A型流感病毒的检测试剂盒的制作方法

A型流感病毒的检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种A型流感病毒的检测试剂盒，其为应用了免疫层析法原理的用于迅速诊断流感的检测试剂盒，其中，A型流感病毒的检测灵敏度比现有的检测试剂盒高，可在流感发病的更早期，稳定且高精度地得到“阳性”的判定。本发明涉及一种用于检测A型流感病毒的试剂盒，其中，层析介质中所固定的抗体为与未变性的A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应、而与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所分离的全长的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体。
【专利说明】A型流感病毒的检测试剂盒

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测A型流感病毒的利用免疫层析法的检测试剂盒，其使用 了与A型流感病毒核蛋白有特异性抗原抗体反应，但是与由SDS (十二烷基硫酸钠）-聚丙 烯酰胺凝胶电泳分离出的全长的A型流感病毒核蛋白在Western Blot法中没有抗原抗体 反应的抗体。

【背景技术】
[0002] 流感为流感病毒导致的感染症，作为其典型的症状，已知有突然出现发烧?头 痛?全身倦怠感?肌肉关节痛等，随之而来并持续有咳嗽·鼻涕等，一般认为这些症状在约 1周后减轻。与其它的所谓的感冒综合征相比，流感的特征在于全身症状强，而为了进行正 确的诊断需要病毒学上的根据。在流感流行的时期，对具有感冒症状的患者进行是否为流 感的正确诊断，不仅与用于治疗的抗流感病毒剂的适当选择有紧密联系，而且从准确地把 握流行状况和判定流感疫苗的效果这样的免疫学观点考虑也很重要。
[0003] 为了正确地进行流感的病原诊断，标准方法为以咽拭子液和漱口液为材料分离病 毒，但直至诊断需要长的时间。若使用PCR(Polymerase chain reaction)法检测病毒基因 组，则虽然可以在短时间得到精确度高的结果，但PCR法需要特别的装置，若不是卫生研究 所和特定的检查室的话则无法进行。
[0004] 近年来，开始市售可在床边或门诊等检测流感抗原的迅速诊断试剂盒，可在日常 的临床中容易地进行病毒学诊断。应用了免疫层析法原理的流感的迅速诊断试剂盒（参照 专利文献1?11)使用可容易采集的鼻腔粘膜或咽部粘膜等生物样品，能够以简便的操作 在短时间内得到检查结果，因此，具有接受检查的患者和实施检查的医疗工作者两者的负 担都轻这样的优点。另外，在得到"阳性"的结果的情况下，可以提供用于医生做出正确诊 断的有益的信息。然而，目前市售的迅速诊断试剂盒的流感病毒的检测灵敏度不足，即使得 至IJ "阴性"的结果也未必能否定病毒的感染。
[0005] 已知的是，由流感患者的鼻腔粘膜或咽部粘膜检测的流感病毒的量，在发病后 2?3天达到最高，然后迅速地减少，并在5?7天消失。为了用迅速诊断试剂盒判定为"阳 性"，需要感染后流感病毒在生物体内增殖，使生物样品中的病毒量达到检测灵敏度以上。 在病毒的增殖开始后不久的感染初期的患者和通过接种疫苗抑制了病毒的增殖速度的患 者等中，有时生物样品中不存在判定为阳性所需充分的量的病毒，实际上尽管感染了流感 病毒，但是迅速诊断试剂盒的结果为"阴性"，有假阴性判定的问题。在临床现场，利用迅速 诊断试剂盒进行检查，若发病后经过24小时，则可稳定地检测病毒而得到精度高的结果， 但是在发病后12小时以内，有时无法检测到病毒而无法正确地判定，从这样的实际情况考 虑，对于是"阴性"结果的患者，根据其它的发现，在次日以后实施再检查，患者必须再次到 医疗机构就诊，承受在时间和费用方面的过度的负担。
[0006] 进而，从用于治疗的抗流感病毒剂的选择的观点考虑，也要求在感染尽量早的时 期正确地诊断流感。目前，作为流感治疗药的代表性药物，广泛使用磷酸奥司他韦（商品名 达菲）及扎那米韦（商品名瑞乐砂）等神经氨酸酶抑制剂。神经氨酸酶在流感病毒在体内 从细胞到细胞的感染?传播时承担重要的作用，神经氨酸酶抑制剂通过抑制神经氨酸酶的 活性来抑制在细胞内增殖的流感病毒流出细胞外，抑制病毒在细胞间的传播，从而发挥治 疗效果。据认为如上所述的由神经氨酸酶抑制剂构成的抗流感病毒剂在发病后尽量早的时 期服用是有效的。一般认为流感发病后12小时以内服用是理想的，在24小时以内服用能 得到充分的有效性，但是发病后若超过48小时，则治疗效果不足。但是，要求从早期开始利 用抗流感病毒剂进行治疗，另一方面，已知神经氨酸酶抑制剂也有副作用，另外，也存在着 应该恰当地使用抗流感病毒剂以备流感的爆发性流行这样的社会需求等方面的考虑，因此 要求在正确诊断流感病毒感染下开出抗流感病毒剂的处方。因此，强烈要求临床现场中广 泛使用的流感迅速诊断试剂盒具有进一步提高流感病毒的检测灵敏度，从发病的尽量早的 时期，特别是即使在发病后24小时以内，也可稳定且高精度地得到"阳性"的判定这样的性 能。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1 :日本特开2011-069800号公报
[0010] 专利文献2 :日本特开2010-261912号公报
[0011] 专利文献3 :日本特开2007-093292号公报
[0012] 专利文献4 :日本特开2007-033293号公报
[0013] 专利文献5 :日本特开2006-194688号公报
[0014] 专利文献6 :日本特开2006-194687号公报
[0015] 专利文献7 :日本特开2006-189317号公报
[0016] 专利文献8 :日本特开2006-067979号公报
[0017] 专利文献9 :W02009/148150号小册子
[0018] 专利文献10 :W02005/007697号小册子
[0019] 专利文献11 :W02005/007698号小册子


【发明内容】

[0020] 发明所要解决的问题
[0021] 本发明的目的在于提供一种A型流感病毒的检测试剂盒，其为应用了免疫层析法 原理的用于流感的迅速诊断的检测试剂盒，其中，A型流感病毒的检测灵敏度比现有的检测 试剂盒高，可在流感发病的更早期，稳定且高精确度地得到"阳性"的判定。
[0022] 用于解决问题的方法
