产生pha的基因工程微生物的制作方法

产生pha的基因工程微生物的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于一种天然产生PHA的微生物的基因工程形式，其与具有编码聚羟基烷羧酸酯(PHA)合成酶的至少一个基因的野生型微生物相比具有增加的拷贝数，并最终引起在24小时后微生物以与野生型相比至少1.2倍的量来过量产生中链长度的PHA或长链长度的PHA，其中用于评估过量产生的参考条件是含有15mM辛酸钠的经修改的MM培养基。另外，在微生物中PHA的产生可以被编码PHA降解中涉及的蛋白质的基因的失活有利地影响，这导致微生物的化合物增加的生产而没有随着时间的PHA含量的下降。本发明的微生物可用于PHA的商业生产。本发明还涉及用于产生PHA的方法。DSM2622520130409DSM2622420130409
【专利说明】产生PHA的基因工程微生物
[0001] 本发明涉及聚羟基烷羧酸酯（PHA)的生物合成领域。本发明尤其涉及具有编码 PHA合成酶的至少一种基因的基因工程微生物，与野生型微生物相比，其繁殖稳定且增加拷 贝数，其中，基因工程使微生物过量产生中链长度或长链长度的PHA。
[0002]PHA属于聚合物类型，其为由可再生资源生产的生物可降解的和生物相 容性的塑性材料（3-羟基脂肪酸的聚酯），可广泛的用于工业和生物医学应用 (Williams&Peoples, 1996,Chemtech26:38-44)。PHA通过多种细菌合成，并且由于其替代 常规的基于石油化学的塑料以保护环境免受塑料废物的有害影响的潜在用途而已经被广 泛地研宄。
[0003] 根据PHA的侧链长度和其生物合成途径，可将其分为两类。具有短的侧链的那些是 结晶热塑性塑料，例如PHB、（R)-3-羟基丁酸的均聚物，而具有长的侧链的PHA更具弹性。前 者已经知道约 70 年了（Lemoigne&Roukhelman, 1925,AnnDesFermentation, 527-536)，而 后者是相对近期发现的（deSmet等人，1983,J.Bacteriof. 154:870-78)。然而，在该命名之 前，已经识别了包含具有5至16个碳原子的较长侧链（R)-3-羟基酸单元和（R)-3-羟基丁 酸单元二者的生物来源的PHA(Wallen&Roweder1975,Environ.Sci.Technol. 8:576-79)。 已经识别了产生含有5至16个碳原子的一种或更多种长侧链羟基酸单元和 (R) -3-轻基丁酸的共聚物的多种细菌（Steinbuchel&Wiese, 1992,Appl.Microbiol. Biotechnol. 37:691_97;Valentin等人，1992,Appl.Microbiol.Biotechnol. 36:507-14; Valentin等人，Appl.Microbiol.Biotechnol. 1994,40 :710_16;Abe等人，1994,Int. J.Biol.Macromol. 16:115-19;Lee等人，1995,Appl.Microbiol.Biotechnol. 42:901-09 ; Kato等人，1996,Appl.Microbiol.Biotechnol. 45:363-70;Valentin等人，1996,Appl. Microbiol.Biotechnol. 46:261-67和美国专利号4876331)。这些共聚物可以被称为 PHB-co-HX(其中X为具有6个或更多个碳原子的烯羧酸酯（alkenoate)或3-羟基烷 羧酸酯）。特定的二元共聚物的一个有用例子为PHB-co-3-羟基己酸酯（PHB-C〇-3HH) (Brandi等人，1989，Int.J_Biol.Macromol.il: 49-45 ;Amos&McInerey，1991，Arch. Microbiol. 155:103-06 ;美国专利号 5292860)。
