用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法

用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法
【专利摘要】提供了能进行简单、高度准确的分析的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法。提供了用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，所述方法包括：干燥试剂溶液的固化步骤，试剂溶液包括核酸扩增反应所需的至少一部分物质；以及，将包括固化物质的试剂置于井内的收纳步骤，所述井作为核酸扩增反应的反应场所。在用所述制造方法制造的用于核酸扩增反应的微芯片中，由于核酸扩增反应所需的物质在固化之后收纳，核酸扩增反应中抑制了非特异性扩增，因此分析准确度高。
【专利说明】用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法

【技术领域】
[0001] 本技术涉及用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法。更特别地，本技术涉及包括 至少一种或多种反应所需物质的固化试剂装到作为核酸扩增反应的反应场所的井内的用 于核酸扩增反应的微芯片。

【背景技术】
[0002] 近年来，开发了利用半导体行业使用的微加工技术将用于进行化学生物分析的井 和通道置于硅基板或玻璃基板上的微芯片。这种微芯片已开始用于例如液相色谱法中的电 化学检测器、医疗服务场所的小型电化学传感器等。
[0003] 使用这种微芯片的分析系统称为μ -TAS(微型全分析系统）、芯片实验室、生物芯 片等。作为一种可提高化学生物分析的速度、效率和集成度或可减小分析装置尺寸的技术， 这种微芯片广受关注。μ -TAS可通过少量样品进行分析并能实现微芯片的一次性使用，有 望特别应用于对珍贵微量样品或大量标本进行处理的生物分析。
[0004] μ -TAS的一种应用示例是光学检测装置，将物质导入微芯片上设置的多个区域， 对物质进行光学检测。这种光学检测装置可包括使多种物质在微芯片上的井中进行反应， 例如，核酸扩增反应，并对生成的物质进行光学检测的反应装置（例如，实时PCR装置）。
[0005] 微芯片式核酸扩增装置采用常规方法，通过将核酸扩增反应所需的所有试剂和模 板DNA预先混合，并将混合溶液置于微芯片上设置的多个井内而进行反应。但是，采用这种 方法，由于将混合溶液导入井内之前需要花费大量时间，在该时间段内混合液体已经开始 反应，因此容易发生非特异性核酸扩增，从而降低了定量特性。
[0006] 针对上述问题，例如，JP-A-2011-160728公开了一种将核酸扩增反应所需的多种 试剂在井内按顺序分层并混合的微芯片。
[0007] 引用列表
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献 1 :JP 2011_16〇728Α


【发明内容】

[0010] 技术问题
[0011] 本技术的主要目的是提供能进行简单、高度准确的分析的用于核酸扩增反应的微 芯片的制造方法。
[0012] 问题解决方案
[0013] 根据本发明的第一方面，为了实现上述目的，提供了一种用于核酸扩增反应的微 芯片的制造方法，所述方法包括：干燥试剂溶液的固化步骤，试剂溶液包括核酸扩增反应所 需的至少一部分物质；以及，将固化的试剂溶液置于井内的收纳（containment)步骤，所述 井作为核酸扩增反应的反应场所。
[0014] 优选地，固化步骤包括试剂溶液的冻干步骤。
[0015] 根据本技术的方法还可包括在固化步骤之前准备具有不同成分的多种试剂溶液 的制备步骤，试剂溶液可包括第一试剂溶液和第二试剂溶液，第一试剂溶液包括低聚核苷 酸引物但不包括酶，第二试剂溶液包括酶但不包括低聚核苷酸引物。
[0016] 进一步，固化步骤还可包括第一试剂溶液和第二试剂溶液的单独冻干步骤。
[0017] 另外，收纳步骤可包括在多个所述井的每个井中收纳已经固化并且包括两种或更 多种低聚核苷酸引物的第一试剂溶液的步骤。
[0018] 根据本发明的另一个方面，为了实现上述目的，提供了一种用于核酸扩增反应的 微芯片的制造方法，所述方法包括：在固化步骤中固化第一试剂溶液和第二试剂溶液的其 中之一；以及，在收纳步骤之前将固化步骤中没有使用的试剂溶液逐滴添加到井中并在井 中干燥的固定步骤。
[0019] 优选地，固定步骤包括试剂溶液的真空干燥步骤。
[0020] 发明有益效果
[0021] 根据本技术，提供了一种能进行简单、高度准确的分析的用于核酸扩增的微芯片 的制造方法。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 【图1】图1为说明根据本技术第一实施方式的微芯片la的配置的示意图。
[0023] 【图2】图2为说明微芯片la的井43的配置的示意图。
[0024] 【图3】图3为说明微芯片la的制造方法的流程图。
