多路生化测定中信号的编码和解码的制作方法

多路生化测定中信号的编码和解码的制作方法
【专利摘要】本公开提供了用于样品中的多个分析物的多路检测的方法、系统、组合物、和试剂盒。在一些实例中，本公开提供了方法、系统、组合物、和试剂盒，其中，可在单个样品体积中通过获得信号的至少一个可计量的分量的累积测量或多个累积测量来检测多个分析物。在一些情况下，信号的额外分量、或额外的信号(或其分量)也被定量。每个信号或信号的每个分量可被用于构建编码方案，然后所述编码方案可用于确定任何分析物的存在或不存在。
【专利说明】多路生化测定中信号的编码和解码
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求2012年2月3日提交的美国临时申请61/594,480,及2012年9月19 日提交的美国临时申请61/703, 093的利益，其各自通过引用其全文并入本文。
[0003] 背景
[0004] 相比传统的单路反应，多路反应提供了显著的优点，包括在相同样品上执行并行 的多个反应，使用相同的室执行更多个反应，以及以快速且有效的方式从样品中提取丰富 信息的能力。然而，为了实现这些优点，多路测定通常需要复杂的报告机制，即光谱上可分 辨的荧光或化学发光（例如，PCR、ELISA)、空间上可分辨的信号（例如，微阵列、凝胶电泳）、 时间上可分辨的信号（例如，毛细管电泳）或其组合（例如，Sanger测序）。对可以在单一 的溶液中执行的多路反应是有需求的。
[0005] 发明概述
[0006] 本公开提供了用于分析物的多路检测的方法、组合物、系统和试剂盒。在一些情况 下，本公开提供测定，所述测定能够不执行固定化（immobilization)、分离、质谱法、或解链 (melting)曲线分析而明确地检测单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的 至少7种分析物中的每种分析物的存在或不存在。在一些实例中，每种分析物被编码为信 号的一个（或至少一个）分量的值。
[0007] 在一些实例中，本公开提供的测定能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形 式的、M种分析物的存在或不存在，其中M=log2 (F+1)，且F是当所有分析物存在时的信号 的一个分量（例如，强度）的最大累积值。
[0008] 在一些情况下，每种分析物被编码为信号的第一分量中的至少一个第一值（例 如，至少一个强度或强度范围）和信号的第二分量中的至少一个第二值（例如，至少一个波 长或波长范围）。在一些实例中，每种分析物被编码为在信号的第二分量中的多个第二值中 的每个第二值的信号的第一分量中的第一值（例如，在多个波长或多个波长范围中的每个 波长或每个波长范围的信号强度或信号强度范围）。
[0009] 在一些实例中，本文提供的测定能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形式 的、M种分析物的存在或不存在，其中M=C*log2 (F+1)，其中C是用于编码分析物的第二值 的数目，且F是在所有分析物存在时的、关于任意第二值的信号的第一分量的最大累积值。
[0010] 在一些情况下，本公开提供的测定能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形 式的、M种分析物的存在或不存在，其中M= (P*T)+1，其中P是编码方案中每层代码的数 目，且T是层的数目。在一些情况下，层的数目T=log4(F+l)，且F是在所有分析物存在时 的、关于任意第二值的信号的第一分量的最大累积值。
[0011] 在一些实例中，第一值是强度或强度范围。在一些情况下，编码方案包括至少三个 强度或强度范围。
[0012] 在一些情况下，第二值是波长或波长范围。在一些实例中，编码方案包括至少五个 波长或波长范围。
[0013] 在一些实施例中，信号是电磁信号。在一些情况下，电磁信号是荧光发射信号。在 一些实施例中，测量了在至少四个波长或波长范围处的荧光发射信号的强度。
[0014] 在一些情况下，本文提供的测定利用在使用之前被冻干的试剂执行。
[0015] 在一些情况下，利用包括杂交探针的试剂执行检测步骤。在一些实例中，杂交探针 的数目大于分析物的数目。在一些情况下，杂交探针组包括专门用于不同分析物的一个或 更多个杂交探针，且包括相同的荧光团或荧光团的组合。在一些实例中，样品与至少18个 所述杂交探针接触。在一些实例中，利用包括至少一对引物的试剂执行检测步骤。在一些 情况下，至少一对引物能够扩增与至少三个所述杂交探针互补的区域。
[0016] 在一些实例中，在聚合酶链式反应期间产生被测量的信号。在一些情况下，聚合酶 链式反应选自以下所构成的组：终点（end-point)聚合酶链式反应、实时聚合酶链式反应、 数字聚合酶链式反应、及其组合。
[0017] 在一些实例中，针对溶液执行至少一个累积测量。
[0018] 在一些实例中，至少一种分析物是通过至少一个额外的值（即，至少两个值一起） 编码的，其中，至少一个额外的值选自以下所构成的组：来自信号的至少一个额外的分量的 值，来自不同的信号的至少一个分量的值，及其组合。例如，至少一个额外的值可选自以下 所构成的组：荧光发射强度、荧光发射波长、F6rster共振能量转移（FRET)发射强度、FRET 发射波长、电化学信号、化学发光波长、化学发光强度、荧光漂白率、化学发光漂白率、及其 组合。
[0019] 在一些情况下，色谱被构建。通过绘制每个分析物的阳性对照（positive control)样品的第一值和第二值的所有可能的组合可构建色谱。
[0020] 在一些实例中，至少一个分析物包括多核苷酸。在一些情况下，多核苷酸来自选自 以下所构成的组的来源：动物、植物、细菌、真菌、寄生物和病毒。在一些实例中，多核苷酸来 自选自以下所构成的组的来源：人类免疫缺陷病毒、单纯性疱疹病毒、人类乳头瘤病毒、疟 原虫、分枝杆菌、登革热病毒、肝炎病毒和流感病毒。在一些情况下，多核苷酸选自以下所构 成的组；人类免疫缺陷病毒多蛋白酶（polyprotease)、人类免疫缺陷病毒pl7、人类乳头瘤 病毒E6、及人类乳头瘤病毒E7。
[0021] 在一些情况下，样品选自以下所构成的组：临床样品、食品样品、环境样品、药物样 品、及来自消费产品的样品。
[0022] 在一些实例中，关于分析物存在或不存在的信息通过计算机网络传输。
[0023] 在一些情况下，向医生提供关于分析物存在或不存在的信息。在一些实例中，临床 决定是基于此类信息做出的。
[0024] 在一些实例中，本文提供的方法的至少一个步骤是使用计算机可读介质上的指令 执行的。在一些情况下，指令位于远程服务器上。在一些实例中，指令位于热循环仪上。在 一些情况下，指令位于与热循环仪通信的计算机上。
