抗-脂阿拉伯甘露聚糖抗体和使用该抗体对抗酸杆菌感染的免疫测定的制作方法

抗-脂阿拉伯甘露聚糖抗体和使用该抗体对抗酸杆菌感染的免疫测定的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种单克隆抗体，其特异性结合抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖，特别是结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖，所述抗体描述如下：(A)单克隆抗体，其包含通过接头连接的重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含下述(a)-(c)所示的重链CDR1-CDR3，并且所述轻链可变区包含下述(d)-(f)所示的轻链CDR1-CDR3；(a)由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，(b)由SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，(c)由SEQ?ID?NO：3所示的氨基酸序列组成的重链CDR3，(d)由SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，(e)由SEQ?ID?NO：5所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和(f)由SEQ?ID?NO：6所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。本发明还提供所述抗体的应用。
【专利说明】抗-脂阿拉伯甘露聚糖抗体和使用该抗体对抗酸杆菌感染 的免疫测定

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合抗酸杆菌（如结核杆 菌）的脂阿拉伯甘露聚糖，并且特别涉及单链抗体（scFv)及其多价抗体。
[0002] 本发明还涉及使用所述抗体检测抗酸杆菌的方法，特别涉及用于诊断结核病 (tuberculosis)的方法或结核病诊断方法；并且涉及抗酸杆菌检测试剂（例如，结核病诊 断试剂）和抗酸杆菌检测试剂盒（例如，结核病诊断试剂盒），其用于上述方法中。
[0003] 本发明还涉及使用所述抗体确定抗结核病药物的结核病治疗效果的方法；以及用 于上述方法的用于确定抗结核病药物的治疗效果的试剂盒。

【背景技术】
[0004] 结核病是一种数千年来一直困扰人类的传染病，并且估计十九世纪欧洲1/4的成 年人口死于结核病。由于二十世纪生活标准的改善以及抗生素的发现，到二十世纪五十年 代，工业化国家已经几乎根除了结核病。然而，作为复发的传染病，结核病仍然是猖獗的。在 当下，估计在世界人口中三个人中有一个感染结核杆菌（tubercle bacillus)(潜伏的结核 病）。据说世界上新发作的结核病患者的总数有九百四十万，并且估计其中有两百万名患者 死于该病。目前，大约95%的活动性结核病（active tuberculosis)患者生活在发展中国 家，99%的死于结核病的人集中在发展中国家。
[0005] 在二十世纪九十年代，人们再次认识到结核病病例的数量仍然持续上升，成为集 中在发展中国家的最主要的传染病，并且已经开始采取全面的措施。在全球协作下已经制 定了针对结核病的对策，诸如最主要由世界卫生组织（World Health Organization, WHO) 采用的直接观察的短期治疗（Directly Observed Treatment, Short-Course, DOTS),在 直接涉及的国家、提供援助的国家和援助组织的协作下建立用于推进措施的"终止结核病 伙伴（Stop Tuberculosis partnership)"，以及"世界抗击艾滋、结核病和痕疾基金（The Global Fund to Fight AIDS，Tuberculosis and Malaria)" 作为提供经济支持的系统的 资助。现有的用作结核病对策的多种技术已经使用了几十年而没有改善。因此，在发展中 国家亟需开发有效的新技术。
[0006] 对于结核病的诊断，最重要的是在早期阶段发现结核杆菌感染以开始治疗。特别 地，由于处于细菌释放状态的患者具有向周围人群传播传染病的极高危险，因此，需要在不 与周围人群有任何接触的隔离的环境中治疗那些患者。作为用于此的检测，存在"结核病的 细菌学诊断（Bacteriological diagnosis of tuberculosis)"，并且最普遍使用其中所述 的痰液涂片检查。
[0007] 痰液涂片检查是一种在显微镜下直接观察和检查痰液涂片样品的方法（痰液涂 片样品直接显微镜检），并且由Robert Koch远在一个世纪之前建立。通过染色结核病的病 原体而鉴定临床测试样品中的分枝杆菌（Mycobacteria)。现在所用的结核病诊断方法是通 过在实践中使用Koch所用的技术而建立的。在发展中国家中，结核杆菌涂片检查是标准的 结核病诊断方法，并且还用作参比来评价新检测方法的表现。
[0008] 已经确定基因扩增方法是具有比痰液涂片检查更高的灵敏性的方法。基因扩增方 法是一种使用DNA聚合酶以链式反应方式扩增特定的DNA片段的方法。这一方法的原理是 使用要扩增的DNA，与该DNA两端的序列互补的一对DNA引物，和耐热性DNA聚合酶，并且制 定重复的温度变化，来扩增要用于检测的DNA。尽管基因扩增方法在灵敏性方面是令人满意 的，但是，由于可操作性、设备和成本原因，在发展中国家很难使用这种方法。
[0009] 作为最近的全球趋势，由于多药耐药性结核病的传播，兴趣转向培养物检测和核 酸扩增检测的必要性。然而，在现有的多种细菌学诊断方法中，痰液涂片检查（直接的痰液 显微镜检）仍然被视为结核病对策策略的中枢核心。特别地，在结核病传播的资源匮乏的 发展中国家，痰液涂片检查不仅是有效的诊断方法，而且作为确定治疗效果的方式起着重 要的作用。
[0010] 如上文所述，尽管痰液涂片检查是结核病控制基本策略的中枢核心，但是，在许多 发展中国家中进行细菌学检验的工人人数完全不足，并且据说这样的工人的技能是有问题 的。由于这一检测的有效性取决于实验室技术人员的技能，日常培训和质量控制是必需的， 并且引起综合费用的过度增加。另外，发展中国家在改善实验室环境、检测设备、检测技术 等所需要的社会基础设施方面存在许多问题。这些因素以复杂的方式纠结在一起，并且结 果以不小的程度不利地影响检测的质量。
[0011] 此外，由于痰液涂片检查是用于检测和鉴定抗酸杆菌的检测，而不是用于检测结 核杆菌的方法，因此，不可能利用该检测来鉴定结核杆菌。
[0012] 关于在发达国家的结核病治疗，在鉴定结核杆菌后开始使用化学药剂的治疗；而 在发展中国家进行的DOTS计划中，在痰液涂片检查中检测到抗酸杆菌而不是鉴定结核杆 菌时，开始使用化学药剂的治疗。此处，尽管用于结核杆菌感染和非结核性抗酸杆菌感染的 化学药剂是不同的，但是，由于尚未开发用于非结核性抗酸杆菌的高疗效的药物，基本上使 用用于结核杆菌的化学药剂进行用于非结核性抗酸杆菌的治疗。因此，患者必须忍受化学 药剂的副作用的危险。已经指出的危险的代表性实例包括严重的副作用，注入肝功能下降 和视力丧失，以及耐药性非结核性抗酸杆菌的扩散。
[0013] 如上文所述，尽管在当前所知的结核病诊断及其治疗中存在多种问题，但是，Koch 于1882年开发的痰液涂片检查方法目前仍然用于结核病的诊断，没有任何大的改善。为 了解决发展中国家和最近新兴国家中关于实验室环境所需要的社会基础设施、检测设备、 检测技术等的问题的目的，考虑两种措施，即，"建立完全使用电源和设施的允许高通量 处理在局限区域采集的样品的高灵敏性和低成本的检测方法"或"建立高灵敏性的、快速 的、容易的和低成本的并且无需使用需要电源的设备进行的护理点检测（Point Of Care Testing，P0CT)"。
[0014] 如果其实位于非常局限的地区，则电源和设备在发展中国家和最近新兴的国家中 也是就位的。另外，在此类地区已经存在进行相对先进的检测的检测中心，并且一些富有的 患者可以使用这些服务。通过使用此类检测中心，可以解决诸如实验室环境、检测设备、检 测技术和人力资源的问题。在这样的情形中，需要将患者或痰液样品由医学检查现场转移 至检测中心。在转运用于核酸扩增检测或培养物检测的痰液样品过程中存在一些主要的限 制。为了防止污染和不需要的微生物的生长，在要进行转运的痰液收集后，样品必须立即冷 冻。此外，由于将细菌保持在生长状态对于培养物检测是重要的，所以，当与遗传检测相比 较时，需要更多的注意。此外，由于在对样品进行灭菌操作，诸如热处理时，不能进行这两种 检测，因此，样品必须以严格可控的状态转运。由于在发展中国家和最近新兴的国家中没有 建立可以处理样品转运所涉及的此类限制的系统，因此，建立甚至能够在对其实施灭菌操 作的样品中进行检测的测定是重要的。
[0015] 在进行P0CT时，允许在短时间期间在临床现场进行测定，而无需使用专门的设施 和设备，是重要的。关于P0CT通常所用的技术是免疫层析检测（ICT)。通常，认为ICT在灵 敏性方面劣于免疫测定方法，如ELISA。因此，如果要用P0CT来解决问题，建立能够高灵敏 性检测的测定系统是重要的。此外，在使用P0CT的情形中，由于对于检测工人难以通过使 用检测中心等所用的安全橱等来采取感染预防措施，因此，为减少被样品感染的危险进行 灭菌处理是必需的。
[0016] 因此，需要建立能够在灭菌的样品中进行高灵敏性检测的测定，以"建立完全使用 电源和设施的允许高通量处理在局限区域采集的样品的高灵敏性和低成本的检测方法"和 "建立高灵敏性的、快速的、容易的和低成本的并且无需使用需要电源的设备进行的护理点 检测（P0CT)"。为了做到这些，靶抗原的选择是重要的。作为对结核杆菌特异性的抗原，报 道了蛋白抗原，如Ag85。然而，由于蛋白抗原在体内迅速降解并且被消化，使用其几乎不能 获得精细的灵敏性。
[0017] 抗酸杆菌中主要的抗原包括糖脂，其实细胞膜和细胞壁的主要组成成分。由于 其在体内是高度稳定的，因此，认为糖脂抗原时一种有希望的靶抗原类型。在这些之中， LAM占细菌细胞成分的15%，并且其为在其数量方面也引起注意的一种抗原。有多份关于 产生用于检测活样品中的抗酸杆菌的LAM的目的的PoAb和MoAb的报道（参见非专利文 献1-4 (NPL 1-4))。与这些报道相应地，使用ELISA来检测痰液或尿液脂阿拉伯甘露聚糖 (lipoarabinomannan，以下，还称为"LAM")。然而，抗酸杆菌中的LAMs的基本结构除了在甘 露糖封端观察到的微小的不同之外几乎是相同的。特别地，在鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium)(其为仅次于结核杆菌以第二最大频率引起抗酸杆菌感染的细节）中，甘露糖封端 结构与结核杆菌的甘露糖封端结构几乎是相同的（参见，非专利文献5(NPL 5))。因此，需 要能够特异性检测抗酸杆菌中的结核杆菌的LAM的单克隆抗体。
[0018] 引用列表 [0019] 非专利文献
[0020] NPL 1 ：Aharona Glatman-Freedman 等，"Monoclonal antibodies to surface antigens of Mycobacterium tuberculosis and their use in a modified Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay for detection of Mycobacteria (结核分枝杆菌表面 抗原的单克隆抗体及其在用于检测分枝杆菌的改良的酶联免疫吸附印记测定中的应 用），" Journal of Clinical Microbiology (临床微生物学杂志），1996 年 11 月， pp.2795-2802
[0021] NPL 2 :Lenka M. Pereira Arias-Bouda等，"Development of antigen detection assay for diagnosis of tuberculosis using sputum samples (开发使用痰液样品用于 结核病诊断的抗原检测测定），" Journal of Clinical Microbiology(临床微生物学杂 志），2000 年 6 月，ρρ· 2278-2283
[0022] NPL 3 :Beston Hamasur 等，"Rapid diagnosis of tuberculosis by detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan in urine(通过检测尿液中的抗酸杆菌脂阿 拉伯甘露聚糖快速诊断结核病），"J〇urnal of Microbiological Methods (微生物学方法 杂志），45, 2001，ρρ· 41-52
[0023] NPL 4 :C. Boehme 等，"Detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan with an antigen-capture ELISA in unprocessed urine of Tanzanian patients with suspected tuberculosis (使用抗原-捕获ELISA检测疑似结核病坦桑尼亚患者的未处 理的尿液中的抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖）/'Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 99, 2005, pp. 893-900
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[0027] 发明概述
[0028] 技术问题
[0029] 本发明的目的是提供特异性结合抗酸杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖（以下，有时称为 "LAM"）的单克隆抗体，特别是其单链抗体（scFv)和多价抗体。
[0030] 本发明的另一个目的是提供一种使用所述抗体来检测抗酸杆菌的方法，或结核病 诊断方法，和抗酸杆菌检测试剂（例如，结核病诊断试剂）和使用所述方法的抗酸杆菌检测 试剂盒（例如，结核病诊断试剂盒）。