[0025] 【图4】图4为说明微芯片la的变形实施方式的配置的示意图。
[0026] 【图5】图5为说明根据本技术第二实施方式的微芯片lb的井43的配置的示意图。
[0027] 【图6】图6为说明微芯片lb的制造方法的流程图。
[0028] 【图7】图7为说明根据本技术第三实施方式的微芯片lc的井43的配置的示意图。
[0029] 【图8】图8为说明根据本技术的微芯片中的核酸扩增的开始时间的图表（graph)。

【具体实施方式】
[0030] 下文将根据附图对本发明的优选实施方式进行详细说明。注意，在该说明书和附 图中，基本具有相同功能和结构的单元用相同参考符号表示，其重复说明将省略。说明将按 以下顺序进行。
[0031] 1.根据本技术第一实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的配置
[0032] 2.根据本技术第一实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法
[0033] (1)基板层的成型
[0034] (2)试剂溶液的制备
[0035] (3)试剂溶液的固化
[0036] (4)试剂的收纳
[0037] (5)基板层的粘合（bonding)
[0038] 3.根据第一实施方式的变形实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的配置
[0039] 4.根据本技术第二实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的配置
[0040] 5.根据本技术第二实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法
[0041] (1)试剂溶液的固定
[0042] (2)试剂的收纳
[0043] 6.根据本技术第三实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的配置
[0044] 1.根据本技术第一实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的配置
[0045] 图1为根据本技术第一实施方式的微芯片la的配置的示意图。图1A为顶面示意 图，图1B为沿图1A的P-P断面所见的断面示意图。
[0046] 作为导入样品溶液的区域，参考数字la表示的用于核酸扩增反应的微芯片（下文 称为"微芯片"）包括从外部导入液体（例如，样品）的导入部分2、作为核酸扩增反应的反 应场所的井41至45,以及将导入部分2与各个井连接的通道31至35。进一步，如下文所 述，包括核酸扩增反应所需的至少一部分物质的试剂R1和R2装到井41至45内（试剂R1 和R2在图1B中未显示）。在图1及其描述中，由通道31提供样品溶液的五个井均称为井 41。同样地，由通道32、33、34和35提供样品溶液的五个井统称为井42、43、44和45。进一 步，术语"样品溶液"指包括核酸（例如，DNA或RNA)的溶液，所述核酸是作为核酸扩增反应 中的扩增目标的模板核酸。
[0047] 使用根据本技术的微芯片进行的"核酸扩增反应"的示例可包括采用热循环法的 常规PCR(聚合酶链反应），以及不涉及热循环法的各种恒温扩增反应。恒温扩增反应的示 例包括LAMP (环介导等温扩增）、SMAP(智能扩增过程）、NASBA(核酸序列依赖性扩增）、 ICAN? (恒温和嵌合引物引发的核酸扩增）、TRC (逆转录协同转录）、SDA (链置换扩增）、 TMA(转录介导的扩增）、RCA(滚环扩增）等方法。另外，"核酸扩增反应"广义上包括基于 变化温度或恒定温度，针对核酸扩增的核酸扩增反应。进一步，这种核酸扩增反应还包括涉 及扩增核酸量化的反应，例如，实时PCR法。
[0048] 通过将基板层11粘合在基板层12上，随后将基板层13粘合在基板层11上而形成 微芯片la，基板层12上形成有导入部分2、通道31至35和井41至45 (参见图1B)。在微芯 片la中，如果基板层11和基板层12的粘合是在低于大气压力的压力下进行的，导入部分 2、通道31至35和井41至45的内部可以低于大气压力的压力密封（大气压力的1/100)。 在微芯片la中，通过使导入样品溶液的区域的压力低于大气压力，导入样品溶液时，由于 微芯片内存在负压，样品溶液会被吸入。因此，形成微型通道结构的微芯片la内样品溶液 的导入可在较短时间内进行。
[0049] 可使用玻璃和各种塑料作为基板层11、12和13的材料。优选地，基板层12和13 由不透气材料制成。对构成微芯片la外表面的基板层12和13使用不透气材料，例如，PC， 可防止导入井41至45内的样品溶液由核酸扩增反应的热量而转化成气体并通过基板层11 逸散（流体损失）。进一步，微芯片la导入样品溶液的区域由于压力低于大气压力而密封 时，优选地，基板层12和13由不透气材料制成，以防止空气从微芯片la外部进入，从而保 持内部负压。