[0004]尽管由于PHA作为可再生资源用于生物可降解的热塑性塑料和生物聚合 物（如上述的）的潜在用途而已经对其进行广泛地研宄，并且已经商业开发和销 售（Hrabak, 1992,FEMSMicrobiol.Rev. 103:251-256)，但是其生产成本远高于常 规的基于石油化学的塑料的生产成本。这对其更为广泛的应用构成了主要障碍 (Choi&Lee, 1997,BioprocessEng. 17:335-342)。如上所述，许多细菌产生PHA，例如，真 养产喊杆菌（Alcaligeneseutrophus)、肥大产喊杆菌（Alcaligeneslatus)、掠色固氣 菌（Azotobactervinlandii)、嗜酸假单胞菌（Pseudomonasacitophila)、Pseudomonas oleovarans、大肠杆菌（Escherichiacoli)、富养红球菌（Rhodococcuseutropha)、紫色色 素杆菌（Chromobacteriumviolaceum)、酒色着色菌（Chromatiumvinosum)、泊库岛食焼菌 (Alcanivoraxborcumensis)等。在现有技术中已知所有这些产生PHA的细菌产生细胞内 PHA并且将其累积在PHA颗粒中（Steinbuchel，1991，Biomaterials，第 123-213 页）。
[0005] 与基于石油化学的塑料相比，使得PHA生产昂贵且因此不利的主要方面在于难以 高产率来生产材料和难以从累积PHA的细菌细胞中回收所产生的PHA。为了降低PHA的 总生产成本，据认为有效回收工艺的开发通常是必要的：其通常目的在于通过i)适当的溶 剂，ii)PHA的次氯酸盐提取和/或iii)非PHA细胞材料的消化进行的细胞破碎（Lee，199 6,Biotech,Bio-eng. 49:1-14)〇
[0006] 在工业规模上，可获得的微生物仍提供相对少的PHA，这使得利用这些微生物产生 PHA在经济上是不可行的。例如，在将恶臭假单胞菌U(PseudomonasputidaU)的野生型细 胞在经修改的包含辛酸钠（15mM)作为碳源的MM培养基中培养，在第一个24小时期间，在 微生物中仅累积了 24. 4%的PHA。现有技术中已知的用于基于PHA生产的微生物的所有方 法在生产期间需要大量水，以及用于PHA回收的化学试剂和/或酶，这是对降低生产成本的 障碍。因此，迫切需要用于PHA生产的替代策略。
[0007] 除了整体低的微生物的PHA生产之外，在特定培养阶段所累积的PHA的量开始减 少。这种减少的原因可以追溯至以下事实：微生物产生PHA作为食物储存材料，其在变化的 环境中作为快速能量来源和还原能力提供给细菌。所有独立生存的微生物实行某种碳源管 理到了可能的程度，而许多动物和植物通常调节碳源摄取以满足代谢需求，其他生物，尤其 是经受过可用碳源大幅波动的机会性环境微生物能够捕获过量的碳源并管理其利用，如一 方面通过消耗和生长，另一方面通过转化保存以储存聚合物。在可容易代谢的储存产品和 更加惰性的细胞内储存产品，在某种程度上还有细胞外存储产品之间的相互转化是该机制 的核心。甚至调节碳源摄取的生物体也利用这种相互转化用于微调它们的碳源管理以最优 化其细胞代谢网络和机体生理生态过程。
[0008] 如以上所提及的，PHA是微生物界中广泛利用的储存产品。为了允许微生物中以 PHA储存的碳源的利用，对生物而言至关重要的是在微生物需要额外的碳源时能够将PHA 转化成羟基烷羧酸酯（即，单体）。负责将聚合物转化为单独的单体单元的是PHA解聚酶。
[0009] 由于微生物含有负责PHA产生和降解的两种类型蛋白质，生物体确保其生存和发 展的关键问题是调节PHA合成酶与PHA解聚酶的相对量，这是通过酶的调节生成来确定的 (Uchino等人，2007;Ren等人，2009a;以及deEugenio等人，2010a, 2010b)。然而，迄今 为止，对控制聚合与解聚合过程的因子知之甚少。例如，仅敲除假单胞菌菌株中的PHA解聚 酶并不导致提高的PHA累积（Huisman等人，1991 ;Solaiman等人，2003)。因此，事实证明 仅消除负责PHA解聚的基因来有效地增加微生物中PHA的含量是不够的。
[0010] 增加微生物中PHA生成的不同途径是操控在微生物中负责PHA生成的PHA合成 酶。例如，已发现PHA基因的代谢工程是用于提高中链长度的PHA生成的良好策略。之前 的研宄试图通过phaCl的过表达来增加恶臭假单胞菌中的PHA产率（Kraak等人，1997 ; Prieto等人，1999;Conte等人，2006;Kim等人，2006;Ren等人，2009b)。然而，这些研宄 遇到了以下问题：含有PhaC的质粒在其对于生长不重要时丢失并且在细胞中施加不利影 响。结果，经修改的微生物经繁殖后不稳定，且丢失了负责PHA过量产生的遗传信息。在其 他情况中，得到了较少的PHA累积，因为启动子的高诱导性并不总是必然伴有高活性的基 因产物Oiederich等人，1994;Ren等人，2009) ?