[0031] 本发明的另一个目的是提供一种使用所述抗体确定抗结核病药物的结核病治疗 效果的方法，和用于确定抗结核病药物的治疗效果的试剂盒，所述试剂盒用于上述方法。 [0032] 问题的解决方案
[0033] 通过开发产生或选择适当的免疫动物、免疫原和MoAb的技术，本发明人成功地开 发了可以区分抗酸杆菌LAM与其他细菌的LAM或同其结构相似的膜抗原并且以与基因扩增 检测方法的灵敏性相当的高灵敏性特异性检测抗酸杆菌LAM的抗体和测定方法。此外，本 发明人成功地开发了可以区分结核杆菌LAM与非结核性抗酸杆菌的LAM并且特异性检测结 核杆菌LAM的抗体。
[0034] 因此，本发明包括下述实施方案：
[0035] (I)特异件结合抗酸杆菌的脂阿柃伯甘露聚糖（LAM)的单克降抗体（1-1)
[0036] (1-1)能够结合抗酸杆菌LAM的单克隆抗体，所述抗体如下述（A)-(C)所述：
[0037] (A)单克隆抗体，其包含通过接头连接的重链可变区和轻链可变区，所述重链可 变区包含下述（a)-(c)所示的重链CDR1-CDR3,并且所述轻链包含下述（d)-(f)所示的 CDR1-CDR3 ;
[0038] (a)由SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，
[0039] (b)由SEQ ID N0 :2所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0040] (c)由SEQ ID N0 :3所示的氨基酸序列组成的重链⑶R3，
[0041] (d)由SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
[0042] (e)由SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2,和
[0043] (f)由SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3 ;
[0044] (B)单克隆抗体，其包含通过接头连接的重链可变区和轻链可变区，所述重链可 变区包含下述（g)-(i)所示的重链CDR1-CDR3,并且所述轻链包含下述（j)-(l)所示的 CDR1-CDR3 ;
[0045] (g)由SEQ ID N0 :31所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，
[0046] (h)由SEQ ID N0 :32所示的氨基酸序列组成的重链⑶R2，
[0047] ⑴由SEQ ID N0 :33所示的氨基酸序列组成的重链⑶R3，
[0048] (j)由SEQ ID N0 :34所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
[0049] (k)由SEQ ID N0 :35所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R2,和
[0050] (1)由SEQ ID N0 :36所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3 ;和
[0051] (C)单克隆抗体，其包含通过接头连接的重链可变区和轻链可变区，所述重链可 变区包含下述（m)-(o)所示的重链CDR1-CDR3,并且所述轻链包含下述（p)-(r)所示的 CDR1-CDR3 ;
[0052] (m)由SEQ ID N0 :47所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，
[0053] (η)由SEQ ID N0 :48所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，
[0054] (〇)由SEQ ID N0 :49所示的氨基酸序列组成的重链CDR3，
[0055] (p)由SEQ ID N0 :50所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，
[0056] (q)由SEQ ID N0 :51所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2,和
[0057] (r)由SEQ ID N0 :52所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[0058] (1-2)根据（1-1)所述的单克隆抗体，其中（A)的单克隆抗体的重链可变区由SEQ ID N0 :7所示的氨基酸序列组成。
[0059] (1-3)根据（1-1)或（1-2)所述的单克隆抗体，其中（A)的单克隆抗体的轻链可变 区由SEQ ID N0 :8所示的氨基酸序列组成。
[0060] (1-4)根据（1-1)至（1-3)中任一项所述的单克隆抗体，其中（A)的单克隆抗体的 接头具有SEQ ID N0:11所示的氨基酸序列。
[0061] (1-5)根据（1-1)至（1-4)中任一项所述的单克隆抗体，其中（A)的单克隆抗体由 SEQ ID N0:12所示的氨基酸序列组成。
[0062] (1-6)根据（1-1)至（1-5)中任一项所述的单克隆抗体，其中⑷的单克隆抗体 能够特异性结合结核杆菌LAM，特别是人结核杆菌（结核分枝杆菌（M. tuberculosis))的 LAM。
[0063] (1-7)根据（1-1)所述的单克隆抗体，其中（B)的单克隆抗体的重链可变区由SEQ ID N0 :37所示的氨基酸序列组成。
[0064] (1-8)根据（1-1)或（1-7)所述的单克隆抗体，其中（B)的单克隆抗体的轻链可变 区由SEQ ID N0:38所示的氨基酸序列组成。
[0065] (1-9)根据（1-1)，（1-7)和（1-8)中任一项所述的单克隆抗体，其中（B)的单克 隆抗体的接头具有SEQ ID N0 :40所示的氨基酸序列。
[0066] (1-10)根据（1-1)和（1-7)至（1-9)中任一项所述的单克隆抗体，其中（B)的单 克隆抗体由SEQ ID NO :39所示的氨基酸序列组成。
[0067] (1-11)根据（1-1)所述的单克隆抗体，其中（C)的单克隆抗体的重链可变区由SEQ ID N0 :53所示的氨基酸序列组成。
[0068] (1-12)根据（1-1)或（1-11)所述的单克隆抗体，其中（C)的单克隆抗体的轻链可 变区由SEQ ID N0 :54所示的氨基酸序列组成。
[0069] (1-13)根据（1-1)，（1-11)和（1-12)任一项中所述的单克隆抗体，其中（C)的单 克隆抗体的接头具有SEQ ID N0 :11所不的氣基酸序列。
[0070] (1-14)根据（1-1)和（1-11)-(1-13)中任一项所述的单克隆抗体，其中（C)的单 克隆抗体由SEQ ID N0 :30所示的氨基酸序列组成。
[0071] (1-15)根据（1-1)和（1-7)-(1-14)所述的单克隆抗体，其中（B)或（C)的单克隆 抗体能够特异性结合非结核性抗酸杆菌。
[0072] (1-16)根据（1-1)-(1-15)中任一项所述的单克隆抗体，其中（A)-(C)中任一项的 单克隆抗体是单价或二价抗体。
[0073] (II)用于免疫非人动物产牛特异件结合抗酸杆菌脂阿柃伯甘露聚糖（LAM)的单 克降抗体的方法和用于产牛所沭单克降抗体的方法
[0074] (II-1)用于免疫非人动物产生特异性结合抗酸杆菌LAM的单克隆抗体的方法，所 述方法包括向所述非人动物施用作为免疫原的BCG来诱导针对BCG的体液免疫应答。
[0075] (II-2)根据（II-1)所述的方法，其中所述非人动物是兔或鸡。
[0076] (II-3)根据（II-1)或（II-2)所述的方法，其中所述抗酸杆菌是结核杆菌，优选人 结核杆菌（结核分枝杆菌）。
[0077] (11-4)用于产生特异性结合抗酸杆菌LAM的单克隆抗体的方法，所说方法包括下 述步骤：
[0078] 向所述非人动物施用作为免疫原的BCG来诱导针对BCG的体液免疫应答，并且产 生结合抗酸杆菌LAM的抗体；和
[0079] 从所述非人动物收集产生所述抗体的细胞。
[0080] (11-5)用于产生特异性结合抗酸杆菌LAM的单克隆抗体的方法，所述方法包括下 述步骤：
[0081] 向非人动物施用作为免疫原的BCG来诱导针对BCG的体液免疫应答；
[0082] 制备来自编码所述非人动物的结合抗酸杆菌LAM的抗体的mRNA ;
[0083] 使用所述mRNA作为模板制备cDNA ;并且
[0084] 使用所述cDNA通过噬菌体展示方法收集特异性结合抗酸杆菌LAM的单克隆抗体。
[0085] (II-6)根据（II-4)或（II-5)所述的方法，其中所述非人动物是兔或鸡。
[0086] (II-7)根据（11-4)-(11-6)中任一项所述的方法，其中所述抗酸杆菌是结核杆 菌，优选人结核杆菌（结核分枝杆菌）。
[0087] (II-8)根据（11-4)-(11-7)中任一项所述的方法，其中所述特异性结合抗酸杆菌 LAM的单克隆抗体是（1-1)-(1-12)中任一项所述的单克隆抗体。
[0088] (II-9)根据（11-4)-(11-8)中任一项所述的方法，其中特异性结合分枝杆菌LAM、 优选结合人结核杆菌（结核分枝杆菌）LAM的单克隆抗体是（1-1)-(1-6)中任一项所述的 (A)的单克隆抗体。
[0089] (II-10)用于产生特异性结合抗酸杆菌LAM的单克隆抗体的方法，所述方法包括 下述步骤：
[0090] 向非人动物施用LAM与（1-1)-(1-6)中任一项所述的（A)的单克隆抗体的复合物 作为免疫原，以诱导针对所述复合物的体液免疫应答，并且产生结合抗酸杆菌LAM的抗体； 和
[0091] 从所述非人动物收集产生所述抗体的细胞。
[0092] (Π -ll)用于产生特异性结合抗酸杆菌LAM的单克隆抗体的方法，所述方法包括 下述步骤：
[0093] 向非人动物施用LAM与（1-1)-(1-6)中任一项所述的（A)的单克隆抗体的复合物 作为免疫原，以诱导针对所述复合物的体液免疫应答；
[0094] 制备编码来自所述非人动物的结合抗酸杆菌LAM的抗体的mRNA ;
[0095] 使用所述mRNA作为模板制备cDNA ;并且
[0096] 使用所述cDNA通过噬菌体展示方法收集特异性结合抗酸杆菌LAM的单克隆抗体。
[0097] (11-12)根据（11-10)或（Π -ll)所述的方法，其中所述特异性结合抗酸杆菌LAM 的单克隆抗体是（1-1)和（1-7)-(1-12)中任一项所述的（B)的单克隆抗体。
[0098] (III)用于检测抗酸杆菌、优诜结核杆菌的方法
[0099] (III-1)用于检测抗酸杆菌、优选结核杆菌的方法，所述方法包括下述步骤：
[0100] (1)使（1-1)-(1-16)中任一项所述的单克隆抗体与受试者的生物样品接触；并且
[0101] (2)使用所述单克隆抗体与抗酸杆菌LAM、优选结核杆菌LAM的结合反应作为指标 测定在所述样品中存在的抗fe杆囷、优选结核杆囷。
[0102] (III-2)根据（III-1)所述的方法，其中用于检测结核杆菌的方法使用 (1-1)-(1-6)中任一项所述的（A)的单克隆抗体。
[0103] 在上述检测方法中，结核杆菌检测方法可以解释为用于诊断患者中的结核病的方 法（结核病诊断方法）。
[0104] (IV)结核病诊断试齐I丨矛口结核病诊断试齐I丨念
[0105] (IV-1)结核病诊断试剂，其包含（1-1)-(1-6)中任一项所述的㈧的单克隆抗体。
[0106] (IV-2)结核病诊断试剂盒，其包含含（1-1)-(1-6)中任一项所述的（A)的单克隆 抗体作为结核病检测试剂。
[0107] (V)用于测量抗酸杆菌脂阿柃伯甘露聚糖（LAM)的方法
[0108] (V-1)用于测量测试样品中的抗酸杆菌LAM的方法，所述方法包括下述步骤：
[0109] (1)使（1-1)-(1-16)中任一项所述的单克隆抗体与可能含有抗酸杆菌的测试样 品接触；并且
[0110] (2)利用所述单克隆抗体与抗酸杆菌LAM之间的结合反应作为指标测定测试样品 中的抗酸杆菌LAM。
[0111] (V-2)根据（V-1)所述的方法，其是包括检测抗酸杆菌LAM作为步骤（2)的抗酸杆 菌LAM定性方法，或者是包括定量抗酸杆菌LAM作为步骤（2)的抗酸杆菌LAM定量方法。
[0112] (V-3) (V-1)或（V-2)所述的方法，其中所述抗酸杆菌是结核杆菌，优选人结核杆 菌（结核分枝杆菌）。
[0113] (V-4)根据（V-3)所述的方法，其中所述单克隆抗体是（1-1)-(1-6)中任一项所述 的（A)的单克隆抗体。
[0114] (VI)抗酸杆菌脂阿柃伯甘露聚糖（LAM)检测试剂或检测试剂倉
[0115] (VI-1)抗酸杆菌LAM检测试剂，其包含（1-1)-(1-16)中任一项所述的单克隆抗 体。
[0116] (VI-2)抗酸杆菌LAM检测试剂，其包含（1-1)-(1-6)中任一项所述的（A)的单克 隆抗体。
[0117] (VI-3)根据（VI-2)所述的试剂，其中所述抗酸杆菌是结核杆菌，优选人结核杆菌 (结核分枝杆菌）。
[0118] (VI-4)抗酸杆菌LAM检测试剂盒，其包含（1-1)-(1-16)中任一项所述的单克隆抗 体的作为抗酸杆菌LAM检测试剂。
[0119] (VI-5)根据（VI-4)所述的抗酸杆菌LAM检测试剂盒，其中所述单克隆抗体是 (1-1)-(1-6)中任一项所述的（A)的单克隆抗体。
[0120] (VI-6)根据（VI-5)所述的抗酸杆菌LAM检测试剂盒，其中所述抗酸杆菌是结核杆 菌，优选人结核杆菌（结核分枝杆菌）。
[0121] (VII) #用灭菌样品的测定
[0122] (VII-1) -种用于确定测试样品中存在或不存在抗酸杆菌感染的方法，所述方法 包括下述步骤：
[0123] (1)通过煮沸、优选通过高压灭菌而将测试样品灭菌；
[0124] (2)使（1-1)-(1-16)任一项所述的单克隆抗体、优选（1-1)-(1-6)和 (1-7)-(1-10)中任一项的㈧或⑶的单克隆抗体与所述灭菌的样品接触；
[0125] (3)使用单克隆抗体与抗酸杆菌LAM之间的结合反应作为指标测定所述测试样品 中的抗酸杆菌LAM ;和
[0126] (4)当在所述测试样品中检测到抗酸杆菌LAM时，确定所述测试样品感染了抗酸 杆菌。
[0127] (VII-2)根据（VII-1)所述的方法，其中所述单克隆抗体是（1-1)-(1-6)和 (1-7)-(1-10)中任一项所述的（A)或（B)的单克隆抗体，并且所述抗酸杆菌是结核杆菌。
[0128] (VIII)用于确定抗结核病药物的结核病治疗效果的方法