[0023] 本发明人为了提高应用了免疫层析法原理的流感迅速诊断试剂盒的检测灵敏度， 对于在层析介质中固定的抗体以及与标记物结合的抗体当中，应该使用对A型流感病毒核 蛋白具有优异亲和性的抗体，而进行了潜心研究。本发明人考虑到检测试剂盒在临床上使 用，从检测用的生物样品采集后并不能说A型流感病毒核蛋白完全没有发生变性的可能 性、以及具有想尽可能地明确检测试剂盒中所使用的抗体的特征的要求等方面出发，作为 检测试剂盒中所使用的抗体，寻求不仅对未变性的A型流感病毒核蛋白具有优异亲和性、 而且对变性的（例如）由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（以下也称为SDS-PAGE)分离的A型 流感病毒核蛋白也具有同样高的亲和性的抗体，并尝试在检测试剂盒中使用。其原因在于， 对由SDS-PAGE分离的A型流感病毒核蛋白也显示出高亲和性的抗体具有其结合能力对核 蛋白的立体结构变化的影响少，而且，也容易明确抗体所识别的表位区域这样的优点。然 而，即使在使用了具有这样的反应性的抗体的情况下，超过现有制品的检测灵敏度也非常 困难。
[0024] 因此，本发明人为了开发超过现有制品的检测灵敏度的优异的检测试剂盒，进一 步进行了潜心研究，结果惊讶地发现，作为层析介质中所固定的抗体，若使用虽然对未变性 的A型流感病毒核蛋白具有优异的亲和性、但是与由SDS-PAGE分离的全长的A型流感病毒 核蛋白在Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体，则可以飞跃性地提高A型流感病毒 检测试剂盒的检测灵敏度。
[0025] 即，本发明涉及一种用于检测A型流感病毒的试剂盒，其为应用了免疫层析法原 理的检测试剂盒，其中，层析介质中所固定的抗体为与未变性的A型流感病毒核蛋白有抗 原抗体反应，但是与由SDS-PAGE分离的全长的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中 没有抗原抗体反应的抗体。
[0026] 对本发明更详细地进行说明，如下所示。
[0027] (1) -种用于检测A型流感病毒的试剂盒，其为利用免疫层析法的检测试剂盒， 含有：固定有与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病毒核蛋白实质上没有 抗原抗体反应的第一抗体的层析介质、以及与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B 型流感病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的第二抗体和标记物结合而成的标记试剂，其 中，
[0028] 第一抗体为与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所分离的全长的A型流感病毒核蛋白 在Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体；第二抗体为与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳所分离的全长的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗体反应的抗体。
[0029] (2)如上述（1)记载的检测试剂盒，其中，第一抗体为1种或1种以上的单克隆抗 体。
[0030] (3)如上述⑴或⑵记载的检测试剂盒，其中，第一抗体为通过对A型流感病毒 HlNl亚型的全长的核蛋白进行免疫而得到的抗体。
[0031] (4) 一种A型流感病毒的检测方法，其为利用免疫层析法的检测方法，使用了固定 有与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反 应的第一抗体的层析介质、以及与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病毒 核蛋白实质上没有抗原抗体反应的第二抗体和标记物结合而成的标记试剂，其中，
[0032] 第一抗体为与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所分离的全长的A型流感病毒核蛋白 在Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体；第二抗体为与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳所分离的全长的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗体反应的抗体。
[0033] (5)如上述⑷记载的检测方法，其中，第一抗体为1种或1种以上的单克隆抗体。
[0034] (6)如上述⑷或（5)记载的检测方法，其中，第一抗体为通过对A型流感病毒 HlNl亚型的全长的核蛋白进行免疫而得到的抗体。
[0035] (7) -种A型流感病毒的检测试剂，其含有与未变性的A型流感病毒核蛋白有抗原 抗体反应、而与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的全长的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体。
[0036] (8)如上述（7)记载的检测试剂，其中，A型流感病毒检测试剂用于利用免疫层析 法的检测试剂盒中。
[0037] (9)如上述⑶记载的检测试剂，其中，A型流感病毒检测试剂是在利用免疫层析 法的检测试剂盒的层析介质中固定而使用的。
[0038] (10)如上述（7)?（9)中任意一项记载的检测试剂，其中，A型流感病毒检测试剂 为1种或1种以上的单克隆抗体。
[0039] (11)如上述（7)?（10)中任意一项记载的检测试剂，其中，A型流感病毒检测试 剂为通过对A型流感病毒HlNl亚型的全长的核蛋白进行免疫而得到的抗体。
[0040] 发明效果
[0041] 本发明的A型流感病毒检测试剂盒由于检测灵敏度高，因此比现有的检测试剂盒 少的病毒量就能够得到"阳性"的判定，因此，假阴性的判定减少，对"阴性"的判定的可靠 性变得非常高。因此，对于处于流感发病初期且病毒开始在体内增殖不久的患者，能够提供 医生做出流感病毒感染的正确诊断所需的有益信息，并且可以在早期开始用抗流感病毒剂 的治疗。另外，即使在利用接种疫苗来抑制病毒增殖速度的患者中，也可以正确地诊断有无 流感病毒的感染，因此，能够引起对感染扩大的注意，另外，也能够提供用于判定流感疫苗 效果的免疫学上重要的信息。
[0042] 另外，本发明提供了一种A型流感病毒的检测试剂，通过使用本发明的A型流感病 毒检测试剂，特别是将本发明的A型流感病毒检测试剂用作利用免疫层析法的检测试剂盒 中的层析介质中所固定的抗体，可以简便且更正确地诊断。

【专利附图】

【附图说明】
[0043] 图1表示抗体1C6、6F7或10G5与A型流感病毒的重组核蛋白（56kDa)的Western blot法的反应结果。图中上部的M表示分子量标记物流过的泳道，rNP表示重组核蛋白流 过的泳道。（a)表示使转印有由SDS-PAGE分离的全长的重组核蛋白的PVDF膜与抗体7307 反应的结果。在分子量50?75kDa的范围内检测到色带。在能够确认抗体7307与重组核 蛋白的抗原抗体反应的条件下，对抗体1C6、6F7或10G5与重组核蛋白的反应性进行试验。 (b)表不抗体1C6的结果。（c)表不抗体6F7的结果。（d)表不抗体10G5的结果。在能够 确认抗体7307的反应性的条件下，无法检测到抗体1C6、6F7或10G5与重组核蛋白的反应。