[0050] 构成不透气基板的材料的示例包括玻璃、塑料、金属和陶瓷。塑料的示例包括 PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯丙烯酸树脂）、PC(聚碳酸酯）、PS(聚苯乙烯）、PP(聚丙烯）、 PE(聚乙烯）、PET(聚对苯二甲酸乙二酯）、二甘醇二烯丙基碳酸酯（diethylene glycol bis-allyl carbonate)、SAN树脂（苯乙烯-丙烯共聚物）、MS树脂（MMA-苯乙烯共聚 物）、TPX (聚（4-甲基戊烯-1))、聚烯烃、SiMA (硅氧烷甲基丙烯酸酯单聚物）-MMA共聚物、 SiMA-含氟单体共聚物、硅大分子单体-(A)-HFBuMA (甲基丙烯酸七氟丁酯）-MMA三元共聚 物、双取代聚乙炔类聚合物等。金属的示例包括铝、铜、不锈钢（SUS)、硅、钛、钨等。陶瓷的 示例包括氧化错（A120 3)、氮化错（A1N)、碳化娃（SiC)、氧化钛（Ti02)、二氧化锫（Zr02)、石 英等。
[0051] 基板层11优选由弹性材料制成。在微芯片la中，通过用弹性材料制成密封导入 部分2的基板层11，例如针的贯穿件的一部分，可从微芯片la的外部穿透导入部分2。如 果与针连接的注射器预先装有样品溶液，且该针穿过基板层11，密封的导入部分2与注射 器的内部连接，可在不形成气泡的情况下将样品溶液导入微芯片la。
[0052] 进一步，微芯片la导入样品溶液的区域由于压力低于大气压力而密封时，在针尖 到达导入部分2时，由于微芯片la外部与导入部分2之间存在压力差，注射器中的样品溶 液被自动吸入到导入部分2中。
[0053] 通过将基板层11用弹性材料制成，导入样品溶液之后从导入部分2中抽出针时， 由于基板层11的自动密封能力，穿透位置可自然密封。在本技术的一个实施方式中，由于 基板层的弹性变形针的穿透位置的自然密封被称作"自密封能力"。
[0054] 除硅类弹性体，例如，聚二甲基硅氧烷（PDMS)之外，弹性材料的示例还包括丙烯 酸类弹性体、尿烷类弹性体、氟类弹性体、苯乙烯类弹性体、环氧类弹性体和天然橡胶。
[0055] 应注意的是，在对根据本技术一个实施方式的微芯片la的每个井中保持的物质 进行光学分析的情况下，优选的是选择透光的并且由于固有荧光少、波长色散小而具有很 小光学误差的材料作为每个基板层的材料。
[0056] 接下来将对微芯片la的井中所含的试剂进行说明。在图2A中，将井43作为微芯 片la的井的一个代表进行图解。井43含有固相试剂R1和R2。试剂R1和R2包括核酸扩 增反应中获取扩增核酸链所需的至少一部分物质。具体示例包括与作为扩增目标的DNA、 RNA等的至少一部分碱基序列互补的低聚核苷酸引物（下文中有时还称为"引物")、核酸单 体（dNTPs)、酶、以及反应缓冲溶液中包括的成分。另外，虽然核酸扩增反应中并非直接需 要，但试剂R1和R2中还可包括含有用于检测扩增核酸链的标记物（例如荧光标记物）的 探针、嵌入双链核酸中的检测试剂等，作为用于检测扩增核酸链的物质。
[0057] 试剂R1和R2中包括的核酸扩增反应所需的成分可为互不相同的成分。例如，试 剂R1可为包括引物但不包括酶的试剂溶液（第一试剂溶液），试剂R2可为包括酶但不包 括引物的试剂溶液（第二试剂溶液）。通过包括引物的试剂R1中不包括酶，包括酶的试剂 R2中不包括引物的配置，在将样品溶液导入井内之前，引物和酶不会混合，抑制了引物二聚 物的出现。可替代地，试剂R1可为包括酶但不包括引物的试剂溶液（第二试剂溶液），试 剂R2可为包括引物但不包括酶的试剂溶液（第一试剂溶液）。试剂R1和R2的成分可自 由选择。应注意的是，试剂R1和R2并不限于图2所示的形状。只要其体积可容纳在井43 内，可为任何形状。进一步，具有相同成分的试剂R1和R2可装在微芯片la中提供的多个 井内，或具有不同成分的试剂R1和R2可装在每个井内。
[0058] 2.根据本技术第一实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法
[0059] 现在将根据图3所示的流程图对微芯片la的制造方法进行说明。
[0060] (1)基板层的成型
[0061] 在图3中，参考符号S1代表基板层的成型步骤。在该步骤中，导入部分2、通道31 至35和井41至45形成于基板层12上。导入部分2等在基板层12上的成型可用已知技 术进行。例如，可用玻璃基板层的湿法蚀刻或干法蚀刻，或塑料基板层的纳米印刷、注塑成 型或切割而进行成型。进一步，导入部2等可成型于基板层11上，或一些部分可成型于基 板层11上，其余部分成型于基板层12上。
[0062] (2)试剂溶液的制备
[0063] 在图3中，参考符号S2代表试剂溶液的制备步骤。在该步骤中，基于要收纳到微 芯片la中的试剂R1和R2的成分制备液体或凝胶状试剂溶液。试剂溶液仅包括核酸扩增 反应所需的至少一部分物质就已足够，反应溶液的成分可随机制备。例如，可制备仅包括引 物的试剂R1和仅包括酶的试剂R2。进一步，制备的试剂溶液的类型的数量并不限于两种。 单种试剂溶液可包括一种类型或多种类型的核酸扩增反应所需物质。
