具有提高的物理稳定性的人碳酸酐酶ii的制作方法
【专利摘要】描述了一种具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，其序列对应于经修饰的人碳酸酐酶II。该经分离多肽包括突变A23C、S99C、L202C、C205S以及V241C，并且该多肽具有与野生型碳酸酐酶II相比提高的物理稳定性。另外，该多肽包括在C23与C202之间和/或在C99与C241之间的二硫桥键。
【专利说明】具有提高的物理稳定性的人碳酸酐酶N
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有如由提高的热力学、热以及动力学稳定性所定义的如与野生 型酶相比提高的物理稳定性的酶人碳酸酐酶II的工程改造变体。本发明还涉及一种提高 碳酸酐酶的物理稳定性的方法。此外，本发明涉及所述酶在用于从介质提取co2的任何技 术应用中的用途。此外，本发明还涉及编码多肽以及经分离多肽的经分离多核苷酸。本发 明还涉及包括这些多核苷酸的核酸建构体和载体。
【背景技术】
[0002] 碳酸酐酶（CA，EC4. 2. 2. 1)是根据下式催化二氧化碳和水变成碳酸氢根和质子的 可逆反应的一组酶：
[0003]
【权利要求】
1. 具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，其序列对应于经修饰的人碳酸酐酶II，其中该多 肽包括突变八23(：、599(：、1^02(：、02053以及￥241(：，具有与野生型碳酸酐酶11相比提高的物 理稳定性，并且进一步包括在C23与C202之间和/或在C99与C241之间的二硫桥键。
2. 根据权利要求1所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，具有与野生型碳酸酐酶II 相比提高了 23. 5kJ/mol的一种热力学稳定性。
3. 根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，具有与野生型 碳酸酐酶II相比提高了 18. 5°C的一个解链点。
4. 根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，具有与野生型 碳酸酐酶II相比提高了 25kJ/mol的一种去折叠活化能。
5. 根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，具有在水中在 21°C下与野生型人碳酸酐酶II相比慢约22. 000倍的一个去折叠速率。
6. 根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，具有在60°C 下86天，在65°C下8天，并且在70°C下1. 6天的一个半衰期。
7. 根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，其中该经分离 多肽在乙醇胺水溶液中维持其与野生型碳酸酐酶II相比提高的物理稳定性，这些乙醇胺 包括甲基二乙醇胺（MDEA)、单乙醇胺（MEA)、二乙醇胺（DEA)以及氨基乙氧基乙醇。
8. 根据以上权利要求中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽，其中该序列是 SEQ ID NO:8。
9. 提高选自天然产生或经修饰α -碳酸酐酶超家族的碳酸酐酶（EC4. 2. 2. 1)的物理稳 定性的方法，包括将两个稳定二硫桥键的一个组合插入到SEQ ID ΝΟ:8中的C23、C99、C202 以及C241的三维等效或序列同源位置，等效于野生型人碳酸酐酶II中的位置A23、S99、 L202 以及 V241。
10. 构建体，包括编码根据权利要求1到8中任一项所述的一种多肽的一种多核苷酸， 该构建体可操作地键联到指导该多肽在一个表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
11. 重组表达载体，包括根据权利要求10所述的构建体。
12. 重组宿主细胞，包括如权利要求10所述的构建体或如权利要求11所述的重组表达 载体。
13. 根据权利要求1到8中任一项所述的具有碳酸酐酶活性的经分离多肽的用途，用于 从一种含有二氧化碳的介质中提取二氧化碳。
14. 根据权利要求13所述的用途，其中该具有碳酸酐酶活性的经分离多肽被用于一个 生物反应器中。
15. 制备SEQ ID NO:8的经分离多肽的方法，包括通过在25°C到60°C的高温下，在一种 氧化剂的存在下，在7到10的一个pH下，孵育该多肽来加速二硫桥键的形成。
16. 经分离多核苷酸，具有一个编码如权利要求1到8中任一项所定义的多肽的序列。
【文档编号】C12N9/88GK104114699SQ201380008096
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月11日 优先权日:2012年4月23日
【发明者】乌诺·卡尔松, 马丁·卡尔森 申请人:合理开采抗体酶公司