【具体实施方式】
[0044] 本发明提供一种检测试剂盒，其为利用免疫层析法的A型流感病毒的检测试剂 盒，使用了与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病毒核蛋白实质上没有抗 原抗体反应的第一抗体和第二抗体，其特征在于，层析介质中所固定的第一抗体使用了与 未变性的A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应、而与由SDS-PAGE所分离的全长的A型流感 病毒核蛋白在Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体。
[0045] 本发明中使用的第一抗体和第二抗体为与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应 而与B型流感病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的抗体。流感病毒由于核蛋白的抗原性 的不同而分为A型、B型等。进而，A型流感病毒在病毒粒子的表面具有血凝素（HA)和神经 氨酸酶（NA)这样的糖蛋白，并且由于这些HA和NA的结构差异而分为各种亚型。本发明中 所使用的第一抗体和第二抗体由于识别流感病毒的核蛋白，因此可以与A型流感病毒的各 种亚型的核蛋白广泛地发生抗原抗体反应，至少可以与A型流感病毒的HlNl亚型、H3N2亚 型、H5N1亚型以及H7N7亚型等的核蛋白发生抗原抗体反应，但是是与B型流感病毒的核蛋 白没有抗原抗体反应的抗体。与本发明的第一抗体和第二抗体发生抗原抗体反应的A型流 感病毒的核蛋白可以是从病毒中分离的天然蛋白，也可以是基于公知的核蛋白基因的碱基 序列制作的重组蛋白。进而，与本发明的第一抗体和第二抗体发生抗原抗体反应的核蛋白 可以是从病毒的构成成分中分离纯化的，也可以是未纯化的，但是在未分离的情况下，也可 以是源自用表面活性剂以核蛋白和抗体容易接触的方式处理过的病毒的核蛋白。
[0046] 本发明中的"未变性的A型流感病毒核蛋白"，只要残留有天然存在的A型流感病 毒核蛋白的立体结构中的、至少维持与特定的抗体发生抗原抗体反应的充分的立体结构即 可，但是因 SDS-PAGE等破坏了天然存在的该蛋白的立体结构、无法维持A型流感病毒核蛋 白对该抗体的实质上的抗原抗体反应的除外。
[0047] 本发明中所使用的第一抗体和第二抗体与流感病毒核蛋白是否发生抗原抗体反 应可以利用周知的免疫测定方法来进行确认。即，若以测定形式来分类，则有三明治法、竞 争法、凝聚法等免疫测定方法，若以使用的标记物来分类，则有荧光法、酶法、放射法等免疫 测定方法，利用这些免疫测定方法中的任意一者均可以进行抗原抗体反应的确认。在本发 明中，"实质上没有抗原抗体反应"是指，在上述免疫测定方法中，在可检测的水平上没有抗 原抗体反应、或者即使有反应该反应的程度与A型流感病毒核蛋白的抗原抗体反应的程度 相比明显较弱，与构成流感病毒的其它蛋白为同一程度的反应，不是特异性反应。
[0048] 作为本发明的第一抗体，是与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感 病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的抗体，进而，只要是与天然存在的A型流感病毒核 蛋白的发生抗原抗体反应的部位的立体结构被破坏了的该蛋白实质上没有抗原抗体反应 的抗体即可，作为这样的抗体，例如，优选为与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B 型流感病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的抗体，与由SDS-PAGE分离的全长的A型流感 病毒核蛋白在Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体。
[0049] 本发明中的"SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳"是本发明所属【技术领域】中惯用的蛋白分 离·分析法，代表性地可以按照Laemmli，U.K.的方法（Nature, 227:680-685 (1970))来进 行，但并不局限于该方法。具体而言，例如可以按以下的步骤实施。首先，在凝胶板上层叠由 10?15%浓度的聚丙烯酰胺构成的分离凝胶、在其上层叠由3?5%聚丙烯酰胺构成的浓 缩凝胶，将制成的凝胶安装于平板电泳装置中。在含有A型流感病毒核蛋白的溶液中添加 等量的2倍浓缩样品缓冲液（I25mM Tris-HCl、20%甘油、2% SDS、2% 2-巯基乙醇、0. 001 % 溴酚蓝、pH6. 8)，在100°C下加热处理5?10分钟，作为电泳用样品。将电泳用样品和市售 的分子量标记物分别添加到由浓缩凝胶所制作的泳道中，使用电泳用缓冲剂（192mM甘氨 酸、0. 1% SDS、24mM Tris、pH8. 3)，以20mA的恒定电流进行30?90分钟电泳。由SDS-PAGE 分离的全长的A型流感病毒核蛋白可以以相当于分离凝胶中的分子量约56kDa的色带的形 式得到。
[0050] SDS-PAGE中使用的含有A型流感病毒核蛋白的溶液，只要在最终进行的Western blot法中，含有与抗体进行抗原抗体反应所需的充分量（例如1?2mg)的A型流感病毒核 蛋白即可，不对其限定，但是关于核蛋白，可以纯化也可以未纯化。作为含有A型流感病毒 核蛋白的溶液，例如可以举出：A型流感病毒悬浮液、市售的HA流感疫苗和重组A型流感病 毒核蛋白溶液等。
[0051] SDS-PAGE中使用的2倍浓缩样品缓冲剂中的SDS，考虑到SDS的结合量相对于1 个蛋白为1. 2?1. 5左右，可根据A型流感病毒核蛋白的量在0. 5?5重量％的浓度范围 内适当变更使用。另外，2倍浓缩样品缓冲剂中的2-巯基乙醇作为切断存在于A型流感病 毒核蛋白中的二硫键的还原剂起作用，可以在1?10重量％的浓度范围适当变更使用，也 可以使用由二硫苏糖醇（DTT)等其它物质构成的还原剂。