[0011] 这些尝试不成功的原因可以在涉及微生物中PHA的生成、存储和降解的许多不同 蛋白质中找到。多数微生物具有多于一个的PHA合成酶，因此，增加一种合成酶的基因拷 贝数会使微生物耗尽对生成其他PHA合成酶重要的代谢物，这导致微生物中仅中等提高的PHA合成。
[0012] 此外，颗粒结合蛋白（phasin)在微生物中对PHA颗粒稳定起重要作用。例如， 颗粒结合蛋白控制PHA颗粒的数量和大小（Grage等人，1999)，其生成介于细胞质与PHA 颗粒疏水核心之间的中间相，由此防止各个颗粒聚结（Steinbuchel等人，1995 ;York等 人，2002)。还已经提出颗粒结合蛋白PhaF以及一些球形转录因子（如Crc)对PhaC活 性的调节是重要的（Prieto等人，1999b;Casta_neda等人，2000 ;essler&Witholt, 2001 ; Hoffmann&Rehm, 2005;Ren等人，2010)。P.putidaKT2440(Galan等人，2011)中的最近研 宄已经证明PhaF在颗粒分离中起重要作用，而甚至缺少这种颗粒结合蛋白使得细胞质中 的这些包含体结块。
[0013] 因此，这对修饰微生物提出了相当大的挑战：所述修饰使得微生物以显著程度过 量产生PHA，且同时确保导致过量产生的该修饰在微生物经繁殖后稳定，并且确保在PHA微 生物的操作中涉及的蛋白质都不被严重地影响以使得过度补偿期望的结果。对于目前所尝 试的多数途径，另外还难以找到PHA累积处于其峰值的精确时间点，且难以在PHA分解前回 收PHA。
[0014] 在W0 2007/017270A1中已经描述了一种途径，就这方面而言其在一定程度上已 经成功，其中泊库岛食烷菌已经通过消除类tesB基因而被修饰。该基因编码硫酯酶，硫酯 酶将（R)-3-羟基-酰基-CoA中间体转化成相应的酸。这是重要的副反应，其使微生物耗 尽对PHA合成而言重要的中间体。虽然这种途径由于实现较高的PHA累积而已经被证明在 一定程度上是成功的，但是有待观察是否经修饰的微生物具有需要的稳定性以允许成功实 施进入工业规模的PHA生产。
[0015] 另一个途径为过表达PHA合成酶如已经由Kim等人（2006,Biotechnol. Prog. 22:1541-1546)描述的在p.putidaKCTC1639 中的phaCl和phaC2。在该研宄中，将 另外的phaCl和phaC2基因的拷贝通过质粒引入微生物中，其中，所述基因不受启动子控 制。Kim等人描述了在经修饰的微生物中PHA合成酶的活性多于野生型的活性的1. 6倍。 虽然在过表达phaCl的微生物的情况下可以观察到增加的PHA生产（至多约0. 8g/l)，但是 过表达phaC2的微生物并未表现出相对于野生型而言增加了PHA产生。该观察可能是由于 phaC2合成酶的非活性形式的形成引起的。
[0016] 另外一个途径是将PHA合成酶基因插入微生物中，这在其野生型形式 中不产生PHA。例如，TO99/14313、DE44 17 169A1 或Qi等人（1997，FEMS Microbiol,Lett. 157:155-162)描述了将PHA合成酶基因引入大肠杆菌（Ecoli.)中。然 而，在这些经改造的微生物中，所生产的PHA的产率非常低，使得它们不适合PHA的工业生 产。
[0017]最后，Cat等人（2009,Biores.Technol. 100:2265-2270)已经报道了通过敲除 P.putidaKT2442.中的PHA解聚酶基因提高PHA生产。在该研宄中，在将微生物在高碳源 浓度例如12g/l存在下培养时，可以观察到PHA生产的增加。
[0018] 尽管有这些进步，但是仍存在对基因修饰的微生物的需求，所述基因修饰的微生 物具有增加的PHA过量产生且同时经繁殖后是稳定的，因为它们不会丢失为此目的而插入 的遗传信息。本申请满足这个需求。
[0019] 发明的简要说明