[0025] 在一些情况下，至少一个分析物是阳性对照分析物。
[0026] 在一些实例中，编码方案是非简并的。在一些情况下，编码方案被设计为非简并 的。在一些实例中，通过枚举可以从编码方案获得的每个合理的结果、鉴定是简并的每个合 理的结果、并消除来自编码方案的至少一个潜在的分析物代码以消除简并性，编码方案被 做成非简并的。
[0027] 在一些情况下，本文提供的测定是终点测定。在一些实例中，本公开提供的测定在 通过仪器的检测极限设定的循环的阈值数结束。
[0028] 在一些实例中，本文提供的测定是液相测定。
[0029] 在一些情况下，本文提供的测定是定量的。
[0030] 在一些情况下，本公开提供了检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的方 法，所述方法包括：(a)将每个所述分析物编码为信号的第一值，由此产生编码方案，其中 每个所述分析物在所述编码方案中由所述第一值表示，其中所述编码是以消除简并性的方 式执行的；(b)提供包括或可能包括至少一个所述分析物的样品；(c)将所述样品与如所 述编码方案中表示的在每个所述分析物存在时产生所述第一值的分析物特异性试剂接触； (d)累积地测量所述样品中所述信号的所述第一值，从而提供累积测量结果；及（e)基于所 述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在。
[0031] 在一些实例中，在先前段落描述的方法能够明确地检测以存在或不存在的任意组 合的M种分析物的存在或不存在，其中M=log2 (F+1)，且F是当所有分析物存在时的第一 值的最大累积值。在一些情况下，第一值是强度或强度范围。在一些实例中，第一值具有在 编码方案中的最小值，所述最小值选自以下所构成的组：至少1、至少2、至少4、至少8、至少 16、至少32和至少64。在一些情况下，第一值通过等于所述先前第一值的累积最大值的加 一的量在编码方案中增加。在其它情况下，第一值通过大于先前第一值的累积最大值加一 的量在编码方案中增加。
[0032] 在一些情况下，本公开提供了检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的方 法，所述方法包括：(a)以至少一个第一值和至少一个第二值编码每个所述分析物，其中所 述第一值是来自信号的第一分量的值且所述第二值是来自所述信号的第二分量的值，从而 产生编码方案，其中每个所述分析物在所述编码方案中通过所述至少一个第一值和所述至 少一个第二值表示，其中所述编码以减少或消除简并性的方式执行；(b)提供包括或可能 包括至少一种所述分析物的样品；(c)将所述样品与所述编码方案中表示的在每个所述分 析物存在时产生所述至少一个第一值和至少一个所述第二值的分析物特异性试剂接触； (d)累积地测量所述样品中的所述第一值和所述第二值，从而提供累积测量结果；及（e)基 于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在，其中，当简 并性被消除时，在每个所述试剂仅产生一个第二值时，所述方法能够明确地检测单一体积 中的、以存在或不存在的任意组合形式的、至少6个分析物的每个分析物的存在或不存在。
[0033] 在一些情况下，在先前段落描述的方法中的每个分析物被编码为在信号的第二分 量中的多个第二值中的每个第二值的信号的第一分量中的第一值。在一些情况下，当简并 性被消除时，该方法使用4个第二值能够明确地检测单一体积中的至少7个分析物中的每 个分析物的存在或不存在。在一些实例中，当简并性被消除时，编码方案包括T个非简并 层，其中T=log4 (F+1)，且F是当所有分析物存在时，关于任意第二值的信号的第一分量的 最大累积值。在一些情况下，当简并性被消除时，方法能够明确地检测以存在或不存在的任 意组合形式的、M种分析物的存在或不存在，其中M= (P*T)+1，且P是每层代码的数目。在 一些实例中，当简并性被消除时，方法能够明确地检测以存在或不存在的任意组合形式的、 M种分析物的存在或不存在，其中M=C*log2 (F+1)，C是编码方案中第二值的数目，且F是 当所有分析物存在时，关于任意第二值的信号的第一分量的最大累积值。
[0034] 本公开还提供了非简并编码方案，所述非简并编码方案能够不执行固定化、分离、 质谱法、或解链曲线分析而明确地编码单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合的 至少7个分析物中的每个分析物的存在或不存在。
[0035] 在一些实例中，本公开的非简并编码方案是通过包括以下步骤的方法产生的：（a) 产生用于每个潜在分析物的代码，其中每个潜在的分析物通过信号的至少一个分量的至少 一个值编码；(b)枚举对存在或不存在的每个分析物的所有可能组合的每个合理的累积结 果；（c)鉴定每个合理的简并的结果；及（d)消除至少一个代码，以消除简并性。在一些情 况下，编码方案可通过增加额外的代码扩大，所述额外的编码比所述信号的至少一种分量 中的所有先前的代码的总和大至少一个单位。在一些情况下，编码方案通过由结构保证非 简并性的数学迭代的方法产生。
[0036] 在一些情况下，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在 的系统，所述系统包括：(a)编码每个所述分析物为信号的第一值，由此产生编码方案，其 中每个所述分析物在所述的编码方案中由所述第一值表示，其中所述编码是以消除简并性 的方式执行的；(b)提供包括或可能包括至少一个所述分析物的样品；（c)将所述样品与 如在所述编码方案中表示的、当每个所述分析物存在时产生所述第一值的分析物特异性试 剂接触；(d)累积地在所述样品中测量所述信号的所述第一值，从而提供累积测量结果；及 (e)基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在。
[0037] 在一些情况下，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在 的系统，所述系统包括：(a)以至少一个第一值和至少一个第二值编码每个所述分析物，其 中所述第一值是来自信号的第一分量的值且所述第二值是来自所述信号的第二分量的值， 从而产生编码方案，其中每个所述分析物在所述编码方案中通过所述至少一个第一值和所 述至少一个第二值表示，其中所述编码以减少或消除简并性的方式执行；(b)提供包括或 可能包括至少一种所述分析物的样品；（c)将所述样品与在所述编码方案中表示的、当每 个所述分析物存在时产生所述至少一个第一值和所述至少一个第二值的分析物特异性试 剂接触；（d)累积地测量所述样品中的所述第一值和所述第二值，从而提供累积测量结果； 及（e)基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在， 其中，当简并性被消除时，在每个所述试剂仅产生一个第二值时，所述方法能够明确地检测 在单一体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的、至少6个分析物的每个分析物的存 在或不存在。