[0052] 本发明中的"Western blot法"可以通过将由SDS-PAGE分离的全长 的A型流感病毒核蛋白按照（例如）Towbin H.等的方法（?1*〇(：.似1:1.六〇3(1.5(^· U.S.A.，76:4350-4354(1979))转印至聚偏二氟乙烯（PVDF)膜上来进行，但并不局限于该 方法。具体而言，将PVDF膜浸渍于100%甲醇中10秒，进一步浸渍于转印用电极缓冲剂 (192mM甘氨酸、5%甲醇、25mM Tris-HCl、pH8. 3)中30分钟，用于转印。转印装置的组装 通过在阳极电极板上从下面起依次层叠滤纸、PVDF膜、SDS-PAGE结束后的凝胶、滤纸，并 在其上固定阴极电极板来进行。需要说明的是，滤纸预先浸渍于转印用电极缓冲剂中2? 3分钟。转印以I. 9mA/cm2的恒定电流进行60?90分钟。转印结束后的PVDF膜，在封闭 溶液（0.5% BSAUOmM Tris-HCl、140mM NaCl、0.01%Tween20、pH7.5)中，在室温下培养 60分钟，进行封闭操作。封闭结束后，用清洗缓冲剂（IOmM Tris-HCl、140mM NaCl、0. 01% Tween20、pH7. 5)在5分钟内培养2次并清洗，使用上述抗A型流感病毒核蛋白抗体作为一 次抗体，在室温下培养90分钟使其反应。与一次抗体反应结束后，用清洗缓冲剂在5分钟 内培养2次并清洗，使用以（例如）酶、荧光物质或放射性同位素等标记物所标记的、与一 次抗体发生特异性反应的抗体作为二次抗体，在室温下培养60分钟使其反应。与二次抗体 反应结束后，用清洗缓冲剂在5分钟内培养2次并清洗，然后利用标记物的性质将PVDF膜 上所转印的与A型流感病毒核蛋白结合的一次抗体可视化，由此进行Western blot法的检 测。
[0053] 本发明的第一抗体是与由SDS-PAGE分离的全长的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体。在此，在Western blot法中没有抗原抗体反应是指： 在标准的Western blot法的抗体浓度、抗原浓度、基质浓度或反应时间等条件下，在可检测 的水平上没有抗原抗体反应，或者也与A型流感病毒核蛋白以外的蛋白结合而不是仅与A 型流感病毒核蛋白有特异性抗原抗体反应。本发明的第一抗体与由SDS-PAGE分离的全长 的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中没有抗原抗体反应的确认，例如，可以将以下 作为一个标准来进行：将在Western blot法中已确认与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反 应的市售抗体，例如抗A型流感病毒单克隆抗体、商品编号7307 (Medix Biochemica公司制 造），用作阳性对照抗体，阳性对照抗体与PVDF膜上的A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反 应，并且在能检测到核蛋白的条件下，无法检测到A型流感病毒核蛋白。作为本发明的第一 抗体，优选的是，在Western blot法中，在与阳性对照抗体能够检测到A型流感病毒核蛋白 的抗体浓度相同的抗体浓度下与A型流感病毒核蛋白没有抗原抗体反应的抗体，更优选为 2倍的抗体浓度下与A型流感病毒核蛋白没有反应的抗体，进一步优选为5倍或10倍的抗 体浓度下与A型流感病毒核蛋白没有抗原抗体反应的抗体。另外，作为本发明的第一抗体 优选的抗体为在Western blot法中，与阳性对照抗体能够检测到的A型流感病毒核蛋白的 抗原浓度相同浓度的A型流感病毒核蛋白没有抗原抗体反应的抗体，更优选为在2倍的抗 原浓度下没有反应的抗体，进一步优选为与5倍或10倍浓度的A型流感病毒核蛋白抗原没 有抗原抗体反应的抗体。
[0054] 本发明中所使用的第一抗体可以通过将A型流感病毒核蛋白用作免疫原，对小 鼠、大鼠、豚鼠、狗、山羊、绵羊、猪、马和牛等动物给药来制作。作为用作免疫原的A型流感 病毒核蛋白，只要核蛋白大量存在且可发挥其作为免疫原的作用就没有特别限定，例如可 以使用A型流感病毒悬浮液、市售的HA流感疫苗和重组A型流感病毒核蛋白溶液等。为了 抑制抗原中所含的高免疫原性的HA和NA的作用，也可以使用进行了利用超离心的核蛋白 纯化（例如参照J. Biochem.，102:1241-1249(1987))或蛋白酶处理（例如参照了.1臟1111〇1· Methods，180:107-116 (1995))的免疫原。本发明的第一抗体是虽然与A型流感病毒核蛋白 有特异性抗原抗体反应、而与由SDS-PAGE分离的全长的A型流感病毒核蛋白实质上没有抗 原抗体反应的抗体，因此，作为免疫原，优选未用含有还原剂的SDS-PAGE用样品缓冲剂处 理的A型流感病毒核蛋白，更优选为未用作为阴离子性表面活性剂的SDS处理的A型流感 病毒核蛋白，进一步优选为未变性的A型流感病毒核蛋白。作为本发明的第一抗体的免疫 原优选的是，将A型流感病毒悬浮在不含有阴离子性表面活性剂的缓冲剂中而得到的免疫 原、或全长的重组A型流感病毒核蛋白等。
[0055] 在本发明中所使用的第一抗体为多克隆抗体的情况下，例如可以如下制备。从上 述的A型流感病毒核蛋白免疫了的动物中，由（例如）利用使用了结合有A型流感病毒核 蛋白的载体的亲和层析法的纯化等方法，来获得与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而 与B型流感病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的抗血清或抗血清中的免疫球蛋白级分。 通过将这些抗血清或免疫球蛋白级分与转印在PVDF膜上的由SDS-PAGE分离的全长的A型 流感病毒核蛋白一同培养，使与由SDS-PAGE分离的全长的A型流感病毒核蛋白有抗原抗体 反应的抗体结合在PVDF膜上，并从抗血清或免疫球蛋白级分中分离·除去这些抗体，从而 制作可以用作本发明第一抗体的多克隆抗体。
[0056] 在本发明中所使用的第一抗体为1种或1种以上的单克隆抗体的情况下，例如可 以通过从上述的A型流感病毒核蛋白免疫了的动物中采集脾脏细胞等，以公知的方法（例 如，参照Nature，256:495-497 (1975))使其与骨髓瘤细胞等肿瘤细胞发生细胞融合，从而 得到产生本发明中使用的第一抗体的杂交瘤。
[0057] 作为从利用细胞融合得到的杂交瘤中筛选产生本发明中所使用的第一抗体的杂 交瘤的方法，例如可以按照以下的步骤进行。
[0058] 作为一次筛选，在培养上清液中筛选产生与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应 而与B型流感病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的抗体的杂交瘤。
[0059] -次筛选可以通过以经纯化的A型流感病毒核蛋白或重组A型流感病毒核蛋白为 抗原的固相ELISA法来进行。使用微量滴定板、磁性粒子或硝基纤维素膜等使抗原吸附在 作为固相的载体上。使杂交瘤的培养上清液与吸附在固相上的抗原接触，使用由标记物标 记的抗体等检测与固相间接结合的培养上清液中的抗体。作为阴性对照，可以通过将B型 流感病毒核蛋白用于抗原来筛选目标抗体。
