;Pg细菌的特异性引物200nM,上/下游引物各I μ L ;去离子水37.75 μ L ;共49 μ L。Pg细菌的特异性引物序列为:
[0102]上游引物:5，-TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3’
[0103]下游引物:3’ -ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5，
[0104]电泳液:0.5%羟乙基纤维素(1300k)溶液，含Ix SYBR Green I，共50 μ L。
[0105]②使用上述试剂盒的检验过程包括:
[0106]使用吸潮纸尖擦拭龈沟I分钟，取得含有口腔细菌的龈缝液。将吸潮纸尖上沾有龈缝液的尖端部分浸泡在裂解液中3分钟。取含有细菌细胞内容物的裂解液I μ L，加入芯片进样池，在PCR通道两端施加电压。14分钟后，自动取消PCR通道两端电压，然后在电泳通道两端施加电压，电场强度200V/cm电泳，采用荧光检测。检测信号如图2所示，出现在约0.75分钟的信号(a)来自于PCR液中的引物；出现在约1.4分钟的信号(b )是来自于Pg细菌的197bp的特异性序列，表明样本中存在Pg细菌。从口腔取样到获得检测结果仅需约20分钟。
[0107]实施例2.口腔中Td细菌的快速检验
[0108]①为快速检验Td细菌设计的试剂盒包含:
[0109]无菌取样器:吸潮纸尖。
[0110]裂解液:PBS，100yL。
[0111]PCR-CE集成芯片:结构如图1示意(单位:mm)，基板I的材料为聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)，尺寸 22 X 72。PCR通道 2 截面 0.1 X 0.1，弯曲折叠的 PCR通道包含58段以弯道连接的平行直线通道，每一段的长度为13。电泳通道3截面0.1X0.1，总长度17。芯片进样池4直径5，深0.5。试剂池6直径4，深0.5。2个控温元件5，温度分别为95。。和64。。。
[0112]PCR 反应液:含有 IX Tris 缓冲液(pH=8) 5 μ L ；dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各2.5ηΜ#4μ? ;DNA聚合酶0.25 μ L ;Td细菌的特异性引物200ηΜ，上/下游引物各IyL;去离子水37.75 μ L ;共49 μ L。Td细菌的特异性引物序列为:
[0113]上游引物:5’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3，
[0114]下游引物:3’ -TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5 ’
[0115]电泳液:(λ 5%羟乙基纤维素(1300k)溶液，含Ix SYBR Green I，共50 μ L。
[0116]②使用上述试剂盒的检验过程包括:
[0117]使用吸潮纸尖擦拭龈沟I分钟，取得含有口腔细菌的龈缝液。将吸潮纸尖上沾有龈缝液的尖端部分浸泡在裂解液中3分钟。取含有细菌细胞内容物的裂解液I μ L，加入芯片进样池，在PCR通道两端施加电压。14分钟后，自动取消PCR通道两端电压，然后在电泳通道两端施加电压，电场强度200V/cm电泳，采用荧光检测。检测信号如图3所示，出现在约0.75分钟的信号(a)来自于PCR液中的引物；出现在约2分钟的信号(b)是来自于Td细菌的311bp的特异性序列，表明样本中存在Td细菌。从口腔取样到获得检测结果仅需约20分钟。
[0118]牙銀P卜啉菌(PorphyromonasGingivalis,Pg)
[0119]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0120]下游引物:3，-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5，
[0121]齿密螺旋体(TreponemaDenticola,Td)
[0122]上游引物:5’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3 ’
[0123]下游引物:3’ -TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5 ’
[0124]以上显示和描述了本实用新型的基本原理和主要特征和本实用新型的优点。本行业的技术人员应该了解，本实用新型不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本实用新型的原理，在不脱离本实用新型精神和范围的前提下，本实用新型还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本实用新型范围内。本实用新型要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【权利要求】
1.设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒，包括一盒体，所述盒体内装有无菌取样器、裂解液，其特征在于，所述盒体内还装有一一次性微流控芯片，所述一次性微流控芯片包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，所述上层基板和所述下层基板键合在一起； 所述上层基板、所述下层基板中的至少一个上设有一 PCR通道和一 CE通道，所述PCR通道与所述CE通道存在至少一个交叉点，所述PCR通道和所述CE通道的端口处均开有一槽， 所述上层基板、所述下层基板中的至少一个在与所述槽相对应的位置开有用于填充试剂和安置电极的孔。
2.根据权利要求1所述的设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒，其特征在于:所述PCR通道是一条曲折通道，包含直线部分和弯曲部分； 所述直线部分包括平行排布的复数条直线通道，所述弯曲部分包括复数个弧形通道，一个直线通道的左端通过一个弧形通道与相邻的下一个直线通道的左端相连，右端通过一个弧形通道与相邻的上一个直线通道的右端相连； 以位于所述PCR通道的起始端的槽作为进样池，以位于所述PCR通道的末端的槽作为废液池。
3.根据权利要求1或2所述的设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒，其特征在于:所述CE通道，是一条直线通道，或者是如所述PCR通道式的曲折通道； 以位于所述CE通道的起始端的槽作为分离液池，以位于所述CE通道的末端的槽作为废液池。
4.根据权利要求3所述的设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒，其特征在于:一次性微流控芯片的单侧或两侧贴有至少两个控温元件，控温元件的排列方向与PCR通道中的直线通道的排列方向垂直。
5.根据权利要求4所述的设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒，其特征在于:控温元件为金属片。
6.根据权利要求3所述的设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒，其特征在于:所述上层基板、所述下层基板的长度为72_、宽度为22_，所述PCR通道的直线通道的长度为13mm，所述CE通道的总长度为17mm。
7.根据权利要求6所述的设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒，其特征在于:所述进样池直径5mm,深0.5mm ;所述分离液池直径4mm,深0.5mm。
8.根据权利要求2所述的设有一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒，其特征在于:所述直线部分包括平行排布的58条直线通道。
【文档编号】C12M1/38GK204039409SQ201320892492
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】倪一, 李振庆, 窦晓鸣, 山口佳则 申请人:倪一, 窦晓鸣