[0038] 在一些情况下，本公开提供了用于第三团体的检测多个分析物中的每个分析物存 在或不存在的方法，所述方法包括：(a)从团体获得每个所述分析物的标识；(b)将每个所 述分析物编码为信号的第一值，由此产生编码方案，其中每个所述分析物在所述的编码方 案中由所述第一值表示，其中所述编码以消除简并性的方式执行；（c)向所述团体提供如 在所述编码方案中表示的、当每个所述分析物存在时产生所述第一值的分析物特异性试 齐U，所述团体：（i)将包括或可能包括至少一个所述分析物的样品与所述试剂接触；及（ii) 累积地测量所述样品中的所述第一值，从而提供累积测量结果；及（d)从所述团体获得所 述累积测量结果；（e)基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存 在还是不存在；及（f)将关于每个所述分析物存在或不存在的信息提供给所述团体。
[0039] 在一些情况下，本公开提供了用于第三团体的检测多个分析物中的每个分析物存 在或不存在的方法，所述方法包括：(a)从团体获得每个所述分析物的标识；(b)将每个所 述分析物编码为至少一个第一值和至少一个第二值，其中，所述第一值是来自信号的第一 分量的值，且所述第二值是来自所述信号的第二分量的值，由此产生编码方案，其中每个所 述分析物在所述的编码方案中由所述至少一个第一值和所述至少一个第二值表示，其中所 述编码以减少或者消除简并性的方式执行；（C)向所述团体提供如所述编码方案中表示的 在每个所述分析物存在时产生所述至少一个第一值和所述至少一个第二值的分析物特异 性试剂，所述团体：（i)将包括或可能包括至少一个所述分析物的样品与所述试剂接触；及 (ii)累积地测量所述样品中所述第一值及所述第二值，从而提供累积测量结果；及（d)从 所述团体获得所述累积测量结果；（e)基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个 所述分析物是存在还是不存在；及（f)将关于每个所述分析物存在或不存在的信息提供给 所述团体。
[0040] 在一些情况下，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不 存在的组合物，所述组合物包括分析物特异性试剂，每个试剂产生包括第一值的信号，其中 所述试剂能够在不执行固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析的情况下，明确地检测单一 样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的、至少7个分析物的每个分析物的存在 或不存在。
[0041] 在一些情况下，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存 在的组合物，所述组合物包括分析物特异性试剂，每个试剂产生包括至少一个第一值和至 少一个第二值的信号，所述至少一个第一值是来自所述信号的第一分量的值且所述至少一 个第二值是来自所述信号的第二分量的值，其中，当每个所述试剂仅产生一个第二值时，所 述试剂能够检测在单一体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的、至少6个分析物的 每个分析物的存在或不存在。
[0042] 在一些情况下，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存 在的试剂盒，所述试剂盒包括分析物特异性试剂、包装、及说明书，每个试剂产生包括第一 值的信号，其中所述试剂盒能够在不执行固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析的情况下， 明确地检测单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的、至少7个分析物的每 个分析物的存在或不存在。
[0043] 在一些实例中，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存 在的试剂盒，所述试剂盒包括分析物特异性试剂、包装、及说明书，每个试剂产生包括至少 一个第一值和至少一个第二值的信号，所述至少一个第一值是来自所述信号的第一分量的 值且所述至少一个第二值是来自所述信号的第二分量的值，其中，当每个所述试剂仅产生 一个第二值时，所述试剂盒能够检测在单一体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的、 至少6个分析物中的每个分析物的存在或不存在。
[0044] 在一些情况下，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在 的试剂盒，所述试剂盒包括盒体（601)、布置在盒体中用于放置瓶的卡接槽口、包括用于分 析物的检测的探针的瓶（602)、包括用于扩增的引物的瓶（603)、及包括用于扩增的试剂的 瓶（604)、其中，所述试剂盒能够在不执行固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析的情况下， 明确地检测单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的至少7个分析物中的每 个分析物的存在或不存在。
[0045] 在一些实例中，本公开提供了用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在 的试剂盒，包括：盒体（601)、布置在盒体中用于放置瓶的卡接槽口、包括用于分析物的检 测的探针的瓶（602)、包括用于扩增的引物的瓶（603)、及包括用于扩增的试剂的瓶（604)， 每个探针产生包括至少一个第一值和至少一个第二值的信号，所述至少一个第一值是来自 所述信号的第一分量的值且所述至少一个第二值是来自所述信号的第二分量的值，其中， 当每个所述探针仅产生一个第二值时，所述试剂盒能够检测在单一体积中的、以存在或不 存在的任意组合形式的至少6个分析物中的每个分析物的存在或不存在。
[0046] 引用并入