[0064] 如果在制备步骤中制备的试剂溶液中包括引物，可包括一种类型的引物或多种类 型的引物。在根据本技术的微芯片la的制造方法中，应注意的是，包含与由指定碱基序列 构成的引物不同的碱基序列的引物被视为不同类型的引物。即，对于属于扩增目标的目标 核酸，设计用于一个核酸链的碱基序列的引物与设计用于互补链的碱基序列的引物成对的 引物组被视为包括两种类型的引物。这些引物类型的定义在下文所述的第二和第三实施方 式中相同。
[0065] 对于试剂溶液的成分，例如，优选地，应配置包括引物但不包括酶的试剂溶液和包 括酶但不包括引物的试剂溶液，因为这意味着开始核酸扩增反应时导入的样品溶液到达井 内之前，引物和酶不会混合，抑制了引物二聚物对核酸产生的非特异性扩增反应。进一步， 优选地，含引物的试剂溶液包括两种或多种类型的引物。
[0066] 在试剂溶液制备步骤S2中，优选地，应将试剂溶液、以及添加到反应溶液中的引 物溶液和酶溶液保持在低温下。将试剂溶液等保持在低温下可通过将装有试剂溶液等的容 器放置在冰上或将保持铝块等的管子（tube)的设备预先放置在冷却器中并在冷却状态下 使用而进行。
[0067] (3)试剂溶液的固化
[0068] 在图3中，参考符号S3a代表试剂溶液的固化步骤。在该步骤中固化在制备步骤 S2中制备的多种试剂溶液。即，在该步骤中，将试剂溶液干燥，以生成固态试剂R1和R2。固 定步骤S3a将分成两个阶段来说明，如图3所示，按顺序分别为"试剂溶液逐滴添加"步骤 S3a-1和"冻干"步骤S3a-2。应注意的是，图3为在制备步骤S2中准备两种类型的试剂溶 液的情况的流程图。
[0069] 试剂溶液逐滴添加步骤S3a_l
[0070] 在该步骤中，将在上述试剂溶液制备步骤S2中制备的试剂溶液逐滴添加到将用 于固化步骤S3a的固化容器中。如果在制备步骤S2中制备了多种类型的试剂溶液，将每种 试剂溶液单独逐滴添加到固化容器中，并单独固化。进一步，即使在将具有相同成分的试剂 R1收纳到微芯片la的多个井41至45中的情况下，也需要准备与多个井匹配的多个固化容 器，并将试剂溶液逐滴添加到各个固化容器中。固化容器可为任何材料，但优选地，固化容 器应能承受在后续冻干步骤S3a_2中设置的温度和气压。
[0071] 冻干步骤S3a_2
[0072] 在该步骤中，通过干燥的方式使逐滴添加到容器中的上述试剂溶液固化。优选的 干燥方法是（例如）冻干。进一步，优选地，冻干包括预冻、一次干燥（升华冷冻）和二次 干燥（去除结合水）等步骤。如果冷冻温度处于低共熔点（试剂溶液冻结的温度）或更 低，可进行预冻步骤。但是，为了防止酶失活并且完全冷冻试剂溶液，优选地，应在约-40°C 进行冷冻。在一次干燥步骤中，对在预冻步骤中冷冻的试剂溶液进行干燥。此时，可防止干 燥过程中出现溶解，并且可通过在低共熔点或更低的温度下干燥试剂溶液而使试剂溶液中 所含的水分升华。一次干燥步骤中的真空度优选为例如l〇〇Pa以下。在lOOPa的水的沸点 约为-20°C，接近上述试剂溶液的低共熔点。因此防止了干燥过程中出现溶解。一次干燥步 骤中的真空度可根据制备的试剂溶液的低共熔点而适当选择。在二次干燥步骤中，将一次 干燥步骤之后粘附在试剂溶液所含成分上的分子状态下的水去除。试剂溶液可被加热到试 剂溶液中的成分不失活、不变性等的温度，以增加试剂溶液的干燥度。应注意的是，在根据 本技术的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法中，固化步骤S3a的干燥方法并不限于冻 干。
[0073] (4)试剂的收纳
[0074] 在图3中，参考符号S4代表试剂R1和R2的收纳步骤。在该步骤中，将在上述试 剂溶液固化步骤S3a中在固化容器中生成的固相试剂R1和R2从固化容器中取出，装到在 基板层成型步骤S1中在基板层中形成的任何一个井中。试剂R1和R2可装到基板层12上 提供的多个井中的任何一个或多个井中。进一步，一个井中收纳的试剂R1和R2的数量和 类型可自由设置。多个井中可收纳具有相同成分的试剂R1和R2或具有不同成分的试剂R1 和R2。如果引物包含在试剂R1或试剂R2中，优选在一种试剂中包括两种或更多种类型的 引物。例如，可准备分别含有不同引物的试剂R1和试剂R2,可将试剂R1和R2装到微芯片 la中提供的多个井中单独的井中。在这种情况下，可在单次核酸扩增反应中分析具有不同 碱基序列的多个核酸链的扩增，因此使用微芯片la进行的分析较为简单。
[0075] (5)基板层的粘合
[0076] 在图3中，参考符号S5代表基板层粘合步骤。在该步骤中，在装有试剂R1和R2 的基板层上粘合另一个基板层。基板层11、12和13的粘合可用已知方法进行，例如，热熔 粘合、粘合剂粘合、阳极键合、用压敏粘合片粘合、等离子活化键合、超声焊接等。进一步，通 过在低于大气压力的压力下进行基板层11、12和13的粘合，可以使被导入样品溶液的、导 入部分2、通道31至35和井41至45各个区域处于低于大气压力的压力下（例如，大气压 力的1/100)。将弹性透气材料（例如PDMS)用于密封井41至45的基板层11时，如果在基 板层11和12粘合之后，将这些层在负压（真空）下放置，各个区域（例如导入部分2)中 存在的空气会穿过基板层11。因此，可使微芯片la的内部处于低于大气压力的压力下（真 空）。应注意的是，使微芯片la的内部的压力低于大气压力的步骤并非根据本技术一个实 施方式的微芯片的制造方法中的必要步骤。