[0020] 本申请的一个目的是提供基因工程微生物，其中在微生物中负责中链长度的PHA 或长链长度PHA的过量产生的遗传信息经繁殖后是稳定的。本发明的另一个目的是修饰微 生物，使得避免暴露于培养基一定时间后PHA下降，并且同时增加PHA累积的百分比。另外， 本申请的另一目的是修饰微生物，使得防止在已经累积PHA之后发生显著的PHA降解。
[0021] 本发明基于以下发现：通过修饰产生PHA的微生物以使得它们与具有编码PHA合 成酶的至少一个基因的野生型微生物相比增加的拷贝数可以实现这些目标。优选地，在另 外的拷贝中存在的基因编码phaC2或其同系物。当在本申请中使用该术语时，野生型微生 物是指当微生物在自然界中出现时的典型形式。优选地，天然形式的野生型微生物包含编 码PHA合成酶的至少一种基因。
[0022] 术语"同系物"在本申请的实践中定义为基本上具有相同的功能但是具有不同 (尽管相似）的亲本肽序列和结构的蛋白质或肽。本申请的上下文中，术语"同源百分比" 和"序列相似度"可互换地使用。在本申请的实践中，优选同系物相对于亲本肽应当具有 至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、最优选至少95%的序列一致性。用 于比较两个序列的数学算法的一个优选非限制性实例是Karlin等人的算法（1993,PNAS 90:5873-5877)。将该算法引入NBLAST程序中，该程序可以用于识别相对于本发明的核酸 序列具有期望的一致性的序列。
[0023] 因此，本申请的一个主要方面是天然的产生PHA的微生物的基因工程形式，其与 具有编码PHA合成酶的至少一种基因的野生型微生物相比具有增加的拷贝数，其中所述增 加的拷贝数提供均衡性的所述PHA合成酶的过量产生，并最终使微生物在24小时后以与野 生型相比至少1.2倍的量过量产生中链长度的PHA或长链长度的PHA，其中用于评估过量产 生的参考条件是含有15mM辛酸钠的经修改的MM培养基。在一个优选实施方案中，基因工 程微生物经繁殖后是稳定的且优选地与具有编码PHA合成酶的至少一个基因的野生型微 生物相比具有另一个拷贝。
[0024] 已经出乎意料地发现，这些基因修饰的微生物允许由便宜且容易获得的原料高成 本效率地产生PHA，所述原料包括来源于植物脂肪和植物油的脂肪酸。已经观察到本发明微 生物提供高的PHA峰值浓度，根据培养条件，甚至在一些情况下在仅24小时后达到峰值浓 度。此外，本发明微生物表现出高的遗传稳定性并且融合微生物中的多个PHA颗粒以形成 单个PHA颗粒。这进而大大地简化了从微生物中回收PHA，因为它们可以用非氯化溶剂如丙 酮提取，并具有与用氯化溶剂提取相当的产率。
[0025] 术语"基因工程的"（或基因修饰的）是指人工操控本发明的微生物、其基因和/ 或基因产物（多肽）。
[0026] 优选地，本发明微生物经繁殖后是稳定的。"经繁殖后稳定"（如该术语在本申请 的实践中应当被理解的）是指，生物体在经过多倍（例如5或更高倍数）繁殖周期后保持 遗传信息且不丢失遗传信息。
[0027] 如以上所述的，本发明微生物优选经繁殖后是稳定的，这意味着在繁殖和/培养 的微生物中保持了基因修饰。除了这种稳定性之外，优选的是微生物不需要抗生素的压力 来保存基因修饰。这种微生物对于PHA生产是高度有利的，因为可以省略抗生素的添加，从 而消除了抗生素污染PHA的风险。在本申请的一个优选实施方案中，本发明微生物由此在 繁殖和/或培养期间保持其基因修饰，而与受抗生素的存在或不存在无关。
[0028] 术语"均衡性过表达"是指过表达为使得以小于由增加的拷贝数可预期的量产生 由过表达产生的蛋白质。例如，如果野生型包含基因的一个拷贝而基因修饰的微生物包含 两个拷贝，可以预期基因修饰的微生物产生与野生型相比约两倍的蛋白质。蛋白质的量可 以由生长期的微生物中的固有PHA合成酶的活性来估算。术语均衡性过表达意思是：过表 达优选地仅导致24小时候生长期中的固有PHA合成酶活性相对于野生型微生物而言增加 至多0. 6倍，优选至多0. 5倍，更优选至多0. 35倍，最优选至多0. 2倍。