[0047] 在本说明书中提到的所有的出版物和专利申请在此通过引用以相同程度并入，如 同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地表明通过引用并入。
[0048] 附图简述
[0049] 本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别陈述。将通过参考以下的详细描述 的说明性实施方案的陈述获得对本发明的特征和优点更好地理解，其中本发明的原理被利 用，且其中的附图是：
[0050] 图1显示了以四个颜色检测四个分析物的传统的编码方法，及以四个颜色能够检 测16个或更多个序列的本发明的编码方法之间的比较。颜色由B、G、Y和R指示，其分别指 示蓝色、绿色、黄色和红色。
[0051] 图2显示了表示以四个颜色对6个分析物（包括对照）检测的示意图。使用连接 到荧光团（B、G、Y、R;分别为蓝色、绿色、黄色和红色）和猝灭剂（标有"X"的椭圆形）的 杂交探针检测分析物。对照序列和五个其它序列（登革热=登革热病毒；结核病=结核分 枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis) ;P17 =HIVpl7 ;痕疾=恶性痕原虫（Plasmodium falciparum);和疱疹=单纯性疱疹病毒2)均使用标有蓝色荧光团的探针检测。每个非对 照分析物分别使用1-3个额外的探针检测。例如，登革热病毒的分析物使用三个具有绿色、 黄色和红色荧光团的额外的探针检测；单纯性疱疹病毒2的分析物使用具有红色荧光团的 额外的探针检测；等等。
[0052] 图3显示了如实施例2中描述得到的实验结果的色谱。
[0053] 图4显示了本发明的示例性的实施方案，其中使用计算机执行本文提供的方法的 一个或更多个步骤。
[0054] 图5显示了检测光信号，例如荧光发射信号的波长和强度的两个不同的方法的示 意图。
[0055] 图6显示了示例性的试剂盒的示意图。
[0056] 图7显示了如实施例3中描述得到的实验结果的色谱。
[0057] 图8显示了合理的结果（上图）和不合理的结果（下图）的示意图。
[0058] 发明详述
[0059] 由于几个理想的特性，包括与生化测定的相容性、荧光标记相对小的尺寸、缀合感 兴趣的分子的简单的手段、可负担性、低毒性、稳定性、鲁棒性、利用廉价光学系统的可检测 性、及与空间阵列相结合的能力，荧光检测已经是多路测定优选的技术。然而，标准的荧光 具有广泛的发射光谱。因此，为了避免光谱重叠（即，为了保持光谱分辨率）仅相对少量数 目的颜色（例如，4至6种）通常在多路荧光测定中同时使用。
[0060] 多路荧光测定的传统编码方法一直以单一的颜色编码每个分析物；即，M=N，其 中M是可检测的分析物的数目，且N是光谱可分辨的荧光探针的数目。每当需要更高的多 路因子时（即，M>N)，荧光通常结合其它技术技术，如等分、空间阵列、或顺序处理。这些额 外的处理步骤是劳动密集的，并经常需要相对昂贵和复杂的光学和机械系统（例如，光谱 仪、机械化显微镜镜台、微流体、液滴生成器、扫描仪、及类似系统）。这种系统在某些环境中 配置往往是不切实际的，特别是定点护理（point-of care)和低资源设置。因此，对可提供 廉价的多路的手段，同时避免使用昂贵的额外的处理步骤的多路编码和解码方法有显著需 求。
[0061] 本公开提供了用于样品中的多个分析物的检测的方法、系统、组合物和试剂盒。本 文呈现了基于编码、分析和解码方法对分析物进行检测。在一些实例中，待检测的每个分析 物被编码为信号（例如，强度）的值，其中值被分配，使得测定的结果明确地指示被测定的 分析物存在或不存在。在其它实例中，待检测的每个分析物被编码为在信号的至少两个分 量（例如，强度和波长）的每个中的值。信号的至少两个分量可以是正交的。类似地，如本 公开中在其他地方更全面地描述的，可以使用多个正交信号，例如荧光信号和电化学信号 的组合。分析物可以是任何合适的分析物，例如多核苷酸、蛋白质、小分子、脂质、碳水化合 物、或其混合物。信号可以是任何合适的信号，例如电磁信号、光信号、荧光发射信号、电化 学信号、化学发光信号、及其组合。信号的至少两个分量可以是任何合适的两个分量，例如 振幅和频率，或强度和波长。
[0062] 编码分析物之后，样品被提供，其中样品包括或可包括编码的分析物中的至少一 个。样品与在编码方案中对每个分析物指定的在分析物存在时、产生特定的信号的、一个或 多个分析物特异性试剂接触。试剂可以是任何合适的试剂，其能够在其相应的分析物存在 时产生这样的信号，例如，连接到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸探针（例如，TAQMAN探针）。 如果试剂是连接到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸探针，可执行产生信号的核酸扩增。
[0063] 添加试剂后，信号被定量。在一些情况下，通过测量信号的一个分量（例如，荧光 强度），及基于用于编码每种分析物的存在的值、及信号的累积值，确定某些分析物存在和 不存在，执行这种定量。
[0064] 在一些情况下，对样品累积地测量信号的至少两个分量（例如，强度和波长）。例 如，这种测量可以通过测量在特定波长的强度，或特定波长范围内的强度执行。然后可以基 于信号的至少两个分量中的每个分量的值与用于编码分析物的存在的值（即，在编码方案 中的那些值）确定分析物的存在或不存在。
[0065] 编码可以以减少或消除通过该方法获得的可能的简并（例如，不明确的）结果的 数目的方式执行。如本说明书中其他地方所描述的，特定编码方案的完整编码能力可被枚 举，且某些潜在的分析物代码可从编码方案消除，以减少或消除简并性。同样地，编码方案 可被设计成非简并的，使得简并性的减少或消除是没有必要的。可以构建解码矩阵以对应 于累积信号测量结果的构成信号，将累积信号测量结果（例如，强度或在特定波长的强度） 解释为某些分析物存在或不存在。
[0066] I?定义
[0067] 本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制。
[0068] 如本文所用，单数形式的"一（a)"、"一（an)"、和"该（the)"除非上下文另有明确 地指示,也旨在包括复数形式。此外，针对术语"包括（including) "、"包括（includes) "、"具 有（having) "、"具有（has)"、"有（with)"、"例如（suchas)"、或其变体的范围，在说明书和 /或权利要求书中使用时，这些术语不是限制的，且旨在以类似术语"包括（comprising)" 的方式被包括。