[0077] 在根据本技术的用于核酸扩增反应的微芯片la中，包括核酸扩增反应所需的一 部分物质的试剂R1和R2装到作为分析地点的井41至45内。因此，可通过在井41至45 中提供核酸扩增反应所需的剩余物质和包括目标核酸扩增链的样品溶液而开始进行核酸 扩增反应。进一步，通过将多种固态试剂R1和R2装到井41至45中，核酸扩增反应所需的 多种物质可在开始分析之前在微芯片la中保持分离状态。因此，在使用微芯片la的核酸 扩增反应中，可抑制由于引物互相退火而产生的引物二聚物等，减少了核酸非特异性扩增。 另外，通过在单独容器中进行试剂R1和R2的制备，单独固化用于核酸扩增反应的物质较为 简单。因此，根据本技术的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法使得能够制造出可既简 单又高度准确地分析的用于核酸扩增反应的微芯片。
[0078] 3.根据第一实施方式的变形实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的配置
[0079] 在图4中，对于装到根据第一实施方式的变形实施方式的微芯片la-2的井中的试 剂R，示意性示出井43作为代表。除各个井（例如井43)中所含的试剂R的成分之外，微芯 片la-2与第一实施方式中的相同。与第一实施方式相同的部分用相同参考数字表不，其说 明将省略。进一步，构成微芯片la-2的基板层11、12和13的材料与用与微芯片la的参考 数字相同的参考数字表示的基板层相同。
[0080] 一种类型的试剂R装到微芯片la-2的井43中。除制备的试剂溶液的类型之外， 微芯片la-2的制造步骤与图3所示的流程图相同。因此，制造步骤的说明将省略。如图4 的井43所示，微芯片la-2中所含的试剂R可为单一类型。例如，可将含有酶的试剂R装到 井43中，核酸扩增反应所需的其它成分，例如，引物，可在开始核酸扩增反应时通过与样品 溶液混合而导入微芯片la-2内。
[0081] 在根据本技术的微芯片la-2中，核酸扩增反应所需的一部分成分预先装到井41 至45内，因此，在将样品溶液导入井内之前，井中的试剂R所含的成分可与其它成分保持分 离。因此，例如，在核酸扩增反应开始之前，酶和引物可分离，因此抑制了引物二聚物等引起 的非特异性扩增，使得采用微芯片la-2进行的分析高度准确。
[0082] 4.根据本技术第二实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的配置
[0083] 在图5中，对于装到根据本技术第二实施方式的微芯片lb的井中的试剂R1和R2， 示意性示出井43作为代表。除各个井，例如，井43中所含的试剂R1和R2的成分之外，微 芯片lb与第一实施方式中的相同。与第一实施方式相同的部分用相同参考数字表不，其说 明将省略。进一步，构成微芯片lb的基板层11、12和13的材料与用与微芯片la的参考数 字相同的参考数字表示的基板层相同。
[0084] 与微芯片la中包含的试剂相似，图5所示的试剂R1和R2为包括核酸扩增反应所 需的至少一部分物质的固态试剂。由于试剂R1和R2的成分与微芯片la中包含的试剂R1 和R2相同，其说明将省略。微芯片lb中包含的试剂R1和R2与微芯片la中包含的试剂R1 和R2之间的差别在于，井43中包含的一部分试剂固定在井内（如图5所示）。
[0085] 5.根据本技术第二实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法
[0086] 现在将根据图6所示的流程图对微芯片lb的制造方法进行说明。由于基板层成 型步骤S1、试剂溶液制备步骤S2和基板层粘合步骤S5分别与第一实施方式中的相同，其说 明将省略。下文将对试剂溶液固定步骤S3b和试剂收纳步骤S4进行说明。
[0087] (1)试剂溶液的固定
[0088] 在图6中，参考符号S3b代表试剂溶液的固定步骤。在该步骤中，将在制备步骤S2 中准备的多种类型的试剂溶液中的一种类型的试剂溶液固定在井43内。即，将试剂溶液在 井43内干燥，将干燥的试剂溶液固定在井内。固定步骤S3b将按图6所示的"试剂溶液逐 滴添加"步骤S3b-1和"真空干燥"步骤S3b-2的顺序说明。进一步，在微芯片lb的制造过 程中，将试剂溶液固定步骤S3b中未使用的其它试剂溶液以与第一实施方式相同的方式用 试剂溶液固化步骤S3a转化成固态。
[0089] 试剂溶液（R2)逐滴添加步骤S3b_l
[0090] 在该步骤中，将上述在试剂溶液制备步骤S2中制备的试剂溶液中的一种类型的 试剂溶液逐滴添加到在成型步骤S1中形成于基板层12等中的每个井内。在该阶段，优选 地，形成有井的基板层12已经冷却。
[0091] 真空干燥步骤S3b_2
[0092] 在该步骤中，通过在真空（600至1，OOOPa)下放置已逐滴添加了上述试剂溶液的 基板层12而对试剂溶液进行干燥。与第一实施方式中的试剂溶液固化步骤S3a不同，在该 方法中，需要选择不会改变基板层12的形状的干燥方法，因此优选的方法是真空干燥法。 根据试剂溶液中所含物质的特性，干燥方法还可为例如风干法。