[0129] (VIII-1)用于确定抗结核病药物的结核病治疗效果的方法，所述方法包括下述步 骤：
[0130] (1)使（1-1)-(1-6)中任一项所述的（A)的单克隆抗体与施用所述抗结核病药物 之前和之后的测试样品接触；
[0131] (2)使用所述单克隆抗体与结核杆菌LAM之间的结合反应作为指标测定在施用抗 结核病药物之前和之后的测试样品中的结核杆菌LAM ;和
[0132] (3)当在施用所述抗结核病药物之前的所述测试样品中检测到结核杆菌LAM，并 且在施用所述抗结核病药物之后的所述测试样品中没有检测到结核杆菌LAM时，确定所述 抗结核病药物具有结核病治疗效果。
[0133] (VIII-2)用于确定抗结核病药物的结核病治疗效果的方法，所述方法包括下述步 骤：
[0134] (1)使（1-1)-(1-6)中任一项所述的（A)的单克隆抗体与施用所述抗结核病药物 之前和之后的测试样品接触；
[0135] (2)使用所述单克隆抗体与结核杆菌LAM之间的结合反应作为指标定量在施用所 述抗结核病药物之前和之后的所述测试样品中的结核杆菌LAM ;和
[0136] (3)比较施用所述抗结核病药物之后的所述测试样品中的结核杆菌LAM的量（给 药后测量）与施用所述抗结核病药物之前所述测试样品中的结核杆菌LAM的量（给药前测 量）；并且当给药后测量低于给药前测量时，确定所述抗结核病药物具有结核病治疗效果， 并且当给药后测量不低于给药前测量时，确定所述抗结核病药物不具有结核病治疗效果。
[0137] (IX)用于确定抗结核病药物的结核病治疗效果的试剂倉
[0138] (IX)用于确定抗结核病药物的结核病治疗效果的试剂盒，所述试剂盒包含 (1-1)-(1-6)中任一项所述的（A)的单克隆抗体。
[0139] (X)抗酸杆菌（结核杆菌）检测工具
[0140] (X-1)抗酸杆菌、优选结核杆菌检测工具，其包含由能够通过毛细作用转移测试样 品的材料形成的溶液吸收片，所述溶液吸收片包含：
[0141] (1)样品收集部，其用于吸收和收集测试样品；
[0142] (2)标记的抗体部，其负载有与抗酸杆菌LAM特异性反应的标记的（1-1)-(1-16) 中任一项所述的单克隆抗体；
[0143] (3)确定部，其包括测试结果显示部（a)，在所述测试结果显示部（a)上固定有与 抗酸杆菌LAM特异性反应的未标记的（1-1)-(1-16)中任一项所述的单克隆抗体；和
[0144] (4)溶液吸收部，其用于吸收已经移动通过所述样品收集部、标记的抗体部和确定 部的所述测试样品的残余的溶液。
[0145] (X-2) (X-1)所述的抗酸杆菌、优选结核杆菌检测工具，其中所述确定部（3)还包 括对照显示部（b)，在所述对照显示部（b)上固定有与标记的（1-1)-(1-16)中任一项所 述的单克隆抗体反应的未标记的抗体，所述对照显示部与所述测试结果显示部（a)分开放 置。
[0146] (X-3)(X-1)或（X-2)所述的抗酸杆菌检测工具，其中所述单克隆抗体是 (1-1)-(1-6)中任一项所述的（A)的单克隆抗体，并且所述抗酸杆菌是结核杆菌，优选人结 核杆菌（结核分枝杆菌）。
[0147] 发明的有利效果
[0148] 按照本发明，能够将在受试者的生物样品（痰液、唾液、血液、肺洗出液、胃液、尿 液、粪便、皮肤或胰液）中存在的抗酸杆菌与其他细菌区分开来，并且能够对其进行特异性 检测。本发明所述的用于检测抗酸杆菌的方法具有与基因扩增检测方法的灵敏性和特异性 相当的灵敏性和特异性。由于本发明所述的用于检测抗酸杆菌的方法可以确定活体中抗酸 杆菌的量，因此，可以监测针对抗酸杆菌特别是结核病的治疗效果。此外，本发明所述的用 于检测抗酸杆菌的方法甚至能够可靠地且准确地检测来自灭菌后至少一周的灭菌的靶标 样品的抗酸杆菌。因此，即使在没有用于防止感染的专门的样品转运系统的地区，可以通过 通用的转运系统（诸如通过邮寄）转运灭菌的样品。
[0149] 按照本发明的优选的实施方案，在结核病患者生物样品中存在的结核杆菌能够与 非结核性抗酸杆菌区分开来，并且对其进行特异性检测。因此，本发明能够以高准确性诊断 结核杆菌感染。此外，能够以高准确性确定抗结核病药物在结核病患者中的治疗作用。
[0150] 附图简述
[0151] [图1]在图1中，㈧和⑶均为显示本发明的结核杆菌检测工具（结核杆菌LAM 检测工具）的模式的示意图（侧视图）。示意图（A)显示其中确定部（3)仅具有测试结果 显示部（a)的模式，示意图（B)显示其中确定部（3)具有测试结果显示部（a)和对照显示 部（b)二者的模式。该附图中的附图标记表示下述：10 :支持体，21 :片材形成的样品收集 部（1)，22:片材形成的标记的抗体部（2)，23:片材形成的确定部（3)，24:片材形成的溶液 吸收部（4)，（a):测试结果显示部，（b):对照显示部，（1):样品收集部，（2):标记的抗体部， (3):确定部，（4):溶液吸收部，P :箭头显示测试样品的流动方向。（同样适用于图2)。
[0152] [图2]显示本发明的结核杆菌检测工具（结核杆菌LAM检测工具）的一种模式 (透视图）。
[0153] [图3]显示使用其上固定有结核分枝杆菌的LAM(-__)和鸟分枝杆菌的 LAM(- ·-)的抗原平板通过ELISA法测量分别用BCG疫苗或杀死的H37Ra细菌细胞皮下免 疫的兔的血液中的抗体滴度的测量结果（参比实施例1(2))。（A)显示来自用BGC疫苗免 疫的兔的结果，（B)显示来自用杀死的H37Ra细菌细胞免疫的兔的结果。
[0154] [图4]显示具有LAM反应性的scFv的氨基酸序列。更具体地，产生在上下 行之间的比较，上一行显示由用杀死的HR37Ra细菌细胞免疫的兔的脾细胞的产生的 scFV(Myc〇-scFv)的氨基酸序列（SEQ ID N0:30)，下一行显示由用BCG疫苗免疫的兔的脾 细胞产生的scFv(TB-scFv)的氨基酸序列（SEQ ID N0:12)，以及重链可变区中CDR1-CDR3 区域、接头和轻链可变区中CDR1-CDR3区域的相应的位置之间的比较。应该注意到，关于具 有结合在其N端的四个丝氨酸残基的接头序列，N端一侧的氨基酸区域表示VH区，并且C端 一侧的区域表示VL区。
[0155] [图5]显示TB-scFv LAM反应性评估的结果。使用其上固定有结核分枝杆菌的 LAM和鸟分枝杆菌的LAM的平板，使用ELISA评估由用BCG疫苗免疫的兔产生的TB-scFv的 LAM反应性。在图5中，"· "表示针对结核分枝杆菌的LAM的反应性，" ?"表示针对鸟分 枝杆菌的反应性。
[0156] [图6]显示抗酸杆菌LAM检测ELISA和结核杆菌LAM检测ELISA的评估结果。使 用纯化的结核分枝杆菌LAM和鸟分枝杆菌LAM在抗酸杆菌LAM检测ELISA和结核杆菌LAM 检测ELISA中评估针对LAM的反应性。在图6中，"?"表示在抗酸杆菌LAM检测ELISA中 针对结核分枝杆菌的LAM的反应性，""表示在抗酸杆菌LAM检测ELISA中针对鸟分枝杆 菌的LAM的反应性，"〇"表示在结核杆菌LAM检测ELISA中针对结核分枝杆菌的LAM的反 应性，并且"□"表示在结核杆菌LAM检测ELISA中针对鸟分枝杆菌的LAM的反应性。
[0157] [图7]显示抗体组合的评估结果。抗体组合的评估使用抗酸杆菌临床分离株通过 抗酸杆菌LAM检测ELISA和结核杆菌LAM检测ELISA进行。针对每种菌株的反应性用色彩 密度表示。在图7中，myco表示抗酸杆菌LAM检测ELISA的结果，TB表示结核杆菌LAM检 测ELISA的结果。
[0158] [图8]显示抗酸杆菌LAM检测免疫层析测试和结核杆菌LAM检测免疫层析测试 的评估结果。使用纯化的结核分枝杆LAM(A和B)和鸟分枝杆菌的LAM(C和D)在抗酸杆菌 LAM检测免疫层析和结核杆菌LAM检测免疫层析中评估针对LAM的反应性。在每幅图中， "myco"表示抗酸杆菌LAM检测免疫层析测试的结果，"TB"表示结核杆菌LAM检测免疫层析 测试的结果。
[0159] [图9]显示鸡抗血清针对LAM的抗体滴度（实施例5)。在图9种，表示 针对纯化的结核杆菌（结核分枝杆菌）的青山B菌株（Aoyama B strain)的LAM的反应性， 表示针对纯化的鸟分枝杆菌的LAM的反应性。
[0160] [图10]显示由鸡scFv文库分离的单链抗体G3-SCFV的氨基酸序列，以及重链可 变区中⑶R1、⑶R2和⑶R3区、GS接头区和轻链可变区中⑶R1、⑶R2和⑶R3区的位置。
[0161] [图11]显示使用二价抗体的LAM检测ELISA的反应性（实施例7)。在图11中， 表示在结核杆菌LAM检测ELISA中针对BCG的反应性，表示在抗酸杆菌 LAM检测ELISA中针对BCG的反应性。
[0162] [图12]显示使用二价抗体的抗酸杆菌LAM检测ELISA的检测灵敏性（实施例8)。 在该图中，表格是核酸扩增检测（NAAT)与抗酸杆菌LAM检测ELISA之间的检测灵敏性的比 较。
[0163] [图13]显示抗酸杆菌LAM检测ELISA关于口腔细菌的交叉反应性检测的结果（实 施例9)。在该图中，"Na"意指星形诺卡菌（N. asteroids)的细菌细胞，"Nf"意指皮疽诺卡 菌（N.faroinica)的细菌细胞，"Sg"意指链霉菌属（Streptomyces)的细菌细胞，"Ca"意指 白色念珠菌（C. albicans)的细菌细胞，"Ai"意指放线菌属（Actinomycete)的细菌细胞， "Tp"意指少变家村菌（T. paurometabolum)的细菌细胞。此处显示的是使用由每种这些培 养的细菌细胞和培养的BCG细菌细胞提取的LAM进行的抗酸杆菌LAM检测ELISA的结果。
[0164] [图14]显示在使用二价抗体的LAM检测ELISA中针对抗酸杆菌临床分离株的反 应性（实施例10)。在该图中，"A"表示38个结核杆菌临床分离株的测定结果，"B"表示29 个非结核性抗酸杆菌菌株（23个鸟分枝杆菌菌株、6个胞内分枝杆菌（M. intracellulare)) 的测定结果。该图中的A和B中，黑色柱表示抗酸杆菌LAM检测ELISA的测定结果，白色 柱表示结核杆菌LAM检测ELISA的测定结果。在B中的29个非结核性抗酸杆菌菌株中， Nos. 1-23是23个鸟分枝杆菌菌株的结果，Nos. 24-29是6个胞内分枝杆菌菌株的结果。
[0165] [图15]显示抗酸杆菌LAM检测ELISA与结核杆菌LAM检测ELISA中的反应性的 比率（抗酸杆菌LAM检测ELISA的值/结核杆菌LAM检测ELISA的值）。
[0166] [图16]显示使用二价抗体在结核杆菌LAM检测ELISA (左图）和在抗酸杆菌LAM 检测ELISA(右图）中针对临床痰液样品的反应性（实施例11)。在该图中，"I"表示在涂 片检查（直接涂片检查）中为阴性的且在核酸扩增检测中为阴性的样品组的结果，"II"表 示在涂片检查中为"不足的（scanty) "且在核酸扩增检测中为阴性的样品的结果，"III"表 示在涂片检查中为阴性的且在核酸扩增检测中为阳性的样品组的结果，"IV"表示在涂片检 查中为"不足的"且在核酸扩增检测中为阳性的样品组的结果，"V"表示在涂片检查中评分 1+的样品组的结果，"VI"表示在涂片检查中评分2+的样品组的结果，"VII"表示在涂片检 查中评分3+的样品组的结果。应该注意，在涂片检查中评分等于或高于1+的样品在核酸 扩增检测中都是阳性的。此外，虚线表示暂定的截点值。
[0167] [图17]显示在LAM检测ELISA中检测的细菌细胞数与LAM浓度之间的相关性（实 施例11)。在该图中，"I"表示在涂片检查中为阴性的且在核酸扩增检测中为阴性的样品组 的结果，"II"表示在涂片检查中为阴性的且在核酸扩增检测中为阳性的样品的结果，"III" 表示在涂片检查中为"不足的"且在核酸扩增检测中为阳性的样品组的结果，"IV"表示在涂 片检查中评分1+的样品组的结果，"V"表示在涂片检查中评分2+的样品组的结果，"VI"表 示在涂片检查中评分3+的样品组的结果。应该注意，在涂片检查中评分等于或高于1+的 样品在核酸扩增检测中都是阳性的。此外，每个样品组中的线表示平均LAM浓度值。
[0168] [图18]显示抗酸杆菌LAM针对灭菌处理的稳定性。白色柱表示未灭菌的细菌细 胞的测定结果，黑色柱表示已经在100°c煮沸30分钟的细菌细胞的测定结果，灰色柱表示 已经在高压蒸汽中灭菌（在121 °C高压灭菌15分钟）的细菌细胞的测定结果（实施例12)。
[0169] [图19]显示高压蒸汽灭菌处理（高压灭菌）后LAM的储存稳定性。白色柱表示 紧接在高压蒸汽灭菌处理后的细菌细胞的测定结果，黑色柱表示在高压蒸汽灭菌处理后已 在25°C放置7天的细菌细胞的测定结果（实施例12)。
[0170] 实施方案描述
[0171] (I)特异件结合抗酸杆菌LAM的单克降抗体
[0172] 结核杆菌属于分枝杆菌科（Mycobacteriaceae)的分枝杆菌属（Mycobacterium), 并且是一种与其他属于分枝杆菌的细菌一起称作抗酸杆菌的细菌组类型。然而，结核杆菌 通过其能够在37°C生长而不能在28°C生长的事实和通过其具有耐热性过氧化氢酶的事实 而与其他抗酸杆菌（非结核性抗酸杆菌）区分开来。已知四种类型的结核杆菌，即，结核杆 菌（结核分枝杆菌，人结核杆菌），牛结核杆菌（牛分枝杆菌（M. bovis)，牛结核杆菌，牛杆 菌），非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum) (Mafricans)和田鼠结核杆菌（田鼠分枝 杆菌（M. microti))。在这些中，人结核杆菌（结核分枝杆菌）作为引起结核病的细菌对人 是致病性的，牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌（M.africans)极少感染人。田鼠分枝杆菌对人没 有致病性。此外，BCG通过经由连续长期的传代培养使牛分枝杆菌减毒而获得，并且用作用 于结核病预防的疫苗（减毒活细菌疫苗）。
[0173] 作为本发明的主题的单克隆抗体（以下，还称为"MoAb"）是这样的抗体，S卩，其区 分抗酸杆菌与体内存在的其他细菌并且特异性识别抗酸杆菌。更具体地，其是一种区分抗 酸杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM)与其他细菌的LAM-样抗原，并且特异性结合抗酸杆菌的 LAM。此处所述的LAM是一种形成包括结核杆菌的分枝杆菌属（抗酸杆菌）细菌的细胞膜 和细胞壁的主要脂聚糖。通常，LAM包括甘露糖基磷脂酰肌醇锚定（MPI)、包括D-甘露聚糖 核心和D-阿拉伯聚糖结构域的糖骨架和封端基序。然而，取决于细菌类型，在分子内包括 的多个糖残基（例如，甘露糖）的数量、糖链的分支结构、酰基基团的数目和形成酰基基团 的脂肪酸类型中存在差别。