[0060] 作为一次筛选的其它方法，在作为固相的载体上直接或间接地固定杂交瘤的培养 上清液中存在的抗体，将A型流感病毒核蛋白作为抗原使其接触。可以通过直接标记抗原 或者在抗原上使用特异性抗体等以间接地标记，来检测与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体 反应的抗体。
[0061] 用于获得本发明抗体的一次筛选也可以用使抗原或抗体固定在固相上的方法中 的任一方法进行，进而，也可以在使用吸附有抗原的固相进行大致的筛选后，使用固定有抗 体的固相进行更严密的筛选。
[0062] 本发明的第一抗体为固定在层析介质上使用的抗体，因此，作为一次筛选的方法， 将存在于杂交瘤的培养上清液中的抗体直接或间接地固定在膜状的固相载体上、并使之接 触A型流感病毒核蛋白的方法与使用第一抗体时的方式类似，是优选的。
[0063] 对由一次筛选得到的与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病 毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的抗体进行二次筛选。在二次筛选中，选择产生与由 SDS-PAGE分离的全长的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中没有抗原抗体反应的抗 体的杂交瘤。如上所述，将由SDS-PAGE分离的全长的A型流感病毒核蛋白转印到PVDF膜 上。使上述PVDF膜与一次筛选中所选择的杂交瘤的培养上清液接触，如上所述进行利用 Western blot法的检测，由此可以筛选产生目标抗体的杂交瘤。
[0064] 如在下述实施例中详述的那样，在一次筛选中所选择的6个与A型流感病毒核蛋 白有特别强的抗原抗体反应的杂交瘤中，作为二次筛选，选择与由SDS-PAGE分离的全长的 A型流感病毒核蛋白在Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体，结果选择了 3个杂交 瘤。将这些杂交瘤产生的单克隆抗体固定在层析介质上，进行A型流感病毒的检测，结果，3 个单克隆抗体均能以超过现有制品的检测灵敏度获得阳性的判定。即，可以选择多个产生 作为本发明第一抗体优选的单克隆抗体的杂交瘤。
[0065] 本发明的第一抗体通常可以通过在细胞培养用的培养基中培养上述的各杂交瘤 并从培养上清液中回收来制备。另外,也可以通过对杂交瘤来源的动物的腹腔内进行给药， 贮存腹水，从该腹水中回收来制备。
[0066] 本发明的第二抗体，只要为与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感 病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的抗体，并且为对A型流感病毒核蛋白的亲和性高的 抗体即可，作为优选的方式，可根据与第一抗体的组合，使用与由SDS-PAGE分离的全长的A 型流感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗体反应的抗体。
[0067] 本发明的第二抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，在单克隆抗体的情 况下，可以是单一种类的抗体，也可以是多种抗体的混合物。另外，在使用单克隆抗体作为 本发明抗体的情况下，也可以用作与Fab或F(ab'）2等抗原有结合性的片段。
[0068] 本发明中所使用的第二抗体可以使用用于制造上述第一抗体的免疫原来制备。在 本发明的第二抗体为多克隆抗体的情况下，可通过从免疫的动物采集血液，并且如上所述 对与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反 应的抗血清或抗血清中的免疫球蛋白级分进行纯化来制造。在本发明的第二抗体为单克隆 抗体的情况下，可以通过以公知的方法制作杂交瘤，如上所述在培养上清液中筛选产生与A 型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的 抗体的杂交瘤来制造。作为本发明的第二抗体，在使用与由SDS-PAGE分离的全长的A型流 感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗体反应的抗体的情况下，以如上所述的步骤进 行利用Western blot法的二次筛选，通过选择检测到抗原抗体反应的抗体，可以筛选目标 抗体。
[0069] 本发明的检测试剂盒含有固定有上述第一抗体的层析介质。在本发明中，层析介 质中所固定的第一抗体形成判定部位。本发明中所使用的层析介质为由显示出毛细现象的 微多孔性物质构成的惰性的层析介质，只要是与标记试剂和生物样品中的成分等没有反应 的物质，其原料就没有特别的限定，可以使用公知的物质。具体而言，可以举出：硝基纤维素 或醋酸纤维素等纤维素衍生物和尼龙的膜、滤纸、玻璃纤维滤纸等。
[0070] 层析介质的形态和大小没有特别限制，从实际操作的方面和结果观察的方面考 虑，只要适当即可。为了使操作更简便，也可以在层析介质的背面设置由塑料等构成的支承 体。该支承体的性状没有特别限制，但是在根据目视判定进行检测结果的观察的情况下，支 承体优选具有与标记物所带来的色彩不类似的色彩，通常优选为无色或白色。
[0071] 可以在层析介质中任意地引入用于添加生物样品的试样添加部位（样品垫等）、 除去试样中的固体成分的部位（固体成分分离部位等）、用于添加展开液的展开液添加部 位、吸取未被判定部位捕捉的标记试剂和展开液的吸收部位（吸收垫等）、显示检测正常进 行的对照部位等。这些部位的部件只要是试样溶液和展开液能够通过毛细现象移动就没有 特别限定，通常，从硝基纤维素膜、滤纸、玻璃纤维滤纸等多种多孔物质中根据其目的来选 择使用，以固定有第一抗体的层析介质与毛细管连接的方式进行配置。
[0072] 作为将第一抗体固定在层析介质上的方法，有：通过物理或化学方法将第一抗体 直接固定在层析介质上的方法；使第一抗体与乳胶颗粒等微粒物理或化学结合，使层析介 质捕捉该微粒并固定的间接固定方法，但从灵敏度调整的容易度的方面考虑，优选直接固 定的方法。作为直接固定的方法，可以利用物理吸附，也可以利用共价键合。通常，在层析介 质为硝基纤维素膜或混合硝基纤维素酯膜的情况下，可以进行物理吸附。在使其共价键合 的情况下，通过溴化氰、戊二醛、碳二亚胺等进行层析介质的活化。对于层析介质和第一抗 体，例如可以用微量注射器、带调节泵的钢笔、喷墨印刷等方法使其吸附或结合。作为判定 部位的形态，没有特别限定，可以以圆形的点、沿层析介质的展开方向垂直延伸的线、数字、 文字、+、-等符号等形态来形成判定部位。
[0073] 根据需要，对固定有第一抗体的层析介质进行封闭处理。作为可以用于封闭处理 的封闭剂，除了牛血清白蛋白、脱脂乳、酪蛋白、明胶等蛋白质以外，还可以举出=Blocking Peptide Fragment(TC)YOBO公司制造）和亲水性高分子聚合物等市售的封闭剂。