[0093] (2)试剂的收纳
[0094] 在图6中，参考符号S4代表试剂收纳步骤。由于上述试剂溶液固定步骤，与第一 实施方式不同，试剂R2已存在于微芯片lb中的井43内。在该步骤中，将在试剂溶液固化 步骤S3a中准备的试剂R1单独装到已固定了试剂R2的井内。要装到微芯片lb中的固化 试剂溶液R1并不限于一种类型，可自由选择。
[0095] 在根据本技术的微芯片lb中，将包括核酸扩增反应所需的一部分物质的试剂R1 和R2装在作为分析地点的井41至45内。因此，与微芯片la相似，使用微芯片lb进行核 酸扩增反应时，可仅通过在井41至45中导入核酸扩增反应所需的剩余物质和包括目标核 酸扩增链的样品溶液而进行核酸扩增反应。进一步，装到井41至45中的具有不同成分的 多种固态试剂R1和R2所含的成分可在开始核酸扩增反应之前保持在分离状态。因此，通 过分别将例如酶和引物作为试剂R1和试剂R2中包含的成分，可抑制由于引物二聚物的出 现而产生的核酸非特异性扩增反应。
[0096] 6.根据本技术第三实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的配置
[0097] 在图7中，对于装到根据第三实施方式的微芯片lc的井中的试剂R，示意性示出 井43作为代表。除各个井（例如井43)中所含的试剂R的成分之外，微芯片lc与第一实 施方式中的相同。与第一实施方式相同的部分用相同参考数字表不，其说明将省略。进一 步，构成微芯片lc的基板层11、12和13的材料与用与微芯片la的参考数字相同的参考数 字表不的基板层相同。
[0098] 包括在核酸扩增反应中获取核酸扩增链所需的至少一部分物质的试剂R固定到 微芯片lc的井43中（图7)。试剂R所含的核酸扩增反应所需的成分可为单一类型，或多 种类型。
[0099] 在微芯片lc的制造步骤中，由于基板层成型步骤S1、试剂溶液制备步骤S2和基板 层粘合步骤S5与第一实施方式中的相同，其说明将省略。与第二实施方式中的试剂溶液固 定步骤S3b相似，通过将按预定成分制备的试剂溶液逐滴添加到基板层12上提供的每个井 中，并用真空干燥法等将试剂溶液固定在井43中而进行将试剂溶液固定到井43中的步骤。 [0100] 在试剂溶液的逐滴添加过程中，优选地，将制备的试剂溶液存储在低温下。进一 步，优选地，形成有各个井的基板层12也应存储在低温下。例如，保持基板层12的设备（例 如，铝块）可预先在冷却器中冷却，通过将基板层12放置在冷却的设备上而进行试剂溶液 的逐滴添加。在微芯片lc中，在井43等之内固定的试剂R可为单一类型，或可为具有不同 成分的试剂R1和R2。如果多种试剂R1和R2固定在井43内，可通过将其中一种试剂溶液 逐滴添加到井43内，用真空干燥法等进行固定，随后将下一种试剂溶液逐滴添加到固定的 试剂R1上并干燥，再重复这些步骤而进行试剂溶液的逐滴添加。
[0101] 通过从试剂溶液制备步骤到试剂溶液干燥步骤将试剂溶液保持在低温下，对于试 剂溶液中所含的核酸扩增反应所需的成分，抑制了物质的键合以及酶的活性。因此，抑制了 引物二聚物的出现，减少了核酸非特异性扩增反应。
[0102] 本技术可包括以下方面。
[0103] (1) -种用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，包括：干燥试剂溶液的固化步 骤，试剂溶液包括核酸扩增反应所需的至少一部分物质；以及，将固化的试剂溶液置于井内 的收纳步骤，所述井作为核酸扩增反应的反应场所。
[0104] (2)根据（1)所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，其中，固化步骤包括 试剂溶液的冻干步骤。
[0105] (3)根据（1)或（2)所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，进一步包括准 备具有不同成分的多种试剂溶液的制备步骤，其中，试剂溶液为第一试剂溶液和第二试剂 溶液，第一试剂溶液包括低聚核苷酸引物但不包括酶，第二试剂溶液包括酶但不包括低聚 核苷酸引物。
[0106] (4)根据（3)所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，其中，固化步骤包括 第一试剂溶液和第二试剂溶液的单独冻干步骤。
[0107] (5)根据⑶或⑷所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，其中，收纳步 骤包括在多个所述井的每个井中收纳已经固化并且包括两种或更多种低聚核苷酸引物的 第一试剂溶液的步骤。
[0108] (6)根据（3)所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，进一步包括：在在固 化步骤中固化第一试剂溶液和第二试剂溶液的其中之一并在进行收纳步骤之前，将固化步 骤中不使用的试剂溶液逐滴添加到井中并在井中干燥的固定步骤。