[0069] 如本文所用的术语"约"，一般是指比特定用法的上下文中规定的数值增加15%或 减少15%的范围。例如，"约10"将包括从8. 5到11. 5的范围。
[0070] 如本文所用的术语"维"和"分量"，当涉及信号时，一般是指可被定量的信号的方 面。例如，如果是由荧光分子产生的信号，其可以依据其波长（例如，第一维或第一分量） 及其强度（例如，第二维或第二分量）被量化。
[0071] 如本文所用的术语"解码"，一般是指确定哪个分析物存在的方法，其基于累积信 号和能够将累积信号转换为关于一个或更多个分析物存在或不存在的信息的编码方案或 解码矩阵。
[0072] 如本文所用的术语"编码"，一般是指表示分析物的处理，使用包括信号的值（例 如强度）、或在一个信号或多个信号的至少两个分量中的每个分量的值（如波长和强度）的 代码。
[0073] 术语"连接到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸探针"和"TAQMAN探针"通常是指在多 核苷酸扩增测定中用于检测分析物存在的水解探针。这些探针包括连接到荧光团和猝灭剂 的寡核苷酸探针。只要猝灭剂和荧光团接近，猝灭剂就会猝灭由光源激发荧光团所发射的 荧光。寡核苷酸探针的序列被设计为互补于分析物中存在的多核苷酸序列，并因此，能够与 分析物中存在的多核苷酸序列杂交。寡核苷酸探针的杂交在包括引物的核酸扩增反应（例 如，聚合酶链式反应）中执行。通过DNA聚合酶延伸引物后，聚合酶的5'至3'外切酶活性 降解探针，释放荧光团和猝灭剂至介质中。荧光团和猝灭剂之间的接近被破坏，且来自荧光 团的信号不再猝灭。因此，检测到的荧光的量是分析物存在的量的函数。如果没有分析物 存在，探针将不与分析物杂交，且荧光团和猝灭剂将保持极为接近。很少信号或没有信号会 产生。
[0074] 如本文所用的术语"正交"，一般是指可以独立地或近似独立地改变的信号的至少 两个分量（如，波长和强度），或至少两个不同的信号（如，荧光发射信号和电化学信号）。 例如，当使用荧光分子时，波长和强度被认为是正交的或近似正交的。除其它因素外，荧光 发射的波长将取决于荧光分子的组合物，并且荧光的强度将取决于存在的分子的量。虽然 波长和强度是可以近似独立地被改变的信号的两个分量的实例，但是本文描述的方法不限 于可以独立地或近似独立地被改变的分量。也可以使用非独立地改变的信号的分量、或多 个信号，只要足够良好地确定分量或信号的特征，以能够编码、测量和解码。例如，如果一个 分量或信号中的变化影响另一个分量或信号中的变化，只要理解变化之间的关系，仍可以 使用这两个分量或信号。
[0075] 如本文所用的术语"多核苷酸"、"寡核苷酸"、或"核酸"，在本文中用于指包括多个 核苷酸的生物分子。示例性的多核苷酸包括脱氧核糖核酸、核糖核酸、及其合成的类似物， 包括肽核酸。
[0076] 如本文所用的术语"探针"一般是指在特定的分析物存在下能够产生信号的试剂。 探针通常具有至少两个部分：能够特异性识别分析物，或其一部分的部分；及能够在分析 物，或其一部分存在下，产生信号的部分。如上文和本公开中其他地方描述的，探针可以是 连接到荧光团和猝灭剂的寡核苷酸探针。探针还可以是在分析物存在下，产生信号的任何 试剂，如检测分析物的抗体，具有因抗体结合至分析物而发射或被猝灭的荧光标记。任何合 适的探针可以以本公开中提出的方法使用，只要探针在分析物存在下产生可定量的信号。 例如，探针的分析物特异性部分可以与酶耦合，在分析物存在下，所述酶转化不带电荷的底 物为带电荷的产物，从而随着时间的推移提高了介质中的导电率。在此情况下，不同的分析 物可以以不同比例通过耦合探针（如杂交探针或抗体）的分析物特异性部分至酶被编码。 介质中增加的导电率的产生速率将对介质中存在的所有分析物累积。根据本文提供的方 法，编码分析物能够将导电率测量结果转换为明确的（即，非简并的）的结果，提供了关于 特定分析物存在或不存在的信息。类似地，探针可包括从底物产生化学发光产物的酶。化 学发光的量可随后被用于编码特定分析物的存在。
[0077] II?编码和解码方法
[0078] A?传统荧光编码和解码方法
[0079] 确定分析物存在的常用的方法是使用4个光谱可分辨的荧光分子指示四个分析 物的存在或不存在。图1的左手侧表示了这种方法的实例。图1的左手侧显示了编码方 法，其中四个分析物（序列1、序列2、序列3和序列4)每个分别由单一颜色（分别为蓝色、 绿色、黄色和红色）编码。颜色表示连接到还包括猝灭剂的寡核苷酸探针的荧光团。在图 1的左手侧所示的系统中，有四种不同的寡核苷酸探针，每种包括单一的荧光团（蓝色、绿 色、黄色、或红色）和猝灭剂。分析物的存在或不存在是基于在特定的颜色中信号的存在或 不存在确定的。
[0080] 图1的左手侧的图表显示了包含两个分析物：序列1和序列3,的假定样品的强度 对颜色。这些分析物的存在是基于蓝色信号（对应于序列1)和黄色信号（对应于序列3) 的测量结果确定的。不存在序列2和序列4是通过不存在蓝色和红色信号指示的。
[0081] 表1显示了这种编码方案的二进制格式的解释。每个分析物被编码为在荧光信号 的两个分量中的每个分量的值：（1)颜色（也称为波长；或波长范围）和（2)的强度（由表 中的数字指示）。例如，A(例如，序列1)具有蓝色的颜色和1的强度；B(例如，序列2)具 有绿色的颜色和1的强度；等等。如本文所述的定量每个颜色范围内的信号的强度，例如， 通过测量由带通滤波器确定的特定波长范围内的信号的强度。1000的结果指示仅分析物A 存在；1100结果指示分析物A和B存在；等等。
[0082] 表1.具有四个探针的四个分析物的传统编码，每个探针具有单一颜色，且每个分 析物一个探针。
[0083]
【权利要求】
1. 一种测定，所述测定能够不进行固定化、分离、质谱法、或解链曲线分析而明确地检 测单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的至少7个分析物中的每个分析物 的存在或不存在。
2. 根据权利要求1所述的测定，其中，每个所述分析物被编码为信号的一个分量的值。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法能够明确地检测以存在或不存在的任 意组合形式的M个分析物的存在或不存在，其中M = Iog2 (F+1)，且F是当所有所述分析物 存在时的所述信号的所述一个分量的最大累积值。
4. 根据权利要求1所述的测定，其中，每个所述分析物被编码为所述信号的第一分量 中的至少一个第一值，及所述信号的第二分量中的至少一个第二值。
5. 根据权利要求4所述的测定，其中，每个所述分析物被编码为在所述信号的第二分 量中的多个第二值中的每个第二值的所述信号的第一分量中的第一值。
6. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法能够明确地检测以存在或不存在的任 意组合形式的M个分析物的存在或不存在，其中M = Olog2 (F+1)，其中C是用于编码所述 分析物的所述第二值的数目，且F是当所有所述分析物存在时，关于任意第二值的所述信 号的所述第一分量的最大累积值。
7. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法能够明确地检测以存在或不存在的任 意组合形式的M个分析物的存在或不存在，其中M = (P*T)+1，其中P是编码方案中每层代 码的数目，且T是层的数目。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述层的数目T = log4 (F+1)，且F是当所有所 述分析物存在时，关于任意第二值的所述信号的所述第一分量的最大累积值。
9. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述第一值是强度或强度的范围。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述编码方案包括至少三个强度或强度的范 围。
11. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述第二值是波长或波长的范围。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述编码方案包括至少五个波长或波长的范 围。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述信号是电磁信号。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述电磁信号是荧光发射信号。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中，测量了位于至少四个波长或波长的范围处的 所述荧光发射信号的强度。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测利用使用之前被冻干的试剂执行。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测使用包括杂交探针的试剂执行。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述杂交探针的数目大于所述分析物的数目。
19. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述杂交探针包括对不同分析物特异的一个 或更多个杂交探针，且包括相同的荧光团或荧光团的组合。
20. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述样品与至少18个所述杂交探针接触。
21. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述试剂还包括能够扩增与至少三个所述杂 交探针互补的区域的至少一对引物。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中，所述信号是在聚合酶链式反应中产生的。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中，所述聚合酶链式反应选自以下所构成的组：终 点聚合酶链式反应、实时聚合酶链式反应、及数字聚合酶链式反应。
24. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述累积测量针对溶液执行。
25. 根据权利要求1的所述方法，其中，至少一种所述分析物是通过至少一个额外的值 编码的，其中所述至少一个额外的值选自以下所构成的组：来自所述信号的至少一个额外 的分量的值、来自额外的信号的至少一个分量的值、及其组合。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中，所述至少一个额外的值是选自以下所构成的 组：荧光发射强度、荧光发射波长、Hkslur共振能量转移FRET发射强度、FRET发射波长、电 化学信号、化学发光波长、化学发光强度、荧光漂白率、化学发光漂白率、及其组合。
27. 根据权利要求1所述的方法，还包括构建色谱。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中，通过绘制阳性对照样品的所述第一值和所述 第二值的所有可能的组合来构建所述色谱。
29. 根据权利要求1所述的方法，其中，至少一个所述分析物包括多核苷酸。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中，所述多核苷酸来自选自以下所构成的组的来 源：动物、植物、细菌、真菌、寄生物和病毒。
31. 根据权利要求23所述的方法，其中，所述多核苷酸来自选自以下所构成的组的来 源：人类免疫缺陷病毒、单纯性疱疹病毒、人类乳头瘤病毒、疟原虫、分枝杆菌、登革热病毒、 肝炎病毒和流感病毒。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中，所述多核苷酸选自以下所构成的组；人类免疫 缺陷病毒多蛋白酶、人类免疫缺陷病毒P17、人类乳头瘤病毒E6、及人类乳头瘤病毒E7。
33. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品选自以下所构成的组：临床样品、食品 样品、环境样品、药物样品、及来自消费产品的样品。
34. 根据权利要求1所述的方法，还包括通过计算机网络传输关于所述分析物存在或 不存在的信息。
35. 根据权利要求1所述的方法，还包括向医生提供关于所述分析物存在或不存在的 信息。
36. 根据权利要求35所述的方法，还包括基于所述信息做出临床决定。
37. 根据权利要求1所述的方法，其中，使用计算机可读介质上的指令执行所述方法的 至少一个步骤。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中，所述指令位于远程服务器上。
39. 根据权利要求37所述的方法，其中，所述指令位于热循环仪上。
40. 根据权利要求37所述的方法，其中，所述指令位于与热循环仪通信的计算机上。
41. 根据权利要求1所述的方法，其中，至少一个所述分析物是阳性对照分析物。
42. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述编码方案是非简并的。