[0074] 本发明的检测试剂盒含有标记物与上述第二抗体结合而成的标记试剂。作为本发 明中所使用的标记物，可以使用酶或不溶性载体。作为酶，有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、 β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等，可以与各酶对应的公知的发色基质一同使用。作 为不溶性载体，可以使用金、银、钼之类的胶体状金属颗粒，氧化铁之类的胶体状金属氧化 物颗粒，硫等胶体状非金属颗粒和由合成高分子制成的乳胶颗粒，以及其它载体。对胶体状 金属颗粒和胶体状金属氧化物颗粒而言，例如可以举出：胶体状金颗粒、胶体状银颗粒、胶 体状钼颗粒、胶体状氧化铁颗粒、胶体状氢氧化铝颗粒等。特别优选的是，胶体状金颗粒和 胶体状银颗粒具有适当的粒径，胶体状金颗粒显示出红色、胶体状银颗粒显出示黄色的情 况。这些胶体状金属颗粒的平均粒径为Inm?500nm，特别优选可得到强的色调的IOnm? 150nm，更优选为40nm?IOOnm的范围内。作为本发明的标记试剂中所使用的标记物，优选 不溶性载体，进一步优选胶体状金属颗粒，特别优选胶体状金颗粒。
[0075] 作为胶体状金属颗粒，例如在使用胶体状金颗粒的情况下，可以使用市售的物质。 或者，可以利用常规方法，例如用柠檬酸钠还原氯金酸的方法来制备胶体状金颗粒。
[0076] 作为使本发明中使用的第二抗体与标记物结合的方法，可以利用物理吸附或化学 结合等公知的方法进行。例如，在用胶体状金颗粒标记第二抗体的情况下，通过在金颗粒以 胶体状分散的溶液中加入第二抗体使其物理吸附后，添加牛血清白蛋白溶液或上述的市售 封闭剂等以封闭抗体未结合的颗粒表面来制备。
[0077] 本发明的标记试剂可以作为层析介质以外的其它试剂包含在本发明的试剂盒中， 但是也可以在层析介质上设置标记试剂保持部，使此处保持干燥。在将标记试剂保持在标 记试剂保持部的情况下，优选的是以标记试剂迅速地溶解在展开液中并能通过毛细作用而 自由移动的方式保持标记试剂。对标记试剂保持部而言，为了使标记试剂的再溶解性变得 良好，也可以在标记试剂中添加蔗糖（寸7力^一 7 )、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖等糖类、 甘露醇等糖醇并涂布，或者将这些物质预先涂布。标记试剂保持部的形成也可以通过将标 记试剂直接涂布在层析介质上并干燥来进行，也可以涂布在层析介质以外的其它多孔性物 质（例如纤维素滤纸、玻璃纤维滤纸、尼龙无纺布）上并干燥而形成标记试剂保持部件，然 后以层析介质和上述保持部件通过毛细管连接的方式进行配置。
[0078] 作为可应用于本发明检测试剂盒的生物样品，只要是怀疑含有A型流感病毒的物 质就没有特别限制，作为优选的试样，可以举出：鼻拭子液、鼻腔抽吸液、咽拭子液等。可以 在本发明的试剂盒中直接使用这些生物样品，但通常将试样悬浮或稀释在展开液中使用。
[0079] 作为与本发明的检测试剂盒一同使用的展开液，通常以水为溶剂，优选含有磷酸 盐、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、HEPES、G 〇〇d' s等缓冲剂、氯化钠等无机盐。进而，根据需要， 可以含有牛血清白蛋白（BSA)等蛋白成分、防腐剂等。进而，本发明中所使用的展开液可以 含有非尚子性表面活性剂，以破坏流感病毒的病毒粒子并使本发明的第一抗体和第二抗体 与核蛋白的接触变得容易。作为添加到展开液中的非离子性表面活性剂，例如可以举出：聚 氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯（商品名"Tween"系列）、聚氧乙烯对叔辛基 苯基醚（商品名"Triton"系列）、聚氧乙烯对叔壬基苯基醚（商品名"TritonN"系列）等， 但不限定于这些。这些非离子性表面活性剂的含量没有特别限定，但是可在相对于展开液 总重量为0.01?10.0重量％的范围内使用，优选在0. 1?5.0重量％的范围内使用，更优 选在0. 1?1.0重量％的范围内使用，进一步优选在0.3?1.0重量％的范围内使用。
[0080] 可以使用本发明的检测试剂盒通过（例如）以下的操作来检测A型流感病毒。
[0081] 作为本发明的一个实施方式，预先将从受试者采集的生物样品在展开液中与标记 试剂混合，形成核蛋白和标记试剂的复合物后，使其与层析介质接触。含有核蛋白-标记试 剂复合物的展开液作为移动相在层析介质中移动。当核蛋白-标记试剂复合物移动到层析 介质的判定部位时，固定了的第一抗体将其捕捉，标记试剂间接地与判定部位结合。在标记 物为不溶性载体的情况下，通过目视或光密度计等直接对判定部位中存在的标记试剂进行 发色强度的确认，在标记物为酶的情况下，通过目视或光密度计等对判定部位中存在的标 记试剂与基质作用得到的反应产物进行发色强度的确认，由此可以进行A型流感病毒的检 测或定量。
[0082] 在本发明的另一个实施方式中，使用具有标记试剂保持部的层析介质进行A型流 感病毒的检测。若使生物样品和展开液与层析介质接触，则它们作为移动相在层析介质中 移动，并溶解标记试剂保持部中所保持的标记试剂。移动相中所溶解的标记试剂与试样中 的A型流感病毒核蛋白形成复合物，在层析介质中移动。达到层析介质的判定部位的核蛋 白-标记试剂复合物被判定部位处所固定的第一抗体捕捉，标记试剂间接地与判定部位结 合。可以通过利用目视或光密度计等测定判定部位中存在的标记试剂来进行A型流感病毒 的检测或定量。
[0083] 下面，利用实施例对本发明更具体地进行说明，但本发明并不受这些实施例任何 限定。
[0084] 实施例
[0085] (实施例1)抗A型流感病毒核蛋白抗体的制作
[0086] 免疫原使用基于源自A型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(HlNl)株的核蛋白的氨 基酸序列（DDBJ/GeneBank数据库Accession N〇.V01084)制成的重组核蛋白。在免疫原 中加入等量的弗氏完全佐剂并完全地混合后，以2周间隔对BALB/c小鼠共免疫4次。自 最后的免疫起3天后从免疫过的小鼠中采集脾细胞，使用公知的标准方法，与骨髓瘤细胞 (P3U1)融合以制作杂交瘤。10?15日后，使用杂交瘤的培养上清液对A型流感病毒核蛋 白进行特异性抗体的筛选。
[0087] 作为一次筛选，通过依次进行以下的筛选操作来选择与A型流感病毒核蛋白有抗 原抗体反应而与B型流感病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的抗体。