[0174] 具体地，本发明的MoAb包括具有下述结构的抗体：其中包括下述（a)-(c)的重链 ⑶R1-⑶R3的重链可变区与包括下述（d)-(f)的轻链⑶R1-⑶R3的轻链可变区通过接头连 接在一起。为了便利，这种MoAb还称为"MoAb 1"。
[0175] (a)由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列组成的重链⑶R1。
[0176] (b)由SEQ ID N0 :2所示的氨基酸序列组成的重链CDR2。
[0177] (c)由SEQ ID N0 :3所示的氨基酸序列组成的重链⑶R3。
[0178] (d)由SEQ ID N0 :4所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R1。
[0179] (e)由SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2。
[0180] (f)由SEQ ID N0 :6所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[0181] 此外，具体地，本发明的MoAb包括具有下述结构的抗体：其中包括下述（g)-(i)的 重链⑶R1-⑶R3的重链可变区与包括下述（j)-(1)的轻链⑶R1-⑶R3的轻链可变区通过接 头连接在一起。为了便利，这种MoAb还称为"M〇Ab2"。
[0182] (g)由SEQ ID NO :31所示的氨基酸序列组成的重链CDR1。
[0183] (h)由SEQ ID N0 :32所示的氨基酸序列组成的重链⑶R2。
[0184] ⑴由SEQ ID N0 :33所示的氨基酸序列组成的重链CDR3。
[0185] (j)由SEQ ID N0 :34所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1。
[0186] (k)由SEQ ID N0 :35所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R2。
[0187] (1)由SEQ ID N0 :36所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R3。
[0188] 此外，具体地，本发明的MoAb包括具有下述结构的抗体：其中包括下述（m)-(o)的 重链⑶R1-⑶R3的重链可变区与包括下述（p)-(r)的轻链⑶R1-⑶R3的轻链可变区通过接 头连接在一起。为了便利，这种MoAb还称为"M 〇Ab3"。
[0189] (m)由SEQ ID NO :47所示的氨基酸序列组成的重链CDR1。
[0190] (η)由SEQ ID N0 :48所示的氨基酸序列组成的重链CDR2。
[0191] (〇)由SEQ ID N0 :49所示的氨基酸序列组成的重链CDR3。
[0192] (p)由SEQ ID N0 :50所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1。
[0193] (q)由SEQ ID N0 :51所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2。
[0194] (r)由SEQ ID N0 :52所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R3。
[0195] 此处，"CDR"是还称为互补性决定区的"Complementarity Determining Region(互补性决定区）"的缩写。CDRs是存在于免疫球蛋白可变区中的区域，并且是深入 参与抗体与抗原的特异性结合的区域。在这些中，"重链⑶R"是指存在于免疫球蛋白的重 链的可变区的CDR，"轻链CDR"是指存在于免疫球蛋白的轻链的可变区的CDR。
[0196] 重链可变区是包括重链⑶R1-⑶R3的区域，轻链可变区是包括轻链⑶R1-⑶R3的 区域。尽管对这些CDR1-CDR3的排列顺序（优选地，在重链可变区和轻链可变区二者中） 没有特别的限制，但是，⑶R1、⑶R2和⑶R3按照这一顺序在从N端一侧到C端一侧的方向 连续的或通过其他氨基酸序列排列。
[0197] 本发明的MoAb的重链可变区和/或轻链可变区，在上述⑶R1-⑶R3之外的上述可 变区中的区域中可以具有作为其他氨基酸序列的称为构架区（以下，简称为"FR"）的氨基 酸序列。FR的氨基酸序列可以是来源于免疫球蛋白的重链可变区或轻链可变区的构架区 (FR)的氨基酸序列、其变体或其通过在来源于FR的氨基酸序列的一部分中引入限制性酶 识别位点而获得的部分修饰。
[0198] 在免疫球蛋白的重链可变区中，例如，重链可变区的N端与上述⑶R1之间的区 域定义为"FR1"，⑶R1与⑶R2之间的区域定义为"FR2"，⑶R2与⑶R3之间的区域定义为 "FR3"，并且⑶R3与重链可变区的C端之间的区域定义为"FR4"。类似地，在免疫球蛋白的 轻链可变区中，例如，轻链可变区的N端与⑶R1之间的区域定义为"FR1"，⑶R1与⑶R2之 间的区域定义为"FR2"，⑶R2与⑶R3之间的区域定义为"FR3"，并且⑶R3与可变区的C端 之间的区域定义为"FR4"。
[0199] 这些FRs具有作为连接上述⑶R1XDR2和⑶R3 (作为抗原识别序列是重要的）中 的每一个的接头的功能，并且是有助于形成可变区的三维构象的区域。
[0200] 在本发明的MoAbl中，重链可变区优选地具有SEQ ID N0 :7所示的119个氨基酸 残基的氨基酸序列，轻链可变区优选地具有SEQ ID NO :8所示的112个氨基酸残基的氨基 酸序列。在显示重链可变区的氨基酸序列的SEQ ID NO :7中，从N端至第30个氨基酸的区 域对应于重链可变区的"FR1"，从第31个氨基酸至第35个氨基酸的氨基酸区域对应于重链 可变区的"⑶Rl"（SEQ ID NO :1)，从第36个氨基酸至第49个氨基酸的氨基酸区域对应于 "FR2"，从第50个氨基酸至第65个氨基酸的氨基酸区域对应于"CDR2"（SEQ ID NO :2)，从 第66个氨基酸至第96个氨基酸的氨基酸区域对应于"FR3"，从第97个氨基酸至第106个 氨基酸的氨基酸区域对应于"⑶R3"（SEQ ID NO :3)，并且从第107个氨基酸至第119个氨 基酸的氨基酸区域对应于"FR4"。
[0201] 此外，在显示本发明的MoAbl的轻链可变区的氨基酸序列的SEQ ID N0 :8中，从N 端至第23个氨基酸的区域对应于轻链可变区的"FR1"，东堤24个氨基酸至第36个氨基酸 的氨基酸区域对应于轻链可变区的"⑶Rl"（SEQ ID NO :4)，从第37个氨基酸至第51个氨 基酸的氨基酸区域对应于"FR2"，从第52个氨基酸至第58个氨基酸的氨基酸区域对应于 "CDR2"（SEQ ID NO :5)，从第59个氨基酸至第89个氨基酸的氨基酸区域对应于"FR3"，从 第90个氨基酸至第102个氨基酸的氨基酸区域对应于"⑶R3"(SEQ ID NO :6)，从第103个 氨基酸至第112个氨基酸的氨基酸区域对应于"FR4"。
[0202] 在本发明的MoAb2中，重链可变区优选地具有SEQ ID N0 :37所示的130个氨基酸 残基的氨基酸序列，轻链可变区优选地具有SEQ ID N0 :38所示的116个氨基酸残基的氨基 酸序列。在显示重链可变区的氨基酸序列的SEQ ID N0 :37中，从N端至第35个氨基酸的 区域对应于重链可变区的"FR1"，从第36个氨基酸至第40个氨基酸的氨基酸区域对应于 重链可变区的"⑶R1"(SEQ ID N0 :31)，从第41个氨基酸至第54个氨基酸的氨基酸区域对 应于"FR2"，从第55个氨基酸至第74个氨基酸的氨基酸区域对应于"CDR2"（SEQ ID N0 : 32)，从第75个氨基酸至第106个氨基酸的氨基酸区域对应于"FR3"，从第107个氨基酸至 第119个氨基酸的氨基酸区域对应于"⑶R3"(SEQ ID NO :33)，以及从第120个氨基酸至第 130个氨基酸的氨基酸区域对应于"FR4"。
[0203] 此外，在显示本发明的MoAb2的轻链可变区的氨基酸序列的SEQ ID N0 :38中，从 N端至第20个氨基酸的区域对应于轻链可变区的"FR1"，从第21个氨基酸至第28个氨基 酸的氨基酸区域对应于轻链可变区的"⑶R1"(SEQ ID N0 :34)，从第29个氨基酸至第44个 氨基酸的氨基酸区域对应于"FR2"，从第45个氨基酸至第51个氨基酸的氨基酸区域对应于 "⑶R2"(SEQ ID NO :35)，从第52个氨基酸至第83个氨基酸的氨基酸区域对应于"FR3"，从 第84个氨基酸至第95个氨基酸的氨基酸区域对应于"⑶R3"(SEQ ID NO :36)，以及从第96 个氨基酸至第116个氨基酸的氨基酸区域对应于"FR4"。
[0204] 在本发明的MoAb3中，重链可变区优选地具有SEQ ID N0 :53所示的121个氨基酸 残基的氨基酸序列，轻链可变区优选地具有SEQ ID N0 :54所示的110个氨基酸残基的氨基 酸序列。在显示重链可变区的氨基酸序列的SEQ ID N0 :53中，从N端至第30个氨基酸的 区域对应于重链可变区的"FR1"，从第31个氨基酸至第35个氨基酸的氨基酸区域对应于重 链可变区的"⑶R1"(SEQ ID NO :47)，从第36个氨基酸至第49个氨基酸的氨基酸区域对应 于"FR2"，从第50个氨基酸至第65个氨基酸的氨基酸区域对应于"CDR2"(SEQ ID NO :48)， 从第66个氨基酸至第96个氨基酸的氨基酸区域对应于"FR3"，从第97个氨基酸至第108 个氨基酸的氨基酸区域对应于"⑶R3"(SEQ ID NO :49)，以及从第109个氨基酸至第121个 氨基酸的氨基酸区域对应于"FR4"。
[0205] 此外，在显示本发明的MoAb3的轻链可变区的氨基酸序列的SEQ ID N0 :54中，从 N端至第23个氨基酸的区域对应于轻链可变区的"FR1"，从第24个氨基酸至第34个氨基 酸的氨基酸区域对应于轻链可变区的"⑶R1"(SEQ ID N0 :50)，从第35个氨基酸至第49个 氨基酸的氨基酸区域对应于"FR2"，从第50个氨基酸至第56个氨基酸的氨基酸区域对应于 "⑶R2"(SEQ ID NO :51)，从第57个氨基酸至第87个氨基酸的氨基酸区域对应于"FR3"，从 第88个氨基酸至第100个氨基酸的氨基酸区域对应于"⑶R3"（SEQ ID NO :52)，以及从第 101个氨基酸至第110个氨基酸的氨基酸区域对应于"FR4"。
[0206] 只要不损害本发明的MoAbl和MoAb2的有利作用，可以在对应于SEQ ID N0S :7， 37和53所示的重链可变区的FR1-FR4的氨基酸序列和对应于SEQ ID N0S :8, 38和54所示 的轻链可变区的FR1-FR4的氨基酸序列的任一种中引入突变。此处，除非特别另外指明，否 则，"本发明的MoAbl、M 〇Ab2和M〇Ab3的有利作用"意指与抗酸杆菌LAM的结合，优选地意 指与抗酸杆菌LAM的特异性结合。具体地，"本发明的MoAbl的有利作用"意指与结核杆菌 LAM的结合，优选地意指与结核杆菌LAM的特异性结合。尽管对可以引入的突变的数目也没 有特别的限制，但是，可以设定引入的突变的数目，以使与突变前的氨基酸序列的氨基酸序 列同一性为85%以上，优选90%以上，更优选95%以上，并且特别优选地98%以上。应该 注意，此处所述的引入突变可以包括氨基酸置换、缺失和插入。此外，可以向重链可变区的 FR1和/或轻链/重链可变区的FR4中引入限制性酶识别位点。
[0207] 此外，在MoAbl和MoAb3中所示的重链可变区的FR1-FR4与轻链可变区的FR1-FR4 均为来源于兔的氨基酸序列，而MoAb2中所示的重链可变区的FR1-FR4与轻链可变区的 FR1-FR4均为来源于鸡的氨基酸序列。然而，只要不损害本发明的MoAb的有利效果，可以 使用来源于任何动物物种的构架区。所述动物物种的实例可以包括，但不特别限于，人，兔， 鸡，马，牛，山羊，绵羊，狗，小鼠，仓鼠和大鼠。氨基酸序列优选地来源于兔、鸡或人，并且更 优选地来源于人。应该注意，人源的FR1-FR4的氨基酸序列在本领域中是已知的（Kabat， 等，US Department of Health AND human Services (美国卫生与人类服务部），NIH(1991)， USA)，并且，例如，记述在NCBI的网站上。
[0208] 本发明的MoAb具有下述结构：其中具有上述构型的重链可变区和轻链可变区 通过接头连接在一起。关于此处的"接头"，没有特别的限制，只要本发明的MoAb的有利 效果不被损害，并且其实例可以包括具有由通常为约8-30个、优选约8-20个、更优选约 8-15个氨基酸残基数目的氨基酸序列形成的接头序列的肽。优选的接头序列的实例包 括，但不限于，GS 接头序列[(Gly-Gly-Gly-Ser:SEQ ID N0:9)n，（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser: SEQ ID NO :10)n;n为重复的数目]等。优选地，具有1-3个（n为1-3的整数）所述 GS接头序列的重复的序列的肽用作接头。在下文所述的实施例中，具有三个GS接头序 列重复的序列（GGGGSGGGGSGGGGS:SEQ ID N0:11)的肽（实施例1)和具有另一种序列 (GGGGSGGDGSGGGGS :SEQ ID NO :40)的肽（实施例 6)用作接头。
[0209] 本发明的MoAbl的优选的模式可以是由SEQ ID N0 :12所示的氨基酸序列组成的 单链抗体。此外，MoAb2的优选的模式可以是由SEQ ID N0 :39所示的氨基酸序列组成的单 链抗体。此外，MoAb3的优选的模式可以是由SEQ ID N0 :30所示的氨基酸序列组成的单链 抗体。
[0210] 本发明所述的单克隆抗体包括从非结核性抗酸杆菌区分并特异性识别结核杆菌 的抗体。更具体地，其包括区分结核杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM)与非结核性抗酸杆 菌的LAMs并且特应性结合结核杆菌LAM的抗体。单克隆抗体的实例可以包括上文所述的 MoAbl。与非结核杆菌抗酸杆菌区分并且由本发明的MoAb特异性识别的结核杆菌优选是人 结核杆菌（结核分枝杆菌）和牛结核杆菌（牛分枝杆菌），更优选是人结核杆菌（结核分枝 杆菌）.