[0109] (7)根据（6)所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，其中，固定步骤包括 试剂溶液的真空干燥步骤。
[0110] 实施例
[0111] 〈实施例1>
[0112] 1.核酸扩增反应中非特异性扩增的检测
[0113] 验证对使用根据本技术的微芯片的核酸扩增反应中核酸链的非特异性扩增的抑 制作用。
[0114] 材料和方法
[0115] 1.微芯片的制造
[0116] 使用其要装的试剂的生产方法不同的四种类型的微芯片作为本实施例中使用的 微芯片。对于所有四种类型的微芯片，基板材料采用PDMS和玻璃。进一步，准备用于甲型 流感病毒扩增的四种类型的引物、Bst DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲溶液，作为本实施例中 进行的核酸扩增反应所需的试剂。下文将对每种微芯片从试剂溶液制备步骤到收纳步骤的 步骤进行说明。
[0117] 〈1> 微芯片 1
[0118] 制造了微芯片1(下文称为"Ml"），作为根据本技术的用于核酸扩增反应的微芯片 的比较例。在Ml的制造过程中，制备了包括四种类型的引物、Bst DNA聚合酶、dNTPs和反 应缓冲溶液的试剂溶液。将1. 2 μ L的试剂溶液逐滴添加到形成于基板层内的井中，通过约 2小时的真空干燥处理（约1，OOOPa)将井内的试剂溶液固定。
[0119] 〈2> 微芯片 2
[0120] 微芯片2(下文称为"M2"）为井中含有固化试剂的微芯片。在M2的制造过程中， 通过将固化容器放置在冰上而在冷却状态下制备包括四种类型的引物、Bst DNA聚合酶、 dNTPs和反应缓冲溶液的试剂溶液。通过将含有1. 2 μ L试剂溶液的固化容器在-40°C下放 置6个小时，对试剂溶液进行冷冻。试剂溶液冻结之后，将固化容器置于冻干机（FDU-2200， EYELA)内。将试剂溶液保持在冷冻状态下，对试剂溶液真空（约6至8Pa)干燥12个小时 以上。随后，将干燥室的温度设为30°C，将试剂溶液进一步干燥6个小时以上。将以冻干方 式固化的试剂从固化容器中取出，置于形成于基板层内的井中。
[0121] 〈3> 微芯片 3
[0122] 微芯片3(下文称为"M3"）为井中含有包含不同物质的多种固化试剂的微芯片。 在M3的制造过程中，在冷却状态下制备了包括四种类型的引物、Bst DNA聚合酶、dNTPs和 反应缓冲溶液的核酸扩增反应所需成分中的引物（在下文中称为"FluA"）的试剂溶液。进 一步，在冷却状态下制备了包括Bst DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲溶液（下文称为"RM"） 的试剂溶液。将制备的试剂溶液逐滴添加（FluA为0. 4 μ L，RM为0. 8 μ L)到单独的固化容 器中。以与M2相同的方式通过冻干法对固化容器中的各种试剂溶液进行固化。将固化的 FluA和RM从固化容器中取出，置于形成于基板层内的每个井中，使每个井中都含有FluA和 RM。
[0123] 〈4> 微芯片 4
[0124] 微芯片4(下文称为"M4"）为通过多次在井中固定含有不同成分的试剂的微芯 片。在M4的制造过程中，以与M2相同的方式制备试剂溶液FluA和试剂溶液RM。将0.4yL 的FluA逐滴添加到井中，并以与Ml相同的方式通过真空干燥法固定在井中。将井中固定 有FluA的基板层冷却并保持在低温下，并在该状态下，将0. 8 μ L的RM逐滴添加到固定有 FluA的井中。再次以与Ml相同的方式进行真空干燥，以将RM固定在井中。
[0125] 将以上四种类型的微芯片的井中含有试剂或固定有试剂的基板层层压在另一个 基板层上，以将井密封。对每个基板层的表面进行氧等离子照射处理（〇 2:l〇cc，RF输出： 100W，RF照射时间：30秒），并在真空下粘合，以完成微芯片Ml至M4。
[0126] 2.核酸扩增反应
[0127] 使用通过上述步骤制造的微芯片Ml至M4进行核酸扩增反应。核酸扩增采用LAMP 法。将样品溶液收纳到Ml至M4,在63°C下进行核酸扩增反应。对于样品溶液，使用甲型流 感病毒阳性标本（阳性对照，下文称为"PC"）、甲型流感病毒阴性标本（阴性对照，下文称 为"NC"）、和水（无模板对照，下文称为"NTC"）。通过荧光检测法进行核酸链的检测，检测 试剂采用SYBR Green。
[0128] 结果
[0129] 本实施例的结果如图8所示。图8显示了每个微芯片Ml至M4中每种样品溶液的 核酸扩增的开始。核酸扩增的开始时间定义为由SYBR Green获取的表示荧光强度的扩增 曲线上升并达到预定阈值的时间。应注意的是，图8中的ΜΓ为用与Ml相同的制造步骤制 造的微芯片，其以与Ml相同的方式用于核酸扩增反应。