43. 根据权利要求42所述的方法，其中，所述编码方案被设计为非简并的。
44. 根据权利要求42所述的方法，其中，通过枚举可以从所述编码方案获得的每个合 理的结果、鉴定是简并的每个合理的结果、并从所述编码方案消除至少一个潜在的分析物 代码以消除简并性，所述编码方案被做成非简并的。
45. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述测定是终点测定。
46. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述测定在仪器的检测极限设定的循环的阈值 数目结束。
47. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述测定是液相测定。
48. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述测定是定量的。
49. 一种检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的方法，所述方法包括： a. 将每个所述分析物编码为信号的第一值，由此产生编码方案，其中每个所述分析物 在所述编码方案中由所述第一值表示，其中所述编码是以消除简并性的方式进行的； b. 提供包括或可能包括至少一个所述分析物的样品； c. 将所述样品与如在所述编码方案中表示的在每个所述分析物存在时产生所述第一 值的分析物特异性试剂接触； d. 累积地测量所述样品中所述信号的所述第一值，从而提供累积测量结果；及 e. 基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在。
50. 根据权利要求49所述的方法，其中，所述方法能够明确地检测以存在或不存在的 任意组合形式的M个分析物的存在或不存在，其中M = Iog2 (F+1)，且F是当所有所述分析 物存在时的所述第一值的最大累积值。
51. 根据权利要求49所述的方法，其中，所述第一值是强度或强度的范围。
52. 根据权利要求49所述的方法，其中，所述第一值具有在所述编码方案中的最小值， 所述最小值选自以下所构成的组：至少1、至少2、至少4、至少8、至少16、至少32和至少64。
53. 根据权利要求49所述的方法，其中，所述第一值通过等于所述先前第一值的累积 最大值加一的量在所述编码方案中增加。
54. 根据权利要求49所述的方法，其中，所述第一值通过大于所述先前第一值的累积 最大值加一的量在所述编码方案中增加。
55. -种检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的方法，所述方法包括： a. 以至少一个第一值和至少一个第二值编码每个所述分析物，其中，所述第一值是来 自信号的第一分量的值且所述第二值是来自所述信号的第二分量的值，从而产生编码方 案，其中每个所述分析物在所述编码方案中通过所述至少一个第一值和所述至少一个第二 值表示，其中所述编码以减少或消除简并性的方式进行； b. 提供包括或可能包括至少一个所述分析物的样品； c. 将所述样品与如在所述编码方案中表示的在每个所述分析物存在时产生所述至少 一个第一值和至少一个所述第二值的分析物特异性试剂接触； d. 累积地测量所述样品中的所述第一值和所述第二值，从而提供累积测量结果；及 e. 基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在， 其中，当简并性被消除时，在每个所述试剂仅产生一个第二值时，所述方法能够明确地 检测单一体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的至少6个分析物中的每个分析物的 存在或不存在。
56. 根据权利要求55所述的方法，其中，每个所述分析物被编码为在所述信号的第二 分量中的多个第二值中的每个第二值的所述信号的第一分量中的第一值。
57. 根据权利要求55所述的方法，其中，当简并性被消除时，所述方法能够使用4个第 二值明确地检测单一体积中的至少7个分析物中的每个分析物的存在或不存在。
58. 根据权利要求55所述的方法，其中，当简并性被消除时，所述编码方案包括T个非 简并层，其中T = Iog4 (F+1)，且F是当所有所述分析物存在时，关于任意第二值的所述信号 的所述第一分量的最大累积值。
59. 根据权利要求56所述的方法，其中，当简并性被消除时，所述方法能够明确地检测 以存在或不存在的任意组合形式的M种分析物的存在或不存在，其中M = (P*T)+1，且P是 每层代码的数目。
60. 根据权利要求55所述的方法，其中，当简并性被消除时，所述方法能够明确地检测 以存在或不存在的任意组合形式的M个分析物的存在或不存在，其中M = Olog2 (F+1)，C是 所述编码方案中第二值的数目，且F是当所有所述分析物存在时，关于任意第二值的所述 信号的所述第一分量的最大累积值。
61. -种非简并编码方案，所述非简并编码方案能够不执行固定化、分离、或解链曲线 分析而明确地编码单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的至少7个分析物 中的每个分析物的存在或不存在。
62. 根据权利要求61所述的非简并编码方案，其中，所述编码方案由一种方法产生，所 述方法包括： a. 产生用于每个潜在分析物的代码，其中，每个潜在的分析物通过信号的至少一个分 量的至少一个值编码； b. 枚举每个分析物的存在或不存在的所有可能组合的每个合理的累积结果； c. 鉴定每个合理的简并的结果；及 d. 消除至少一个代码，以消除简并性。
63. 根据权利要求62所述的方法，还包括通过增加额外的代码来扩展所述编码方案， 所述额外的编码比所述信号的所述至少一个分量中的所有先前的代码的总和大至少一个 单位。
64. 根据权利要求61所述的方法，其中，所述编码方案通过由结构保证非简并性的数 学迭代的方法产生。
65. -种用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的系统，所述系统包括： a. 将每个所述分析物编码为信号的第一值，由此产生编码方案，其中每个所述分析物 在所述的编码方案中由所述第一值表示，其中所述编码以消除简并性的方式进行； b. 提供包括或可能包括至少一个所述分析物的样品； c. 将所述样品与如所述编码方案中表示的在每个所述分析物存在时产生所述第一值 的分析物特异性试剂接触； d. 累积地测量所述样品中所述信号的所述第一值，从而提供累积测量结果；及 e. 基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在。