[0029] 通过使用"均衡性过表达"，确保了没有大量无活性蛋白质形成。例如，蛋白质的大 量的（或不均衡的）过表达可导致形成包涵体，其以非活性形式并作为不溶解的蛋白质包 含蛋白质。因此，尽管过表达了蛋白质，但观察不到增加的蛋白质活性。确保均衡性过表达 的一种方法是利用渗漏启动子（leakypromoter)系统，其即使在诱导物不存在的情况下也 使蛋白质产生受抑制。
[0030] 在本申请的一个优选实施方案中，过量产生至少部分是由增加的编码PHA合成酶 的至少一个基因的拷贝数引起的。在另一个优选实施方案中，微生物含有多于一个拷贝的 基因是编码PhaC2合成酶的基因。在本发明的实践中已经发现，插入phaC2基因或其同系 物的多拷贝与有益效果相关，特别地phaC2的超表达涉及PHA颗粒的形态变化，其看上去聚 结在一起，尤其在对数生长相期间如此。
[0031] 此外，据认为在渗漏启动子控制下的PhaC2合成酶基因的多拷贝的插入影响PHA 代谢中涉及的其他蛋白质，以使得微生物的整体PHA生产和存储系统不受负面影响。
[0032] 在另一个优选实施方案中，PHA合成酶基因的表达因此受渗漏启动子系统调节。渗 漏启动子系统允许启动子控制的基因的转录，但是与系统中启动子用相应活化剂激活的系 统相比具有被抑制的效率。渗漏启动子系统优选是基于蛋白质的启动子系统，更优选是17 聚合酶/I7聚合酶启动子系统。在一个甚至更优选的实施方案中，在17聚合酶/I7聚合酶 启动子系统中17聚合酶的产生包含能够在暴露于小分子后诱导形成17聚合酶的诱导物。 这种系统具有增加的益处：其通过添加导致诱导17聚合酶形成的小分子可以选择性触发 17聚合酶的产生。然后这进而触发PHA合成酶产生。在一个特定的优先实施方案中，小分 子是3-甲基-苯甲酸酯。
[0033] 天然地产生PHA的微生物的一个高度优选的创造性基因工程形式是在莱布尼兹 研宄所DSMZ德国微生物和细胞培养物保藏中心以DSM26224保藏（保藏日期为2013年4 月9日）的假单胞菌属的基因工程形式，其在下文中将被指定为PpU10-33。
[0034] 在本申请的实践中进一步优选的是，其与具有编码PHA合成酶的至少一个基因的 野生型微生物相比，除了增加的拷贝数之外，基因工程微生物还在编码PHA降解中涉及的 蛋白质的至少一个基因中含有至少一个修饰。已经发现在微生物中这样的修饰组合导致对 所观察的PHA累积的协同效应。在一个优选的实施方案中，在所述微生物中编码PHA降解 中涉及的蛋白质的至少一个基因中的至少一个修饰导致所述基因完全或部分失活，优选地 导致所述基因完全失活。这种微生物也称为敲除相应基因的微生物。
[0035] 基因敲除突变体可以通过本领域技术人员已知的任意合适的方法制备。然而，优 选的是基因的完全或部分失活是通过双重组交换事件途径实现的。
[0036] 在一个特定优选的实施方案中，PHA降解中涉及的蛋白质是PHA解聚酶，优选地是 PhaZ或其同系物。另外，优选的，基因工程微生物中编码PHA降解中涉及的蛋白质的基因含 有至少一个修饰，其仅含有在所述微生物中编码PHA降解中涉及的蛋白质的单个基因，其 即，仅修饰该基因。换言之，优选的是微生物不含有可以取代所述微生物中PHA降解中涉及 的酶的任何其他酶。
[0037] 天然地产生PHA的微生物的一个高度优选的创造性基因工程形式是在莱布尼兹 研宄所DSMZ德国微生物和细胞培养物保藏中心以DSM 26225保藏（保藏日期为2013年 4月9日）的假单胞菌属的基因工程形式，其中所述的天然地产生PHA的微生物包含编码 PHA合成酶的基因的多拷贝和失活的phaZ基因二者。该微生物在下文中将被指定为PpU 10_33_ AphaZ〇