[0211] 当通过竞争方法比较针对结核杆菌LAM的反应时，当非结核性抗酸杆菌LAM需要 的量是结核杆菌LAM的量的10倍以上时，可以认为是关于结核杆菌LAM的特异性结合。 此外，当通过使用固定的抗体和检测抗体的夹心法检测到LAM时，如果针对非结核性抗酸 杆菌LAM的反应性已经减小为针对结核杆菌LAM的反应性的1/100,则可以确定本发明的 MoAb具有更优先的针对结核杆菌LAM的结合特异性。
[0212] 抗体的亲和力可以容易地使用目前已知的技术来测量，例如，测量1251标记的IgG 或其片段的饱和结合等温线的技术，或通过Motilsky在Analyzing Data with GraphPad Prizm(1999)，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA 中所述的使用未标记的 IgG 同源置 换125IgG的非线性回归分析来测量。本领域已知的其他方法可以用于所述测量，并且，所述 方法可以是，例如，Scatchard等，Ann. NYAcd. Sci.，51，660 (1949)中所述的方法。
[0213] 本发明的MoAb可以按照但不限于噬菌体展不法（G Smith，Science (科学），228， 1315 (1985))使用结核杆菌作为抗原来产生。此处，结核杆菌的实例可以包括上述结核杆菌 (结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis),人结核杆菌），牛结核杆菌（牛分枝杆菌， 牛结核杆菌，牛杆菌），非洲分枝杆菌，和田鼠结核杆菌。优选结核杆菌（结核分枝杆菌，人 结核杆菌），牛结核杆菌（牛分枝杆菌，牛结核杆菌，牛杆菌）和非洲分枝杆菌，并且更优选 牛结核杆菌。如上文所述，通过连续长期传代培养使牛结核杆菌（牛分枝杆菌）减毒获得 BCG。
[0214] 使用BCG作为抗原利用噬菌体展示产生本发明的MoAb的方法记述在实施例中。如 上文所述，本发明的MoAb的特征是区分抗酸杆菌与其他细菌诸如口腔细菌并且特异性识 别抗酸杆菌，更具体地，区分抗酸杆菌LAM与其他细菌的LAM-样抗原，并且特异性结合抗酸 杆菌LAM。所述特征是优选区分结核杆菌与非结核性抗酸杆菌并且特异性识别结核杆菌， 并且更具体地，区分结核杆菌LAM与非结核性抗酸杆菌LAM并且特异性结合结核杆菌LAM。 可以使用BCG作为免疫原产生所述MoAb。
[0215] 应该注意，如上文所述，BCG是由牛结核杆菌（牛分枝杆菌）产生的减毒菌株，并 且是指具有抗原性但是没有或减少的对人的毒性的细菌。然而，在本发明中，不仅此，而且 使用该细菌产生的BCG疫苗也称为"BCG"。
[0216] 此外，本发明的单克隆抗体包括是上文所述的单链抗体的多价抗体。尽管多 价抗体包括二价抗体、三价抗体和四价抗体，但是优选二价抗体。这些多价抗体可以 按照目前已知的方法产生（非专利文献7 :K. Zuberbuhler，Protein Engineering, Design&Selection(蛋白质工程、设计和选择），22,169(2009))。具体地，多价抗体可以这 样产生，例如，在使用二价抗体的情形中，使用恒定区的基因连接单链抗体的重链和轻链的 基因，将所连接的基因克隆到能够在哺乳动物细胞中表达的载体中，用包含所述基因的载 体转化哺乳动物细胞，并且培养所述细胞。
[0217] (II)用于免疫非人动物以产牛特异件结合抗酸杆菌LAM、优诜结核杆菌LAM的单 克降抗体的方法和用于产牛所沭单克降抗体的方法
[0218] 本发明还涉及用于免疫非人动物以产生特异性结合抗酸杆菌LAM的MoAb的方法， 和使用该免疫方法产生MoAb的方法。更具体地，本发明涉及用于免疫非人动物以产生特异 性结合结核杆菌LAM的方法，和使用该免疫方法产生MoAb的方法。
[0219] (II-1)免疫方法
[0220] 除了在甘露糖封端结构中观察到的微小的差别之外，抗酸杆菌LAMs的基础结构 几乎是相同的。当产生针对所述抗酸杆菌LAM的抗体时，通常使用人结核杆菌的标准菌株 如H37Rv作为免疫原免疫非人动物。通过这样做，可以产生广泛与抗酸杆菌LAM反应的抗 体。
[0221] 另一方面，当使用BCG(即，由牛结核杆菌（牛分枝杆菌）产生的减毒菌株）或由 其产生的疫苗作为免疫原免疫非人动物时，可以获得高特异性抗体，所述高特异性抗体通 过区分结核杆菌LAM与非结核性抗酸杆菌的LAMs而特异性结合结核杆菌LAM，优选人结核 杆菌的LAM。作为优选的模式，本发明提供使用BCG作为免疫原（免疫用抗原）免疫非人动 物的方法，作为产生特异性结合人结核杆菌的LAM的MoAb的免疫方法。
[0222] 此处，非人动物可以是除人之外的动物，其实例包括哺乳动物，如小鼠、大鼠、仓 鼠、豚鼠、兔、猴子、狗、山羊、绵羊、猪、马和牛，以及鸟类，如鸡、鸭、火鸡和鹌_。优选哺乳动 物（小动物），诸如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和兔，并且更优选兔。
[0223] 本发明产生特异性结合结核杆菌LAM的MoAb的免疫方法特征在于，使用BCG作为 免疫原（免疫用抗原）免疫非人动物；并且用于免疫的技术没有特别的限制，并且可以适当 地选择使用本领域已知的方法。
[0224] 其实例包括通过皮下、静脉内或腹内注射BCG以及必要时连同佐剂一起的施用方 法。优选皮下施用。所述佐剂的实例可以包括，但不限于，完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐 齐U。应该注意，施用BCG优选在第一次施用（第一次免疫）后以约2周的时间间隔进行约 2-5 次。
[0225] 以所述方式免疫的非人动物的脾细胞可用作用于产生对结核杆菌LAM、优选人结 核杆菌的LAM高度特异性的抗体的细胞。在第一次Beg免疫后十个单数日至数周从免疫的 非人动物取出脾，并且用来产生和获得对结核杆菌LAM、优选人结核杆菌的LAM高度特异性 的抗体。
[0226] 具体地，例如，由从免疫的非人动物取出的脾制备的细胞（抗体产生细胞）与骨髓 瘤细胞按照目前已知的方法使用聚乙二醇法或电刺激融合，并且在HAT选择培养基中培养 所述细胞，从而获得杂交瘤。然后，通过从所述杂交瘤筛选，可以获得产生结合结核杆菌LAM 的抗体（使用目前已知的方法，诸如限制性稀释分析）的杂交瘤，对结核杆菌LAM高特异性 的MoAb的杂交瘤。通过使用目前已知的方法的培养，杂交瘤以这样的方式克隆，可能制备 并获得对需要的结核杆菌的LAM、优选人结核杆菌的LAM高特异性的MoAb。
[0227] 不管是结核杆菌还是非结核性抗酸杆菌，用于制备并获得与宽范围的抗酸杆菌的 LAMs选择性结合的MoAb的方法的实例可以包括使用LAM与上述获得的对结核杆菌LAM、优 选人结核杆菌的LAM高度特异性的抗体的复合物选择抗体的方法。在这一情形中，用于免 疫的技术没有特别限制，并且可以适当地选择使用本领域已知的方法。应该注意，本文所述 的"复合物"是指形成LAM与对结核杆菌LAM高特异性的抗体的抗原-抗体复合物，并且所 述复合物的产生可以通过使用ELISA进行分析来确定。
[0228] (II-2)用于产牛特异件结合抗酸杆菌LAM、优诜结核杆菌LAM的MoAb的方法
[0229] 特异性结合抗酸杆菌、优选结核杆菌的LAM的MoAb可以使用已经用上述免疫方法 免疫的非人动物（免疫的非人动物）来产生。
[0230] 所述方法的实例包括从上述免疫的非人动物中取出脾，由取出的脾制备细胞（抗 体生成细胞），按照目前已知的方法使用聚乙二醇或电刺激将所述细胞与骨髓瘤细胞融合 以获得杂交瘤，从所获得的杂交瘤中选择产生特异性结合抗酸杆菌、优选结核杆菌的LAM 的MoAb，并且培养所述杂交瘤。以这种方式，可以制备并获得对抗酸杆菌、优选结核杆菌的 LAM、更优选人结核杆菌的LAM高度特异性的MoAb。此处，培养杂交瘤可以在非人动物（如 小鼠或兔）的腹内进行，或者可以使用培养皿等在体外进行。在前一种方法中，即，在非人 动物的腹内培养杂交瘤，在培养后收集非人动物的腹水，并且从所述腹水分离并纯化需要 的MoAb。在后一种方法中，即，在体外培养杂交瘤，从在培养后获得的培养物液体培养基中 分离并纯化需要的MoAb。抗所述抗体的亚类为IgG时，用于纯化单克隆抗体的方法的实例 可以包括使用蛋白质A的亲和层析法。
[0231] 此外，特异性结合抗酸杆菌、优选结核杆菌的LAM的MoAb也可以使用近年来开发 的噬菌体展示法产生（非专利文献6 :Winter等，Annu. Rev. Immunol.(免疫学年度综述）， 12 :433,1994)。具体地，从通过上述方法免疫的免疫的非人动物取出脾，由该取出的脾制备 总RNA或mRNA，使用所述RNA作为模板制备cDNA，并且制备编码抗体的可变区的单链抗体 (scFv :可变区的单链片段）的基因。此处，关于抗体的可变区，只要它们中的每一个包括两 个区，即，重链可变区（VH区）和轻链可变区（LH区），在所述VH区与LH区之前可以包括任 何肽接头。例如，如（I)所述，肽接头可以是具有由约8-30个氨基酸残基的氨基酸序列形 成的接头序列的肽，并且所述接头序列的实例包括GS接头序列。
[0232] 将所述基因克隆到噬菌粒载体中，并且引入到大肠杆菌（Escherichia coli)中， 然后将其转染噬菌体以允许scFv抗体在噬菌体荚膜上的表达（制备scFv展示噬菌体文 库）。
[0233] 当使用BCG作为非人动物的免疫法中的免疫原（免疫用抗原）时，可以获得并产 生特异性结合结核杆菌LAM、优选人结核杆菌的LAM的单克隆抗体（scFv抗体），这通过下 述进行：使用已经用作免疫用抗原的BCG，用表达scFv抗体的scFv展示噬菌体文库进行生 物淘选（bio-panning)，并且随后使用具有固相的结核杆菌LAM、优选人结核杆菌的LAM的 抗原平板进行生物淘选。
[0234] 此外，作为选择对分枝杆菌的LAM高度特异性的MoAb (单链抗体）的方法，可以获 得并产生选择性结合宽泛范围的抗酸杆菌的LAMs的单链抗体（scFv抗体），而不管其是结 核杆菌还是非结核性抗酸杆菌，这通过下述进行：使用其中LAM被具有抗-LAM抗体的载体 作为固相捕获的抗体-抗原复合物，用表达scFv抗体的scFv展示噬菌体文库进行生物淘 选。
[0235] 应该注意，关于总RNA或mRNA的制备，cDNA的制备，亚克隆到噬菌粒中，引入到 大肠杆菌中，用噬菌体感染，和筛选（生物淘选）特异性结合抗酸杆菌LAM、优选结核杆菌 LAM、更优选人结核杆菌的LAM的单克隆抗体（scFv抗体）的方法；可以使用本领域已知的 方法，并且更具体地，上述步骤可以使用下述实施例作为参比进行。
[0236] (III)用于检测抗酸杆菌、特别是结核杆菌的方法以及其中#用的抗酸杆菌（特 别是结核杆菌）检测工具
[0237] 上文所述的本发明的MoAb可以用于检测抗酸杆菌，优选结核杆菌。换言之，使用 本发明的MoAb，可以确定受试者是否携带抗酸杆菌，特别是结核杆菌。也就是说，可以诊断 /检测受试者是否感染抗酸杆菌，特别是结核杆菌。
[0238] 本发明的抗酸杆菌、特别是结核杆菌的检测（诊断/测试）可以通过下述（1)和 (2)的步骤进行：
[0239] (1)使本发明的MoAb与受试者的生物样品（测试样品）接触的步骤，并且
[0240] (2)使用本发明的MoAb与抗酸杆菌LAM、特别是结核杆菌LAM之间的结合反应作 为指标测定所述测试样品中存在的结核杆菌的步骤。
[0241] 在步骤（1)中与本发明的MoAb接触的受试者的生物样品（测试样品）可以是其 中存在抗酸杆菌、特别是结核杆菌的生物样品，并且所述生物样品的实例可以包括痰液、唾 液、血液（血清、血浆）、肺洗出液、胃液、尿液、粪便、皮肤和胰液等。所述生物样品优选是痰 液、唾液或血液，并且更优选是痰液或唾液。
[0242] 此处，进行测定的受试者优选是人，然而，除人之外的动物，诸如马、牛、山羊、绵 羊、狗、鸡、小鼠、仓鼠和大鼠也可以用作受试者。
[0243] 本发明的MoAb与所述生物样品彼此接触的条件没有特别限制，只要是不损害本 发明的MoAb与抗酸杆菌LAM、优选结核杆菌LAM之间的结合反应的条件即可，并且使用免疫 反应的一般条件。其方法的实例可以包括使得本发明的MoAb与含有抗酸杆菌、优选结核杆 菌的生物样品在通常45°C以下、优选约4-40°C、更优选约25-40°C的温度条件下共存；并且 放置或温育该混合物约0. 5-40小时，并且优选约1-20小时。此外，对于结合反应中所用的 溶剂及其pH没有特别的限制，只要对该反应没有不利作用即可；并且，按照或遵照目前已 知的方法，可以使用缓冲液（例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、乙酸盐缓 冲液等），以使pH为约5-9。
[0244] 步骤（1)可以在本发明的MoAb被固定（固相的）状态下（其中MoAb结合在固体 载体上的状态）进行。所述固定包括两种情形：本发明的MoAb以可解离的方式和以不可解 离的方式结合在固体载体上。
[0245] 作为用于固定MoAb的固体载体，可以使用本领域常用的多种载体，并且其实例可 以包括宽泛范围的制品，诸如由各种材料形成的棒（sticks)、珠子、平板（包括微量平板）、 试管等，所述各种材料如玻璃、纤维素粉、Sephadex、琼脂糖、聚苯乙烯、滤纸、羧甲基纤维 素、硝基纤维素、离子交换树脂、葡聚糖、塑料膜、塑料管、尼龙、玻璃珠、丝织品、聚胺-甲基 乙烯醚-马来酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物等。
[0246] 对固定方法没有特别的限制，并且取决于不同的固体载体，可以使用物理粘结和 化学键合。其实例可以包括：化学反应，如作为共价结合法的重氮基法，肽法（酸-酰胺衍 生物法、羧基氯化物树脂法、碳二亚胺树脂法、马来酸酐衍生物法、异氰酸酯衍生物法、溴化 氰活化的多糖法、碳酸纤维素酯衍生物法和使用缩聚试剂的方法），烷基化法，使用交联剂 的载体结合法（例如，使用戊二醒、六亚甲基异氰酸酯（hexamethylene isocyanate)等作 为交联剂），和使用Ugi反应的载体结合法；使用诸如离子交换树脂的载体的离子键法；以 及使用多孔玻璃如玻璃珠作为载体的物理吸附法。
[0247] 在步骤（2)中，本发明的MoAb可以以使用任何标记物质的标记状态使用。此处， 标记物质的实例可以包括：酶，诸如辣根过氧化物酶（HRP)和碱性磷酸酶；荧光物质，如荧 光异氰酸酯和罗丹明；放射性物质，如 32P和1251 ;着色物质（染色物质），如用胶体金属（如 胶体金）和白色胶体或红、蓝等色素染色的胶乳，包括天然胶乳和合成胶乳，诸如聚苯乙烯 胶乳；以及化学发光物质。取决于不同的标记物质，用这些标记物质标记MoAb可以按照目 前已知的方法进行。
[0248] 步骤（2)是通过本发明的MoAb与抗酸杆菌、优选结核杆菌的LAM之间的结合反 应检测/测定所获得的免疫复合物（抗原-抗体结合的物质）的步骤。此处，检测/测 定免疫复合物（抗原-抗体结合的物质）和用于其的条件没有特别限制，并且可以使用 与常规免疫测定法相同或相符的方法和条件。具体地，取决于用于标记MoAb的标记物质 的类型，可以使用通常用于免疫化学测定的多种方法，诸如例如，放射性同位素免疫测定 (RIA法），ELISA法，荧光抗体法，斑块法，印迹法，凝集法，Ouchterlony法等（例如，参 见R&D planning Κ·Κ·于 1982 年3 月 5 日出版的 "Hybridoma method and monoclonal antibody (杂交瘤法和单克隆抗体）"的第30-53页）。从灵敏性和简单性观点来看，步骤 (2)优选按照ELISA法进行，更优选按照夹心法进行。
[0249] 例如，当使用固相夹心法时，例如，可以以下述方式测定测试样品中作为抗酸杆 菌、优选结核杆菌的测定靶标。
[0250] 首先，将生物样品（例如，痰液、唾液或血液等），作为包含是抗酸杆菌、优选结核 杆菌的测定靶标的测试样品，添加到通过固定（通过可解离的固定）引起与测定靶标抗酸 杆菌、优选结核杆菌的LAM的特异性抗原-抗体反应的抗体而获得的固相抗体中，以允许抗 原-抗体反应发生。接着，例如，通过洗涤去除未结合的物质；添加引起与测定靶标抗酸杆 菌、优选结核杆菌的特异性抗原-抗体反应的抗体，以允许与上述产生的抗原-抗体结合物 质中的测定靶标细菌反应；检测（定性测量）在所述反应中产生的抗原-抗体结合的物质 ("抗体-抗酸杆菌-抗体"复合物，并且优选的是"抗体-结核杆菌-抗体"复合物）或者 测量其量（定量测量）。对于这一方法，在本发明中，本发明的MoAb，优选MoAbl用作引起 与抗酸杆菌、优选结核杆菌的LAM的特异性抗原-抗体反应的抗体。