[0088] 首先，固相使用微量滴定板，抗原使用与免疫原中使用的相同的重组核蛋白，通过 固相ELISA法进行筛选。即，在96孔板（SUMIL0N)的各孔中分别加入100 μ 1的在碳酸缓冲 液中含有10. 〇 μ g/ml重组核蛋白的溶液，在4°C下培养一晚，固定抗原。接着，用含有0. 1 % 的TWeen20(商品名）的PBS(以下称为PBS-Tween)清洗各孔后，加入用PBS稀释了的1% BSA，在4°C下进行封闭一晚。用PBS-Tween清洗后，各加入培养上清液100 μ 1，使之在37°C 下反应1小时。用PBS-Tween充分清洗后，在各孔中加入稀释1000倍的碱性磷酸酶标记抗 小鼠 Igs抗体（Funakosi (株）公司制造），使之在37°C下反应1小时。用PBS-Tween充分 清洗后，在各孔中加入作为基质的对硝基苯基磷酸酯100 μ 1，使之在室温下反应30分钟。 在各孔中分别加入反应停止液1〇〇μ 1，在波长405nm下测定发色水平。使用显示高的发色 的孔所对应的培养上清液，进行进一步的筛选操作。
[0089] 接着，固相使用硝基纤维素膜，抗原使用A型流感病毒，以免疫层析法的测定系统 进行筛选。即，在35mmX 5mm的硝基纤维素膜上涂布培养上清液使其在37°C下干燥1小时， 由此固定抗体而形成判定线。另外，在50mM HEPES缓冲液中混合培养上清液和金胶体溶液， 由此制作抗体敏感金胶体溶液。将A型流感病毒A/New Caledonia/20/99(H1N1)株或作为 阴性对照的B型流感病毒B/Tokio/53/99株悬浮于试样稀释液（20mM磷酸缓冲液（pH7. 4)、 0.3%脱脂乳、0.3%了￥661120、0.151氯化钠）中，加入到96孔板（5通111^)的各孔中。进 而，在各孔中加入上述抗体敏感金胶体溶液，与病毒悬浮液充分混合。在各孔的混合液中， 插入硝基纤维素膜的端部，使含有病毒的混合液展开。在开始展开10分钟后，从混合液中 取出硝基纤维素膜，用免疫层析定量仪（浜松Photonics(株）公司制造）测定判定线上所 捕捉的金胶体的发色强度。在发色强度超过8. OmABS的情况下，判定为阳性。选择在展开A 型流感病毒的情况下，成为阳性，在展开B型流感病毒的情况下，成为阴性的测定系统中所 使用的抗体作为与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病毒核蛋白实质上没 有抗原抗体反应的抗体。
[0090] 针对一次筛选中所选择的抗体，作为二次筛选，通过使用上述的重组核蛋白进行 Western blot法，选择虽然与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应、但与由SDS-PAGE分 离的A型流感病毒核蛋白没有抗原抗体反应的抗体。即，将0.01mg/ml的上述重组核蛋白 溶液与添加有10%的2-巯基乙醇的2XTris-Glycine SDS Sample Buffer(TEFCC)公司制 造）等量混合，在l〇〇°C下加热10分钟，供给至SDS-PAGE。SDS-PAGE使用预制凝胶J5-20% 12well(BI0-RAD公司制造），按照公知的标准方法进行。利用印迹装置（BI0-RAD公司制造） 从电泳后的凝胶中将蛋白转印至Sequi-Blot PVDF Membrane(BK)-RAD公司制造）。用免疫 封闭剂（DS Pharma Laboratories)在室温下封闭转印后的PVDF膜1小时。除去封闭液，用 含有0. 05% TWeen20(商品名）的PBS (以下称为T-PBS)在10分钟内清洗PVDF膜3次后， 与含有一次筛选中所选择的抗体的培养上清液一同在室温下培养1小时。用T-PBS在10分 钟内清洗PVDF膜3次后，与用T-PBS稀释5000倍的碱性磷酸酶标记抗小鼠 IgG (SIGM公司 制造）一同在室温下培养30分钟。用T-PBS在10分钟内清洗3次后，与作为发色基质的 l-Skp? NBT/BCIP (PIERCE公司制造）一同培养PVDF膜，使PVDF膜所结合的抗体可视化。 作为阳性对照，使用市售的抗A型流感病毒单克隆抗体（商品编号7307，Medix Biochemica 公司制造）代替培养上清液，在目视可检测到阳性对照抗体与PVDF膜的结合的条件下，在 无法检测到培养上清液中所含的抗体的结合的情况下，选择该抗体作为与由SDS-PAGE分 离的A型流感病毒核蛋白没有抗原抗体反应的抗体。对产生该抗体的杂交瘤克隆，选择3 个独立的克隆体，分别命名为杂交瘤1C6、6F7和10G5。另外，将杂交瘤1C6、6F7和10G5各 自产生的抗体命名为抗体1C6、6F7和10G5。从3株该杂交瘤中得到的单克隆抗体的亚型均 为 IgGl。
[0091] 将Western blot法中的抗体1C6、6F7和10G5与A型流感病毒的重组核蛋白的反 应示于图1。将抗体的浓度分别调节为1〇μ g/ml，使其与每槽1. 0μ g的重组核蛋白反应。 如图1所示，通过抗体7307检测到相当于全长的A型流感病毒核蛋白的56kDa的色带，但 是若在相同的条件下使用抗体1C6、6F7或10G5则无法检测到色带。进而，使每槽的重组核 蛋白的量增加至5. 0 μ g并再次进行同样的实验，在使用抗体1C6、6F7或10G5的情况下，在 Western blot法中无法确认到可检测的色带（未显示数据）。
[0092] (实施例2)利用免疫层析法的检测试剂盒的制作
[0093] (1)捕捉抗体用稀释液的制作
[0094] 将异丙醇用50mM磷酸缓冲液（pH7. 4)混合稀释以成为5%，制作第一抗体用稀释 液。
[0095] (2)层析介质上的判定部的制作
[0096] 从抗体1C6、6F7和10G5中选择1种抗体或组合2种抗体，用捕捉抗体用稀释液以 总抗体浓度为I. 〇mg/ml的方式进行稀释。使用涂布机（BioDot公司制造）将该抗体溶液 涂布在25X2. 5cm的硝基纤维素膜（Millipore公司制造）上，使其在50°C下干燥5分钟 后，进一步使其在室温下干燥1小时，从而在层析介质上制作判定部。
[0097] (3)标记抗体溶液的制作
[0098] 使用金胶体悬浮液（田中贵金属工业（株）公司制造：平均粒径40nm、金浓度 0. 36mM)作为标记物。仅将抗体7307、或者将抗体7307与抗体1C6、6F7或10G5中的任意 一个组合，用磷酸缓冲液（PH7. 4)稀释使总抗体浓度为0. 05mg/ml。将0. Iml抗体溶液加入 到0. 5ml金胶体悬浮液中，在室温下静置10分钟。接着，加入含有1% BSA的磷酸缓冲液 (pH7. 4)0. lml，进一步在室温下静置10分钟。然后，充分搅拌，以8000Xg进行离心分离15 分钟。除去上清液后，加入含有0. 5 % BSA的磷酸缓冲液（pH7. 4) 2ml。
[0099] (4)利用免疫层析法的检测试剂盒的制作