[0130] 根据核酸扩增反应的结果，对于微芯片Ml至M4 (对于Ml，请参见ΜΓ )，在导入了 PC的井中检测到了核酸扩增。即，结果显示，井中所含的试剂在可用于核酸扩增反应的状态 下存储。另一方面，对于导入了 NC和NTC的微芯片Ml至M4,也观察到核酸扩增。这表明 微芯片Ml至M4的井中发生了核酸链的非特异性扩增。在本实施例中进行的核酸扩增反应 中，在开始核酸扩增反应后的30分钟内检测到了核酸的模板核酸链的特异性扩增反应（图 8)。因此，导入了 NC和NTC的井（不应发生核酸扩增）内开始反应后的30分钟之内发生 的核酸扩增削弱了使用微芯片的分析。
[0131] 如图8所示，M3中非特异性核酸扩增的开始是在核酸扩增反应开始50分钟之后。 另一方面，在比较例Ml中，在反应开始约20分钟之后检测到了非特异性核酸扩增的开始。 该结果表明，使用M3的核酸扩增反应中抑制了非特异性核酸扩增。
[0132] 在某些井中，M2和M4中的非特异性核酸扩增在已经经过约在30分钟之后开始。 与M3的结果相比，在M2和M4的结果中，非特异性核酸扩增的开始时间较早。但是，不认为 在开始核酸扩增反应后的30分钟内，对于NTC和NC发生了非特异性核酸扩增。该结果表 明，在M2和M4中，非特异性核酸扩增受到的抑制大于Ml (比较例）。进一步，非特异性核酸 扩增的抑制效果在M2和M4中大致相同。
[0133] 根据本实施例的结果，使用含有包括核酸扩增反应所需的物质的试剂的微芯片进 行的核酸扩增反应中的非特异性核酸扩增反应的抑制效果得以确定。特别地，对于包括引 物但不包括酶的试剂溶液和包括酶但不包括引物的试剂溶液个别地（单独地）固化并密封 在井内的微芯片（M3)，非特异性核酸扩增很大程度上受到了抑制。即，使用基于根据本技术 的微芯片制造方法制造的微芯片，减少了非特异性核酸扩增反应，提高了分析精度。
[0134] 进一步，即使在含有包括酶和引物的固相试剂的微芯片（M2)和通过将包括酶的 试剂溶液逐滴添加到已固定有包括引物的试剂的井中而制造的微芯片（M4)中，也观测到 了对非特异性核酸扩增的抑制效果。这表明，使用在微芯片制造步骤中将冷却的酶和引物 混合之后干燥的试剂的核酸扩增反应中抑制了非特异性核酸扩增反应。基于上述结果，证 实了，根据本技术的微芯片核酸扩增反应不仅能通过导入样品溶液等而使分析变得简单， 而且，由于抑制了非特异性核酸扩增反应，实现了高精度分析。
[0135] 工业适用性
[0136] 通过根据本技术的用于核酸扩增反应的微芯片，可简单准确地进行基于核酸扩增 的分析。因此，根据本技术的用于核酸扩增反应的微芯片可用作进行临床基因分型和传染 病确定中的核酸扩增的装置。
[0137] 参考符号列表
[0138] R，R1，R2 试剂
[0139] la，la_2, lb，lc 微芯片
[0140] 11，12,13 基板层
[0141] 2 导入部分
[0142] 31，32, 33, 34, 35 通道
[0143] 41，42,43,44,45 井
【权利要求】
1. 一种用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，所述方法包括： 干燥试剂溶液的固化步骤，所述试剂溶液包括核酸扩增反应所需的至少一部分物质； 以及 将固化的试剂溶液置于井内的收纳步骤，所述井用作核酸扩增反应的反应场所。
2. 根据权利要求1所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，其中，所述固化步 骤包括冻干所述试剂溶液的步骤。
3. 根据权利要求2所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，所述方法包括： 在所述固化步骤之前准备具有不同成分的多种所述试剂溶液的制备步骤， 其中，所述试剂溶液包括第一试剂溶液和第二试剂溶液，所述第一试剂溶液包括低聚 核苷酸引物但不包括酶，所述第二试剂溶液包括酶但不包括低聚核苷酸引物。
4. 根据权利要求3所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，其中，所述固化步 骤包括个别地冻干所述第一试剂溶液和所述第二试剂溶液的步骤。
5. 根据权利要求4所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，其中，所述收纳步 骤包括在多个所述井的每个井中收纳已经固化并且包括两种或更多种低聚核苷酸引物的 第一试剂溶液的步骤。
6. 根据权利要求3所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，所述方法包括： 在所述固化步骤中固化所述第一试剂溶液和所述第二试剂溶液中的任意一个；以及， 在所述收纳步骤之前将所述固化步骤中不用的试剂溶液逐滴添加到所述井中并在所述井 中干燥的固定步骤。
7. 根据权利要求6所述的用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法，其中，所述固定步 骤包括真空干燥所述试剂溶液的步骤。
【文档编号】C12M1/00GK104160011SQ201380012088
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年1月16日 优先权日:2012年3月8日
【发明者】松本真宽, 佐藤正树, 渡边英俊 申请人:索尼公司