[0251] 抗原-抗体结合的物质（"抗体-抗酸杆菌-抗体"复合物，并且优选的是"抗 体-结核杆菌-抗体"复合物）的测定可以通过使用用上述任一种标记物质标记的抗体（标 记的抗体）作为用来进行与抗酸杆菌、优选结核杆菌的LAM的抗原-抗体反应的抗体中的 一种（本发明的MoAb，优选MoAbl)而容易地进行。为了允许测定更容易地进行，例如，可以 使用用着色胶乳颗粒等（如胶体金等）标记的抗体进行的免疫层析法。本领域技术人员应 该充分知晓关于这些测定技术及其改进的多种方式的选择，并且本发明可以使用所述技术 中的任一种来实现（参见"Clinical Test Method Manual (临床检测方法手册）'Kanehara Shuppan，1995,等）。
[0252] 例如，所述方法可以使用具有下述结构的抗酸杆菌检测工具、优选结核杆菌检测 工具（以下，还称为"检测工具"进行）。所述检测工具是用于确定人或动物的体液（包括 痰液、唾液和尿液）中存在抗酸杆菌、优选结核杆菌的工具，即，确定抗酸杆菌、优选结核杆 菌感染的存在或不存在；并且包括由能够通过毛细作用转运测试样品的材料形成的溶液吸 收片。
[0253] 所述溶液吸收片包括：
[0254] ⑴样品收集部，其用于吸收和收集测试样品；
[0255] (ii)标记的抗体部，其负载有标记的与所述测试样品中的抗酸杆菌、优选结核杆 菌的LAM特异性反应的抗-结核杆菌LAM抗体（本发明的MoAb);
[0256] (iii)确定部，其包括下文所述的检测结果显示部，
[0257] (a)所述检测结果显示部在其上固定有未标记的抗-结核杆菌LAM抗体（本发明 的MoAb)，所述抗体与抗酸杆菌、优选结核杆菌的LAM特异性反应；并且
[0258] (iv)溶液吸收部，其用于吸收已经通过所述样品收集部、标记的抗体部和确定部 的测试样品的残余的溶液。
[0259] 应该注意，除了（a)检测结果显示部之外，（iii)确定部包括还包括下文所述的与 检测结果显示部分开放置的对照显示部：
[0260] (b)所述对照显示部其上固定有未标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（本发明的 MoAb)，优选未标记的抗-结核杆菌LAM抗体（本发明的MoAb 1)，所述抗体与标记的抗-抗 酸杆菌LAM抗体（本发明的MoAb)、优选标记的抗-结核杆菌LAM抗体（本发明的MoAb 1) 反应。
[0261] 使用所述检测工具，可以通过存在或不存在（a)检测结果显示部的显色而确定测 试样品中抗酸杆菌、优选结核杆菌的存在。
[0262] 本发明的检测工具包括由能够通过毛细作用或层析作用（在本发明中，这些总体 上称为"毛细作用"）转运测试样品的材料形成的溶液吸收片。所述溶液吸收片可以是薄片 样的片（以下，称为"薄片样片"），并且所述薄片样片可以由单个薄片形成，或可以由堆叠 或彼此连接的多层薄片形成。备选地，所述溶液吸收片可以采用能够通过毛细作用吸收并 转运液体的各种形式，诸如长的和薄的棒型片等。应该注意，本发明的检测工具还可以包括 用于负载所述溶液吸收片的支持体。
[0263] 用于溶液吸收片的材料没有特别限制，只要：所述材料具有允许溶剂（水、血清、 尿液和其他生物样品）、检测成分（抗酸杆菌，如结核杆菌）和包括所述检测成分的复合物 (例如，标记的抗-结核杆菌LAM抗体（本发明的MoAbl)和结核杆菌的复合物[标记的抗 体-结核杆菌]，或所述复合物与未标记的抗-结核杆菌LAM抗体（本发明的MoAbl)的复 合物[标记的抗体-结核杆菌-抗体])渗透的多孔结构或毛细结构；并且，当将含有所述 检测成分的样品应用（收集、滴加、添加）到（1)所述样品收集部时，所述材料允许所述测 试样品在多孔结构或毛细结构内转运（扩散），甚至在转运过程中当所述测试样品在其中 获得抗-结核杆菌LAM抗体（本发明的MoAbl)和所述复合物（标记的抗体-结核杆菌） 时。其实例可以包括上述固体载体。上述这些中，优选有机多孔体。应该注意，有机多孔体 的实例可以包括天然纤维，诸如纤维素，纤维素衍生物，如硝基纤维素，和半合成的纤维素， 如乙酸纤维素，由合成的纤维形成的纤维聚集物，如聚乙烯，聚丙烯，尼龙和聚酯，多孔聚丙 烯，多孔聚苯乙烯，多孔聚甲基丙烯酸甲酯，多孔尼龙，多孔聚砜，多孔氟树脂，和多孔合成 树脂，如在其中引入亲水基团的聚偏二氟乙烯。优选天然纤维，如纤维素，和纤维素衍生物， 如硝基纤维素，和半合成的纤维，如乙酸纤维素。
[0264] 对所述溶液吸收片的尺寸没有特别的限制；并且其优选的尺寸是宽（短边的长 度）约2-20mm，优选在约4-10mm的范围内，长（长边的长度）为20-200mm，优选在30-150mm 的范围内。
[0265] 下文中，将参照附图描述本发明一个实施方案的检测工具。
[0266] 图1中㈧和⑶显示本发明的检测工具的一种模式。图1中㈧和⑶是从本发 明的检测工具的侧面观察的示意图。在所述检测工具中，溶液吸收片包括用于收集（加入） 测试样品的样品收集部（1)，标记的抗体部（2)，具有检测结果显示部（a)的确定部（3)，和 用于吸收已经通过所述样品收集部、标记的抗体部和确定部的测试样品的残余的溶液的溶 液吸收部（4)。图1的（B)显示所述检测工具在确定部（3)除检测结果显示部（a)外还包 括对照显示部（b)。
[0267] 尽管在图1所示的实例中，溶液吸收片是由多片薄片形成的薄片样片，但是所述 薄片样片可以由均一材料的单个薄片形成，或可以由多片相同或不同材料的薄片整体上形 成为单个薄片。应该注意，整个薄片可以由多个薄片形成，或者可以具有部分由多个薄片形 成的部分。
[0268] 在图1所示的实例中，薄片样片粘合在支持体10上。在长边方向上从一个末端边 到另一个末端边，所述薄片样片依次包括形成样品收集部（1)的薄片21，形成标记的抗体 部（2)的薄片22,形成确定部（3)的薄片23,和形成溶液吸收部（4)的薄片24。此外，如 图2所示，其可以具有这样的构型，其中薄片21的末端部分与薄片22的末端部分重合，薄 片22的末端部分与薄片23的末端部分重合，薄片23的末端部分与薄片24的末端部分重 合。通过具有这样的构型，溶液的移动可以顺利进行。
[0269] 样品收集部（1)是用于吸收和收集作为测试靶标的测试样品的部分（测试样品供 给部）。测试样品的实例可以包括作为本发明的测定靶标的受试者的生物样品。
[0270] 如图1和图2所示，样品收集部（1)可以放置在薄片样片的末端部分（始端部）。
[0271] 形成标记的抗体部（2)，其与上述样品收集部（1)的末尾端接触（图1)，或其以与 样品收集部（1)部分重合的状态形成（图2)。标记的抗体部（2)以可解离的方式包括与测 试样品中包含的抗酸杆菌LAM、优选结核杆菌LAM特异性反应的抗体。具体地，本发明的检 测工具在形成标记的抗体部（2)的薄片22上以可解离的方式包括抗-抗酸杆菌LAM抗体 (本发明的MoAb)，优选抗-结核杆菌LAM抗体（本发明的MoAbl)，所述抗体通过抗原-抗 体反应特异性结合抗酸杆菌LAM、优选结核杆菌LAM。此处，本发明的MoAb以被上述标记物 质中的任一种标记的状态使用，即，作为标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的 MoAb)，并且MoAbl作为标记的抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)使用。
[0272] 在所述薄片样片中采用的材料中，标记的抗体部（2)优选由亲水性和吸水材料形 成，所述材料以可解离的方式包括标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)， 优选标记的抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)，所述抗体与已经通过样品收 集部（1)的测试样品中的检测成分（抗酸杆菌，优选结核杆菌）反应，形成抗原-抗体复合 物（抗酸杆菌LAM与标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)的复合物，优 选结核杆菌LAM与标记的抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)的复合物）。所 述材料具有允许复合物以图1中箭头P所示的方向移动的特性，所述移动与测试样品向确 定部（3)的移动相关联。
[0273] 应该注意，对用于使标记的抗体部（2)以可解离的方式负载标记的抗-抗酸杆 菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)、优选标记的抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明 的MoAbl)的方法没有限制；并且其实例包括将标记的抗体部（2)用包含标记的本发明的 MoAb、优选标记的本发明的MoAbl的溶液浸渍的方法，和将所述溶液黏附到标记的抗体部 (2)上的方法。此外，为了允许测试样品中所包含的检测成分（抗酸杆菌，优选结核杆菌） 与标记的抗体部（2)完全结合的目的，优选地使标记的抗体部（2)负载过量的标记的本发 明的MoAb，优选标记的本发明的MoAb 1。
[0274] 确定部（3)是用于将从样品收集部（1)经过标记的抗体部（2)移动的测试样品进 一步转运到溶液吸收部（4)的部分。确定部（3)在其转运区域包括用于捕获已转运的测 试样品中包含的特定成分（标记的本发明的MoAb)的复合物，优选结核杆菌LAM与标记的 抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)的复合物）并且显示捕获的结果的部分 (检测结果显示部（a))。由于可以基于检测结果显示部（a)上显示的结果来确定测试样品 中分枝杆菌的存在或不存在，因此，包括显示部（a)的区域称为"确定部（3)"。
[0275] 除了检测结果显示部（a)之外，本发明的检测工具可以在确定部（3)包括对照显 示部（b)。应该注意，检测结果显示部（a)和对照显示部（b)之间以一定的间隔设置依次排 列。
[0276] 以过量的量固定在检测结果显示部（a)上的是未标记的与抗酸杆菌LAM特异性反 应的抗体（未标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体），优选未标记的与抗酸杆菌LAM特异性反应的 抗体（未标记的抗-结核杆菌LAM抗体）。因此，通过在标记的抗体部（2)的抗原-抗体反 应已经与标记的本发明的MoAb结合的抗酸杆菌，优选已经与标记的本发明的MoAbl结合的 结核杆菌，在检测结果显示部（a)以与本发明的MoAb、优选标记的本发明的MoAbl的复合物 的形态被捕获；并且归因于所述标记物质的显色以依赖于所捕获的量的强度显现。
[0277] 应该注意，特异性结合抗酸杆菌的LAM的本发明的MoAb (本发明的MoAb)可以类 似地用作形成未标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体的抗-抗酸杆菌LAM抗体。此外，特异性结 合结核杆菌LAM的本发明的MoAbl (本发明的MoAbl)可以类似地用作形成未标记的抗-结 核杆菌LAM抗体的抗-结核杆菌LAM抗体。
[0278] 以确定的量固定在对照显示部（b)上的是未标记的与标记的抗体部（2)中包含的 标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)、优选标记的抗-结核杆菌LAM抗体 (标记的本发明的MoAbl)反应的未标记的抗体（第二抗体）。对照显示部（b)可以在测试 样品移动方向（图1中P的方向）上以检测结果显示部（a)_对照显示部（b)的顺序与检 测结果显示部（a)间隔放置。以过量的量固定在对照显示部（b)上的是未标记的与已经由 前面的薄片移动过来的测试样品中所含有的标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明 的MoAb)、优选抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)反应的抗体（第二抗体）。
[0279] 因此，在对照显示部（b)，捕获已经从标记的抗体部（2)解离并且释放到测试样 品中的标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)，优选抗-结核杆菌LAM抗 体（标记的本发明的MoAbl)，并且归因于标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的 MoAb)、抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)的标记物质的显色以依赖于固定 在对照显示部（b)上的第二抗体的量的强度显现。
[0280] 此处，如果其是与标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)、优选 抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)结合的抗体，则所述未标记的抗体（第二 抗体）是足量的。尽管所述未标记的抗体（第二抗体）没有限制，例如，可以使用抗酸杆菌 的LAM结合蛋白、阴离子颗粒等。
[0281] 使用本发明的检测工具的结核杆菌测定使用在确定部（3)的检测结果显示部（a) 的显色的存在或不存在作为指标进行。这时，如果需要，可以使用在确定部（3)的对照显示 部（b)的显色的存在或不存在进行确定。甚至当在检测结果显示部（a)的显色不可识别 时，如果显色在对照显示部（b)能够被识别，则测定已经适当地进行，并且测定结果可以确 定为阴性的。然而，当显色在对照显示部（b)不可识别时，这表示测定没有适当地进行，并 且检测结果显示部（a)的结果不能用来确定为阴性的。
[0282] 在薄片样片所采用的材料中，确定部（3)优选由亲水性和吸水材料形成，所述材 料能够通过毛细作用使包含多种成分的测试样品移动至溶液吸收部（4)，并且具有将未标 记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)、优选抗-结核杆菌LAM抗体（标记的 本发明的MoAbl)稳定地固定在检测结果显示部（a)上、或将未标记的抗体（第二抗体）稳 定地固定在对照显示部（b)上的特性。
[0283] 溶液吸收部（4)是用于吸收已经沿箭头P的方向从样品收集部（1)经过标记的抗 体部（2)和确定部（3)(检测结果显示部（a)，或检测结果显示部（a)和对照显示部（b)) 移动的测试样品的残余的溶液的部分。因此，在所述薄片样片所采用的材料中，溶液吸收部 (4)优选地由亲水性和吸附性材料形成，并且更优选的由具有不排斥吸收的溶液的特性的 材料或弹性材料形成。具体地，所述材料的实例包括无纺织物，如滤纸和亲水性纤维，并且， 还可以使用滤纸和无纺织物的层压体。
[0284] 尽管本发明的检测工具基本上包括具有上述构型的薄片样片，但是，除薄片样片 之外，其还可以包括支持体10。对支持体10没有特别的限制，只要其具有能够保持所述薄 片样片的构型和材料即可。例如，其可以是层压在要用的薄片样片的后表面（底层表面） 上的薄片样支持体，或用于支撑（housing)所述薄片样片的框架型支持体。
[0285] 薄片样支持体的实例可以包括由各种塑料（塑料薄片）、硬纸制成的薄片，由金属 (包括合金）（如铝）制成的薄片，例如，通过将多个不同类的或相同质量的纸裱糊在一起 (粘附在一起）得到的多层纸，通过将塑料薄片和纸裱糊在一起（粘附在一起）得到的制 品，通过将纸和金属薄片纸裱糊在一起（粘附在一起）得到的制品，通过将塑料薄片、纸和 金属薄片裱糊在一起（粘附在一起）得到的制品，和在其上提供有涂层（如防水涂层）的 纸，等等。优选地，支持体具有防水功能。
[0286] 框架型支持体优选是湿气不能透过的材料，诸如聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚苯 乙烯、丙烯酸聚合物等；但是，如果在其上进行防水处理，也可以使用由纸制成的制品。所述 框架优选在其上至少形成与在框架中支撑的薄片样片的样品收集部（1)相对应的"溶液收 集窗"，与确定部（3)的检测结果显示部（a)相对应的"确定显示窗"和与对照显示部（b)相 对应的"对照显示窗"。应该注意，"确定显示窗"和"对照显示窗"可以单独形成，或者可以 形成为一个窗口。