66. -种用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的系统，所述系统包括： a. 以至少一个第一值和至少一个第二值编码每个所述分析物，其中所述第一值是来自 信号的第一分量的值且所述第二值是来自所述信号的第二分量的值，从而产生编码方案， 其中每个所述分析物在所述编码方案中通过所述至少一个第一值和所述至少一个第二值 表示，其中所述编码以减少或消除简并性的方式进行； b. 提供包括或可能包括至少一个所述分析物的样品； C.将所述样品与如所述编码方案中表示的在每个所述分析物存在时产生所述至少一 个第一值和所述至少一个第二值的分析物特异性试剂接触； d. 累积地测量所述样品中的所述第一值和所述第二值，从而提供累积测量结果；及 e. 基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在， 其中，当简并性被消除时，在每个所述试剂仅产生一个第二值时，所述系统能够明确地 检测单一体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的至少6个分析物中的每个分析物的 存在或不存在。
67. -种检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的方法，所述方法包括： a. 从团体获得每个所述分析物的标识； b. 将每个所述分析物编码为信号的第一值，由此产生编码方案，其中每个所述分析物 在所述编码方案中由所述第一值表示，其中所述编码以消除简并性的方式进行； c. 向所述团体提供如所述编码方案中表示的、当每个所述分析物存在时产生所述第一 值的分析物特异性试剂，所述团体： i. 将包括或可能包括至少一个所述分析物的样品与所述试剂接触；及 ii. 累积地测量所述样品中的所述第一值，从而提供累积测量结果；及 d. 从所述团体获得所述累积测量结果； e. 基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在； 及 f. 将关于每个所述分析物存在或不存在的信息提供给所述团体。
68. -种检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的方法，所述方法包括： g. 从团体获得每个所述分析物的标识； h. 将每个所述分析物编码为至少一个第一值和至少一个第二值，其中，所述第一值是 来自信号的第一分量的值，且所述第二值是来自所述信号的第二分量的值，由此产生编码 方案，其中每个所述分析物在所述编码方案中由所述至少一个第一值和所述至少一个第二 值表示，其中所述编码以减少或者消除简并性的方式进行； i. 向所述团体提供如所述编码方案中表示的在每个所述分析物存在时产生所述至少 一个第一值和所述至少一个第二值的分析物特异性试剂，所述团体： i. 将包括或可能包括至少一个所述分析物的样品与所述试剂接触；及 ii.累积地测量所述样品中的所述第一值和所述第二值，从而提供累积测量结果；及 j. 从所述团体获得所述累积测量结果； k. 基于所述累积测量结果和所述编码方案，确定每个所述分析物是存在还是不存在； 及 l. 将关于每个所述分析物存在或不存在的信息提供给所述团体。
69. -种用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存在的组合物，所述组合物 包括分析物特异性试剂，每个试剂产生包括第一值的信号，其中所述试剂能够不执行固定 化、分离、或解链曲线分析而明确地检测单一样品体积中的、以存在或不存在的任意组合形 式的至少7个分析物中的每个分析物的存在或不存在。
70. -种用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存在的组合物，所述组合物 包括分析物特异性试剂，每个试剂产生包括至少一个第一值和至少一个第二值的信号，所 述至少一个第一值是来自所述信号的第一分量的值且所述至少一个第二值是来自所述信 号的第二分量的值，其中，当每个所述试剂仅产生一个第二值时，所述试剂能够检测单一体 积中的、以存在或不存在的任意组合形式的至少6个分析物中的每个分析物的存在或不存 在。
71. -种用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒 包括分析物特异性试剂、包装、及说明书，每个试剂产生包括第一值的信号，其中，所述试剂 盒能够不执行固定化、分离、或解链曲线分析而明确地检测单一样品体积中的、以存在或不 存在的任意组合形式的至少7个分析物中的每个分析物的存在或不存在。
72. -种用于检测多个分析物中的每个分析物的存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒 包括分析物特异性试剂、包装、及说明书，每个试剂产生包括至少一个第一值和至少一个第 二值的信号，所述至少一个第一值是来自所述信号的第一分量的值且所述至少一个第二值 是来自所述信号的第二分量的值，其中，当每个所述试剂仅产生一个第二值时，所述试剂盒 能够检测单一体积中的、以存在或不存在的任意组合形式的至少6个分析物中的每个分析 物的存在或不存在。
73. -种用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包 括盒体（601)、布置在所述盒体中用于放置瓶的卡接槽口、包括用于分析物的检测的探针的 瓶（602)、包括用于扩增的引物的瓶（603)、及包括用于扩增的试剂的瓶（604)，其中，所述 试剂盒能够不执行固定化、分离、或解链曲线分析而明确地检测单一样品体积中的、以存在 或不存在的任意组合形式的至少7个分析物中的每个分析物的存在或不存在。
74. -种用于检测多个分析物中的每个分析物存在或不存在的试剂盒，包括：盒体 (601) 、布置在所述盒体中用于放置瓶的卡接槽口、包括用于分析物的检测的探针的瓶 (602) 、包括用于扩增的引物的瓶（603)、及包括用于扩增的试剂的瓶（604)，每个探针产生 包括至少一个第一值和至少一个第二值的信号，所述至少一个第一值是来自所述信号的第 一分量的值且所述至少一个第二值是来自所述信号的第二分量的值，其中，当每个所述探 针仅产生一个第二值时，所述试剂盒能够检测单一体积中的、以存在或不存在的任意组合 形式的至少6个分析物中的每个分析物的存在或不存在。
【文档编号】C12Q1/68GK104271767SQ201380018760
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年2月1日 优先权日:2012年2月3日
【发明者】埃米尔·P·卡尔塔洛夫, 阿迪蒂亚·拉贾戈帕, 阿克塞尔·谢勒 申请人:加州理工学院