[0100] 将上述（3)中制作的标记抗体溶液均一地添加到15mmX300mm的玻璃纤维片 (Millipore公司制造）上之后，用真空干燥机使其干燥，制作接合垫^ =欠'一 i 3 > 〃 7 K )。其次,在由垫板（packing sheet)制成的基材上粘合上述（2)中制作的层析介 质，进而，在展开方向的上游依次粘合接合垫以及作为试样添加部的样品垫（Millipore公 司制造：300_X30mm)，在展开方向的下游粘合吸收垫后，裁成5mm宽度以制作利用免疫层 析法的检测试剂盒。每1个试剂盒的吸收垫的大小为26_X5mm，使用的标记抗体溶液中的 金含量为1 μ g。
[0101] (5)展开液的制备
[0102] 以各试剂的浓度：10%了￥661120为1%、0.说硫酸镁为51111、二甲基亚砜为0.95%、 20%葡聚糖硫酸钠（重均分子量：50万）为2%、以及CE510(JSR Corporation制）为2% 的方式加入到超纯水中，混合。进一步加入作为防腐剂的叠氮化钠使其浓度为〇. 05%，混 合，制作展开液。
[0103] (实施例3) A型流感病毒的测定
[0104] 使用上述制作的检测试剂盒，用以下的方法进行与A型流感病毒的反应性试验， 对本发明的检测试剂盒的性能进行试验。
[0105] 从通过使用了 PCR法的感染检查而判定A型流感病毒（H3N2)的感染为阴性的 受试者采集鼻涕。鼻涕的采集通过将吸集器的一根管子插入至受试者的鼻腔的内部，将 另一根管子与抽气泵连接，并将抽气泵设为负压来进行。通过将鼻涕用展开液稀释至20 倍来制备A型流感病毒阴性检测物。在上述阴性检测物中添加失活了的A型流感病毒A/ Panama/2007/99 (H3N2)，作为A型流感病毒阳性检测物。
[0106] 将阳性检测物或阴性检测物分别150 μ 1载于检测试剂盒的样品垫上并使其展 开，10分钟后以目视判定。将在判定部可确认红色线的情况设为" + "，将可确认到更强的红 色线的情况设为"++"，将虽然可确认到红色线但是颜色非常淡的情况设为" ± "，将无法确 认到红色线的情况设为将结果示于表1。
[0107] (比较例1)
[0108] 在上述实施例2的检测试剂盒的制作中，更改涂布于层析介质上的判定部处的抗 体以及与金胶体结合的抗体，除此以外，通过与实施例3同样的操作进行阳性检测物和阴 性检测物的测定。
[0109] 作为涂布于层析介质上的判定部处的抗体，使用抗体7307、抗体1C6或它们的组 合来代替抗体1C6、6F7和10G5中的任意一者或者它们的组合。
[0110] 作为与金胶体结合的标记抗体，使用抗体6F7和10G5来代替抗体7307。
[0111] 将结果示于表1。
[0112] (比较例2)
[0113] 使用利用免疫层析法的市售的A型流感病毒检测试剂盒、ImmunoAce Flu(商品 名）（（株）TAUNS公司制造），通过与实施例3同样的操作进行阳性检测物和阴性检测物的 测定。
[0114] 将结果示于表1。
[0115] [表 1]

【权利要求】
1. 一种用于检测A型流感病毒的试剂盒，其为利用免疫层析法的检测试剂盒，含有：固 定有与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病毒核蛋白实质上没有抗原抗体 反应的第一抗体的层析介质、以及与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病 毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的第二抗体和标记物结合而成的标记试剂，其中， 第一抗体为与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所分离的全长的A型流感病毒核蛋白在 Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体，第二抗体为与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 所分离的全长的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗体反应的抗体。
2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其中，第一抗体为1种或1种以上的单克隆抗 体。
3. 根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其中，第一抗体为通过对A型流感病毒H1N1 亚型的全长的核蛋白进行免疫而得到的抗体。
4. 一种A型流感病毒的检测方法，其为利用免疫层析法的检测方法，使用了固定有与 A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病毒核蛋白实质上没有抗原抗体反应的 第一抗体的层析介质、以及与A型流感病毒核蛋白有抗原抗体反应而与B型流感病毒核蛋 白实质上没有抗原抗体反应的第二抗体和标记物结合而成的标记试剂，其中， 第一抗体为与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所分离的全长的A型流感病毒核蛋白在 Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体，第二抗体为与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 所分离的全长的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗体反应的抗体。
5. 根据权利要求4所述的检测方法，其中，第一抗体为1种或1种以上的单克隆抗体。
6. 根据权利要求4或5所述的检测方法，其中，第一抗体为通过对A型流感病毒H1N1 亚型的全长的核蛋白进行免疫而得到的抗体。
7. -种A型流感病毒的检测试剂，含有：与未变性的A型流感病毒核蛋白有抗原抗体 反应、而与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所分离的全长的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中没有抗原抗体反应的抗体。
8. 根据权利要求7所述的检测试剂，其中，A型流感病毒检测试剂用于利用免疫层析法 的检测试剂盒中。
9. 根据权利要求8所述的检测试剂，其中，A型流感病毒检测试剂是固定在利用免疫层 析法的检测试剂盒的层析介质中而使用的。
10. 根据权利要求7?9中任意一项所述的检测试剂，其中，A型流感病毒检测试剂为 1种或1种以上的单克隆抗体。
11. 根据权利要求7?10中任意一项所述的检测试剂，其中，A型流感病毒检测试剂为 通过对A型流感病毒H1N1亚型的全长的核蛋白进行免疫而得到的抗体。
【文档编号】C12Q1/70GK104246504SQ201380017930
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年3月29日 优先权日:2012年3月30日
【发明者】岩本久彦, 川本浩子, 加藤伸一 申请人:田中贵金属工业株式会社