[0287] 为了使用包括上述薄片样片的本发明的检测工具，首先，将样品收集部（1)充满 测试样品。通过这样做，样品收集部（1)吸收的测试样品通过毛细作用渗透所述薄片样片， 并且首先到达以可解离的方式负载标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)、 优选抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)的标记的抗体部（2)。在此处，通过 抗原-抗体反应，测试样品中的检测成分（结核杆菌）与所述标记的抗-抗酸杆菌LAM抗 体（标记的本发明的MoAb)、优选抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)特异性 结合。接着，测试样品到达确定部（3)的检测结果显示部（a)，同时伴随着"抗酸杆菌与标记 的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)的复合物"结核杆菌与标记的抗-结 核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)的复合物"）和"未与结核杆菌结合的过量的标 记的结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的M 〇Ab)"（ "未与结核杆菌结合的过量的标记的结 核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb 1) ")。由于未标记的特异性结合抗酸杆菌的抗-抗 酸杆菌LAM抗体（本发明的MoAb)，优选未标记的特异性结合结核杆菌的抗-结核杆菌LAM 抗体（本发明的MoAbl)稳定地固定在检测结果显示部（a)上，测试样品中"已与抗酸杆菌 特异性结合的标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb) "、优选"已与结核杆菌 特异性结合的标记的抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl) "被捕获并且积聚。 结果，基于在所捕获的标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)中、优选在所 捕获的标记的抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)中的标记物质，检测结果显 示部（a)显现出强度依赖于测试样品中所含有的抗酸杆菌、优选结核杆菌的量的显色。利 用此，可以检测测试样品中存在或不存在抗酸杆菌、优选结核杆菌，及其数量比率。
[0288] 然后，测试样品到达确定部（3)的对照显示部（b)，同时伴随着"过量的未与抗酸 杆菌结合的标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb) "，优选"过量的未与结 核杆菌结合的标记的抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)"。由于与标记的 抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)结合的第二抗体（未标记的抗体），优选 与标记的抗-结核杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAbl)结合的第二抗体（未标记的抗 体）以特定的量稳定地固定在对照显示部（b)上，因此，捕获并积聚过量包含在测试样品中 的标记的抗-抗酸杆菌LAM抗体（标记的本发明的MoAb)、优选标记的抗-结核杆菌LAM抗 体（标记的本发明的MoAbl)。结果，对照显示部（b)显现出强度依赖于固定在对照显示部 (b)的第二抗体的量（或已与第二抗体结合的标记的抗体的量）的显色。
[0289] 除了上述这些之外，在不背离本发明的范围的前提下，可以对本发明的检测工具 进行各种改进。对本发明的检测工具，可以附上记载怎样使用所述检测工具和确定方法 的说明文件，由此本发明提供确定试剂盒，其是包括所述说明文件和所述检测工具的套件 (set)。
[0290] (IV)结核病诊断试剂或诊断试剂念
[0291] 上述抗酸杆菌检测方法和抗酸杆菌检测工具用于检测受试者的生物样品中抗酸 杆菌的存在。具体地，当本发明的MoAbl用作单克隆抗体时，可以举例结核杆菌作为抗酸杆 菌的优选的实例。因此，上述抗酸杆菌检测方法和抗酸杆菌检测工具用于诊断抗酸杆菌、特 别是结核杆菌感染的存在或不存在。
[0292] 因此，上述本发明的MoAb、优选MoAbl可用作结核病诊断试剂，并且本发明提供包 含本发明的MoAb、优选MoAbl的结核病诊断试剂。本发明的MoAb可以可解离地或不可解离 地固定在固体载体上，或者可以用任意标记物质标记。
[0293] 此外，当进行本发明的用于检测抗酸杆菌、特别是结核杆菌的方法时，所述方法可 以通过使用结核病诊断试剂盒容易地进行，所述试剂盒包括本发明的MoAb、优选MoAbl作 为结核杆菌检测试剂。因此，本发明提供用于进行结核病检测方法的结核病诊断试剂盒。 所述结核病诊断试剂盒是利用抗原-抗体反应检测测定测试样品中存在的结核杆菌的试 剂盒。当所述试剂盒包含本发明的MoAb、优选MoAbl时，其是充分的；并且所述试剂盒可以 包括上述结核杆菌检测工具，与本发明的MoAb、优选MoAbl反应的第二抗体，抗体检测试剂 等。此外，为了进行测定的便利，所述诊断试剂盒还可以包括适当的反应溶液、稀释溶液、润 洗溶液、反应终止溶液、标记活性测量试剂等。
[0294] (V)用于抗酸杆菌LAM(特别是结核杆菌LAM)的测定，和抗酸杆菌LAM(特别是结 核杆菌LAM)检测试剂或检测试剂盒
[0295] 本发明的MoAb是特异性识别并且结合抗酸杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM)的抗 体。因此，上述本发明的抗酸杆菌检测方法也可以用于测定抗酸杆菌LAM。
[0296] 具体地，本发明的用于抗酸杆菌LAM的测定可以通过下述步骤进行：
[0297] (1)使本发明的MoAb与可能包含抗酸杆菌的测试样品接触的步骤；和
[0298] (2)使用在本发明的MoAb与抗酸杆菌LAM之间的结合反应作为指标测定在测试样 品中存在的抗酸杆菌LAM的步骤。
[0299] 步骤⑴和（2)是分别对应于上述"（II)用于检测抗酸杆菌"中描述的步骤（1) 和（2)的步骤，并且上文在（II)中提供的描述在此也可以用作参考。另外，所述用于抗酸 杆菌LAM的测定可以使用上述"（II)用于检测分枝杆菌的方法"中所述的抗酸杆菌检测工 具类似地进行（应该注意，在该情形中，可以将其改述为"抗酸杆菌LAM检测工具"）。
[0300] 应该注意，关于本发明的MoAb，由于MoAbl是特异性识别并结合结核杆菌的脂阿 拉伯甘露聚糖（LAM)的抗体，上述本发明的抗酸杆菌检测方法也可以用作结核杆菌检测方 法用于测定结核杆菌LAM。
[0301] 此处，用于抗酸杆菌LAM、优选结核杆菌LAM的测定包括检测抗酸杆菌LAM、优选结 核杆菌LAM的定性测量和测量抗酸杆菌LAM、优选结核杆菌LAM的量的定量测量。定量测 量的实例可以包括，但不限于，预先由本发明的MoAb与已知量的抗酸杆菌LAM、优选结核杆 菌LAM反应产生标准曲线并且由所述标准曲线计算在测试样品中包含的抗酸杆菌LAM、优 选结核杆菌LAM的未确定的量的方法。
[0302] 在这样的测定中，本发明的MoAb可用作抗酸杆菌LAM检测试剂，并且本发明提供 抗酸杆菌LAM检测试剂，其包含本发明的MoAb作为抗酸杆菌LAM检测试剂。具体地，本发 明的MoAbl可用作结核杆菌LAM检测试剂，并且本发明提供结核杆菌LAM检测试剂，其包含 本发明的MoAb 1作为结核杆菌LAM检测试剂。本发明的这些MoAbs可以可解离地或不可解 离地固定在任意的固体载体上，或者可以用任意标记物质标记。
[0303] 当要进行本发明的抗酸杆菌LAM测定时，所述测定可以通过使用包含本发明的 MoAb作为抗酸杆菌LAM检测试剂的抗酸杆菌LAM检测试剂盒容易地进行。此外，当要进行 本发明的结核杆菌LAM测定时，所述测定可以通过使用结核杆菌LAM检测试剂盒容易地进 行，所述试剂盒包含本发明的MoAbs中的MoAbl作为结核杆菌LAM检测试剂。
[0304] 因此，本发明提供用于进行抗酸杆菌LAM测定的抗酸杆菌LAM检测试剂盒，特别是 用于进行结核杆菌LAM测定的结核杆菌LAM检测试剂盒。所述抗酸杆菌LAM检测试剂盒，特 别是所述结核杆菌LAM检测试剂盒，是利用抗原-抗体反应检测测定测试样品中存在的抗 酸杆菌、特别是结核杆菌的LAM的试剂的试剂盒。所述抗酸杆菌LAM检测试剂盒包括本发 明的MoAb。当所述结核杆菌LAM检测试剂盒包括本发明的MoAbl时，其是充分的，并且所述 试剂盒可以包括抗酸杆菌LAM检测工具（或结核杆菌LAM检测工具）、与本发明的MoAb (或 MoAbl)反应的第二抗体、抗体检测试剂等。此外，为了进行测定的便利，诊断试剂盒还可以 包括适当的反应溶液、稀释溶液、洗漆溶液、反应终止溶液、标记活性测量试剂等。
[0305] (VI)灭菌的样品的测定
[0306] 上述（III)中所述的本发明的用于检测抗酸杆菌或结核杆菌的方法可以作为无 生物公害的测定应用。具体地，本发明的无生物公害的测定可以通过下述步骤进行：
[0307] (1)将样品样品煮沸灭菌，优选高压蒸汽灭菌，
[0308] (2)使本发明的MoAb、优选MoAbl与所述灭菌的测试样品接触的步骤；
[0309] (3)使用本发明的MoAb、优选MoAbl与结核杆菌LAM之间的结合反应作为指标测 定所述测试样品中的结核杆菌的步骤；和
[0310] (4)当在所述测试样品中检测到结核杆菌LAM时，确定所述测试样品感染了结核 杆菌的步骤。
[0311] (VII)确定抗结核病药物的结核病治疗效果的方法
[0312] 上述（III)所述的本发明用于检测抗酸杆菌、特别是结核杆菌的方法可以用于确 定抗结核病药物的结核病治疗效果。
[0313] 具体地，本发明用于确定抗结核病药物的结核病治疗效果的方法可以通过下述步 骤进行：
[0314] (1)使本发明的MoAb、优选MoAbl与施用所述抗结核病药物之前和之后的测试样 品接触的步骤；
[0315] (2)使用在本发明的MoAb、优选MoAbl与结核杆菌LAM之间的结合反应作为指标 测定在施用所述抗结核病药物之前和之后所述测试样品中的结核杆菌LAM的步骤；和
[0316] (3)当在施用所述抗结核病药物之前的所述测试样品中检测到结核杆菌LAM，并 且在施用所述抗结核病药物之后的所述测试样品中没有检测到结核杆菌LAM时，确定所述 抗结核病药物具有结核病治疗效果。
[0317] 这些步骤（1)和（2)分别对应于在上述"（III)用于检测分枝杆菌、特别是结核杆 菌的方法"中记载的步骤（1)和（2)，并且，除了测试样品是具有感染的结核病（感染有结 核杆菌）的结核病患者的测试样品，并且进行所述方法的测试样品是在施用抗结核病药物 之前的测试样品（在结核病治疗前）和在施用所述抗结核病药物之后的测试样品（在结核 病治疗后）之外，在上述（III)中所述的方法可以相似地进行。另外，在（2)中进行的结核 杆菌LAM的测定可以使用在上述"（III)用于检测抗酸杆菌、特别是结核杆菌的方法"中记 载的结核杆菌检测工具类似地进行（应该注意，在这一情形中，可以将其改述为"结核杆菌 LAM检测工具"）。
[0318] 作为此处所述的抗结核病药物，可以使用本领域目前已知的那些，诸如利福 平（rifampicin)，异烟肼（isoniazid)(异烟酸肼），批嗪酰胺（pyrazinamide)，链霉素 (streptomycin)及其盐，以及乙胺丁醇（ethambutol)及其盐。然而,所述抗结核病药物不 限于此，并且包括展现出针对结核杆菌的杀菌作用（抗结核病活性）的核准的或未核准的 药物。
[0319] 作为上述步骤（2)的结果，当在施用抗结核病药物之前的测试样品中检测到结核 杆菌LAM(换言之，检测到结核杆菌），并且当在施用抗结核病药物之后的测试样品中没有 检测到结核杆菌LAM(结核杆菌）时，由于所述抗结核病药物对主题结核病患者具有结核病 治疗效果，因此，可以确定所述抗结核病药物的效用。
[0320] 另一方面，作为上述步骤（2)的结果，当在施用抗结核病药物之前的测试样品中 检测到结核杆菌LAM(换言之，检测到结核杆菌），并且当在施用抗结核病药物之后的测试 样品中也检测到结核杆菌LAM(结核杆菌）时，可以比较在施用所述抗结核病药物之前和之 后检测到的结核杆菌的量。此处，当观察到施用所述抗结核病药物之前和之后的结核杆菌 的量的减少时，提示所述抗结核病药物对主题结核病患者可能有结核病治疗效果，并且可 以对医学工作者提供继续使用所述抗结核病药物的治疗选择。另一方面，当没有观察到施 用所述抗结核病药物之前和之后的结核杆菌的量减少时，这表明所述抗结核病药物对主题 结核病患者没有结核病治疗效果。因此，可以向医学工作者提供停止使用所述抗结核病药 物并且转用另一利疗法的治疗选择。
[0321] 在上述方法中，本发明的MoAb、特别是MoAbl可用作抗结核病药物的结核病治疗 效果确定试剂，并且本发明提供结核病治疗效果确定试剂，其包含本发明的MoAb、特别是 MoAbl作为结核病治疗效果确定试剂。本发明的MoAb、特别是MoAbl可以可解离地或不可 解离地固定在任何固体载体上，或者可以用任意标记物质标记。
[0322] 此外，当进行上述本发明的确定方法时，所述方法可以通过使用结核病治疗效果 确定试剂盒容易地进行，所述结核病治疗效果确定试剂盒包括本发明的MoAb、优选MoAbl 作为结核病治疗效果确定试剂。因此，本发明提供用于进行抗结核病药物的结核病治疗效 果确定方法的结核病治疗效果确定试剂盒。所述结核病治疗效果确定试剂盒是用于通过使 用抗原-抗体反应检测测定在治疗之前和之后的测试样品中存在的结核杆菌LAM而确定抗 结核病药剂对结核病患者的治疗效果的试剂的试剂盒。当所述试剂盒包括本发明的MoAb、 优选MoAbl时，其是充分的；并且所述试剂盒可以包括上述结核杆菌LAM检测工具，与本发 明的MoAb反应的第二抗体，抗体检测试剂等。此外，为了进行所述测定的便利，诊断试剂盒 还可以包括适当的反应溶液、稀释溶液、润洗溶液、反应终止溶液、标记活性测量试剂等。
[0323] 用于活动性结核病的治疗通常通过施用四种以上类型的治疗剂持续六个月而进 行。当怀疑患有结核病感染时，首先，进行使用Ziehl-Neelsen染色或荧光染色的涂片检 测。如果在lml痰液样板中存在数目为10, 000个以上的细菌，则认为其是"涂片阳性的"。 作为传染源。痰液-涂片-阳性患者在临床上和对于公众健康是特别重要的。因此，涂片 阳性患者需要在结核病病房住院治疗。转为门诊治疗的一个指标是连续三天具有阴性的涂 片检查结果。本发明的结核杆菌LAM检测方法可以定量生物样品（如痰液、唾液和血液） 中的LAM浓度。因此，通过测定诸如痰液、唾液和血液的生物样品中的LAM，可以监测治疗剂 的效用，并且本发明还适用于确定对于细菌释放状态是感染阴性的。 实施例
[0324] 本发明及其效果在下文参照实施例进行描述。然而，本发明的范围不限于这些实 施例。
[0325] 实施例1-4
[0326] 1.材料准各
[0327] (1-1)制各宴聚-LAM和制各免疫原
[0328] 将人结核杆菌结核分枝杆菌（M. tuberculosis)的LAM(3mg)(来源于青山B菌株 (strain Aoyama B)，Nacalai Tesque)针对50mM乙酸盐缓冲液（pH 4.5)透析，并且调节 至浓度为lmg/mL。随后，向其中加入150 μ L 200mM高碘酸水溶液，并且将混合物在4°C避 光搅拌7分钟。搅拌后，向其中加入35 μ L乙二醇，并且将混合物使用小柱ro-ΙΟ (由GE Company制备）进行凝胶过滤（0. 1M碳酸氢钠 ，pH 8. 3)，并且分成各个lmL的部分。通过 苯酚-硫酸法检测分成的样品的糖；并且将检测到糖的级分针对纯水透析，然后冷冻干燥。
[0329] 将冷冻干燥的寡聚_LAM(3mg)溶解在0. 5mL纯水中。向其中加入12 μ L溶解在乙 腈中的100mg/mL 1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐并将混合物搅拌约1分钟后，向 其中加入12yL 0. 2M三乙胺，并且将混合物搅拌2分钟。然后，向其中加入0. 53mL溶解在 0. 5M碳酸氢钠缓冲液（pH 8. 5)中的0. 6M脂肪酸二酰肼（adipic acid dihydrazide)，并 将混合物在4°C搅拌10小时，然后针对纯水透析约1小时。
[0330] 向透析后得到的溶液中，加入300 μ g钥孔娀血蓝蛋白（KLH)、30 μ L 200mM磷酸盐缓冲液（pH 5. 0)和45 μ L 100mM Ν-羟基硫代琥珀酰亚胺钠 (N-hydroxysulfosuccinimide)。然后，再向其中加入65yL 1M二氯乙烧，并且将混合物在 4°C搅拌3小时以上。最后，将得到的混合物针对磷酸盐缓冲液透析，以获得寡聚-LAM-KLH 用于免疫原。将所述寡聚-LAM-KLH与佐剂（完全或不完全弗氏佐剂，由Difco制备）以 1 : 1的比率（寡聚-LAM-KLH :佐剂（重量比））混合，并且用作免疫原。
[0331] (1-2)制各BCG疫苗和免疫原
[0332] 作为BCG疫苗，使用由日本BCG实验室制备的冷冻干燥的BCG疫苗（授权号： 20300AMZ00767000)。对于免疫，使用100mg (湿重）冷冻干燥的BCG疫苗与lml生理盐水 的混合物。
[0333] (1-3)制各杀灭的H37Ra细菌细朐和免疫原
[0334] 作为杀灭的H37Ra细菌细胞，使用Difco制备的结核分枝杆菌H37Ra (冷冻干燥的 产品）。对于免疫，使用l〇〇mg(湿重）冷冻干燥的杀灭的H37Ra细菌细胞与lml生理盐水 的混合物。
[0335] (1-4)制各用于产牛scFv片段的引物
[0336] 表1显示制备单链抗体（scFvs)所用的引物的名称、碱基序列和用途。合成下述 引物：四条有义引物和一条反义引物用作VH区扩增的引物，四条有义引物和四条反义引物 用作VL区扩增的引物，一条有义引物和一条反义引物用作连接重链可变区片段和轻链可 变区片段的接头（GS接头）的扩增的引物，两条引物用于限制性酶（SfiI，NotI)识别区的扩 增。序列表的SEQ ID NOs :13-29所示的氨基酸序列对应于表1从上到下的顺序列出的引 物的氨基酸序列。
[0337]

【权利要求】
1. 能够结合抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的单克隆抗体，所述抗体为下述（A)-(c)中任 一项所述的抗体： (A) 单克隆抗体，其包含通过接头连接的重链可变区和轻链可变区，所述重链可变 区包含下述（a)-(c)所示的重链CDR1-CDR3,并且所述轻链包含下述（d)-(f)所示的 CDR1-CDR3 ; (a) 由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列组成的重链⑶R1， (b) 由SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的重链⑶R2， (c) 由SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列组成的重链⑶R3， (d) 由SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R1， (e) 由SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R2,和 (f) 由SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R3 ; (B) 单克隆抗体，其包含通过接头连接的重链可变区和轻链可变区，所述重链可变 区包含下述（g)-(i)所示的重链CDR1-CDR3,并且所述轻链包含下述（j)_⑴所示的 CDR1-CDR3 ; (g) 由SEQ ID NO :31所示的氨基酸序列组成的重链⑶R1， (h) 由SEQ ID NO :32所示的氨基酸序列组成的重链⑶R2， (i) 由SEQ ID N0:33所示的氨基酸序列组成的重链⑶R3， (j) 由SEQ ID N0:34所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R1， (k) 由SEQ ID N0:35所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R2,和 (l) 由SEQ ID NO :36所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R3 ;和 (C) 单克隆抗体，其包含通过接头连接的重链可变区和轻链可变区，所述重链可变 区包含下述（m)-(o)所示的重链CDR1-CDR3,并且所述轻链包含下述（p)-(r)所示的 CDR1-CDR3 ; (m) 由SEQ ID NO :47所示的氨基酸序列组成的重链⑶R1， (η)由SEQ ID NO :48所示的氨基酸序列组成的重链CDR2， (〇)由SEQ ID N0:49所示的氨基酸序列组成的重链⑶R3， (P)由SEQ ID N0:50所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R1， (q) 由SEQ ID NO :51所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R2,和 (r) 由SEQ ID N0:52所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R3。
2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中（A)的单克隆抗体由SEQ ID NO :12所示 的氨基酸序列组成。
3. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中（B)的单克隆抗体由SEQ ID NO :39所示 的氨基酸序列组成。
4. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中（C)的单克隆抗体由SEQ ID NO :30所示 的氨基酸序列组成。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体，其是单价或二价抗体。
6. 用于检测分枝杆菌（mycobacterium)的方法，所述方法包括下述步骤： (1) 使权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体与受试者的生物样品接触；并且 (2) 使用所述单克隆抗体与抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖之间的结合反应作为指标测定 所述样品中的分枝杆菌。
7. 根据权利要求6所述的方法，其使用权利要求1-5中任一项所述的（A)的单克隆抗 体特异性检测抗酸杆菌中的结核杆菌（tubercle bacillus)。
8. 抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖检测试剂，其包含权利要求1-5中任一项所述的单克隆 抗体。
9. 抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖检测试剂盒，其包含权利要求1-5中任一项所述的单克 隆抗体作为抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖检测试剂。
10. 结核病诊断试剂，其包含权利要求1-5中任一项所述的（A)的单克隆抗体。
11. 结核病诊断试剂盒，其包含权利要求1-5中任一项所述的（A)的单克隆抗体作为结 核病检测试剂。
12. 用于测量测试样品中的抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的方法，所述方法包括下述步 骤： (1) 使权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体与可能含有分枝杆菌的测试样品接 触；并且 (2) 使用所述单克隆抗体与抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖之间的结合反应作为指标测定 所述测试样品中的抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖。
13. 根据权利要求12所述的方法，其是包括检测抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖作为步骤 (2)的抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖定性方法，或是包括定量抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖作 为步骤（2)的抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖定量方法。
14. 根据权利要求12或13所述的方法，其使用权利要求1-5中任一项所述的（A)的单 克隆抗体作为单克隆抗体来特异性测量抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖中的结核杆菌脂阿拉 伯甘露聚糖。
15. 用于确定抗结核病药物的结核病治疗效果的方法，所述方法包括下述步骤： (1) 使权利要求1-5中任一项所述的（A)的单克隆抗体与施用所述抗结核病药物之前 和之后的测试样品接触； (2) 使用所述单克隆抗体与结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖之间的结合反应作为指标测定 在施用所述抗结核病药物之前和之后所述测试样品中的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖；并且 (3) 当在施用所述抗结核病药物之前在所述测试样品中检测到结核杆菌脂阿拉伯甘露 聚糖，并且在施用所述抗结核病药物之后在所述测试样品中没有检测到结核杆菌脂阿拉伯 甘露聚糖时，确定所述抗结核病药物具有结核病治疗效果。
16. 用于确定抗结核病药物的结核病治疗效果的方法，所述方法包括下述步骤： (1) 使权利要求1-5中任一项所述的（A)的单克隆抗体与施用所述抗结核病药物之前 和之后的测试样品接触； (2) 使用所述单克隆抗体与结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖之间的结合反应作为指标定量 在施用所述抗结核病药物之前和之后所述测试样品中的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖；并且 (3) 比较施用所述抗结核病药物之后所述测试样品中的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的 量（给药后测量）与施用所述抗结核病药物之前所述测试样品中的结核杆菌脂阿拉伯甘露 聚糖的量（给药前测量）；并且 当给药后测量低于给药前测量时，确定所述抗结核病药物具有结核病治疗效果，并且 当给药后测量不低于给药前测量时，确定所述抗结核病药物不具有结核病治疗效果。
17. 用于确定抗结核病药物的结核病治疗效果的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求 1-5中任一项所述的（A)的单克隆抗体。
18. 分枝杆菌检测工具，所述检测工具包含由能够通过毛细作用转移测试样品的材料 形成的溶液吸收片，所述溶液吸收片包含： (1) 样品收集部，其用于吸收和收集所述测试样品； (2) 标记的抗体部，其负载有与抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖特异性反应的标记的权利 要求1-5中任一项所述的单克隆抗体； (3) 确定部，其包括测试结果显示部（a)，在所述测试结果显示部（a)上固定有与抗酸 杆菌脂阿拉伯甘露聚糖特异性反应的未标记的权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体； 和 (4) 溶液吸收部，其用于吸收已经移动通过所述样品收集部、标记的抗体部和确定部的 测试样品的残余溶液。
19. 根据权利要求17所述的分枝杆菌检测工具，其中所述确定部（3)还包括对照显示 部（b)，在所述对照显示部（b)上固定有与标记的权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体 反应的未标记的抗体，所述对照显示部与所述测试结果显示部（a)分开放置。
20. 根据权利要求18或19所述的分枝杆菌检测工具，其用于检测作为抗酸杆菌的结核 杆菌，所述工具包含权利要求1-5中任一项所述的（A)的单克隆抗体作为单克隆抗体。
21. 用于免疫非人动物来产生特异性结合结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的单克隆抗体的 方法，所述方法包括向所述非人动物施用BCG作为免疫原来诱导针对BCG的体液免疫应答。
22. 用于产生特异性结合结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis)脂阿拉伯甘 露聚糖的单克隆抗体的方法，所述方法包括下述步骤： 向非人动物施用BCG作为免疫原来诱导针对BCG的体液免疫应答并且产生结合结核分 枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的抗体；并且 从所述非人动物收集产生所述抗体的细胞。
23. 用于产生特异性结合结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的单克隆抗体的方法，所述 方法包括下述步骤： 向非人动物施用BCG作为免疫原以诱导针对BCG的体液免疫应答； 制备编码特异性结合结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的抗体的mRNA ; 使用所述mRNA作为模板制备cDNA ;并且 使用所述cDNA通过噬菌体展示法收集特异性结合结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的 单克隆抗体。
24. 根据权利要求21或22所述的方法，其中特异性结合结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚 糖的单克隆抗体是权利要求1-5中任一项所述的（A)的单克隆抗体。
25. 用于产生特异性结合抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的单克隆抗体的方法，所述方法 包括下述步骤： 向非人动物施用脂阿拉伯甘露聚糖与权利要求1所述的抗体的复合物作为免疫原，以 诱导针对所述复合物的体液免疫应答并且产生结合抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的抗体；并 且从所述非人动物收集产生所述抗体的细胞。
26. 用于产生特异性结合抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的单克隆抗体的方法，所述方法 包括下述步骤： 向非人动物施用脂阿拉伯甘露聚糖与权利要求1所述的（A)的抗体的复合物作为免疫 原，以诱导针对所述复合物的体液免疫应答； 制备编码特异性结合抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的抗体的mRNA ; 使用所述mRNA作为模板制备cDNA ;并且 使用所述cDNA通过噬菌体展示法收获特异性结合抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的单克 隆抗体。
27. 根据权利要求25或26所述的方法，其中所述特异性结合抗酸杆菌脂阿拉伯甘露聚 糖的单克隆抗体是权利要求1所述的单克隆抗体。
【文档编号】C12M1/34GK104144944SQ201380011658
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年2月28日 优先权日:2012年2月29日
【发明者】葛城肃典, 富樫将高, 织田哲弥, 伊藤隆太, 川口知惠, 西条容子, 古贺大辅, 松本真, 藤原守, 小野贤司 申请人:大塚制药株式会社