[0038] 典型的羟基酸单元聚酯（PHA)含有具有5至6个碳原子的侧链羟基酸单元 [(R)-3-羟基酸单元]。在本发明的实践中，术语"长链长度的PHA"意在涵盖每个单体（分 子）含有至少12个碳原子、优选地至少14个碳原子的PHA，而5至12个碳原子的意在用 "中链长度的PHA"表示。在一个优选的实施方案中，基因工程微生物过量产生中链长度的 PHA〇
[0039] 在本发明的一个特别优选实施方案中，基因工程微生物是由基因工程引起的，即， 例如，插入与具有编码PHA合成酶的至少一个基因的野生型相比增加的拷贝数，和/或在编 码所述微生物中的PHA降解中涉及的蛋白质的至少一个基因中插入至少一个修饰，以在24 小时后与野生型相比以至少1.2倍（重量）、优选至少1.5倍（重量）以及特别地至少2倍 (重量）的量过量产生PHA，其中用于评估过量产生的参考条件是含有15mM辛酸钠的修改 丽培养基。
[0040] 形成本申请的基因工程微生物的基础的微生物不受任何方式限制，只是该微生物 必须具有编码PHA合成酶的至少一个基因。优选地，微生物还应当具有编码在所述微生物 中PHA降解中涉及的至少一个基因、更优选单个基因。
[0041] 根据本发明的创造性微生物优选地选自产生PHA的细菌，特别地选自恶臭假单胞 菌、绿胺假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)、丁香假单胞菌（Pseudomonassyringae)、 焚光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens)、嗜酸假单胞菌（Pseudomonasacitophila)、 Pseudomonasolevarans、热液海源菌（Idiomarinaloihiensis)、泊库岛食烧菌、不动 杆菌属（Acinetobactersp.)、新月柄杆菌（Caulobactercrescentus)、真养产喊杆菌 (Alcaligeneseutrophus)、肥大产碱杆菌（Alcaligeneslatus)、棕色固氮菌、富养红球 菌（Rhodococcuseutropha)、青紫色素杆菌（Chromobacteriumviolaceum)或酒色着色菌 (Chromatiumvinosum)。根据本发明的一个特别地优选的微生物是恶臭假单胞菌菌株，更 优选地是恶臭假单胞杆菌U。
[0042] 已经观察到，本发明的微生物在不存在诱导物分子的情况下表现出PHA合成酶的 过量产生。出乎意料地，通过非诱导的微生物的PHA产生匹配或甚至超过用诱导物处理的 相同微生物的PHA产生。这表明经诱导的微生物可以超越过表达的PHA合成酶的最佳量，这 导致形成合成酶的非活性形式例如包涵体或不溶解的形式。因此，本发明的另一方面是如 上所述的基因工程微生物，其中所述微生物能够在没有添加诱导物分子的情况下产生PHA。 这对于工业规模的PHA生产具有优势，因为可以省去昂贵的诱导物和来自生产工艺的潜在 污染风险。
[0043] 还已经出乎意料地观察到，本申请的微生物生产与野生型相比具有不同形貌的 PHA，因为各个细胞均产生减少的PHA数目或者甚至仅单个PHA颗粒。因此，本申请的另一 方面是如上所述的基因工程微生物，其中所述微生物与野生型细胞相比每个微生物能够产 生减少数目的细胞内PHA颗粒，优选地为单个细胞内PHA颗粒的形式。据认为单个颗粒的 形成与减少的PHA稳定化酶的量相关，这简化了PHA分离与纯化。
[0044] 还出乎意料地观察到本申请的微生物产生PHA更快且在某些情况下在长的时间 内维持高水平的累积PHA。因此，本申请的另一方面是如上所述的基因工程微生物，其中所 述微生物在暴露于含有辛酸钠的经修改MM培养基24小时后能够产生最大含量的PHA，并且 优选地也能够在最初24小时累积期后至少48小时的时间内将PHA含量维持在最大PHA含 量的±20重量％范围内，其中用于评估PHA产生的参考条件是含有15mM辛酸钠的修改丽 培养基。
[0045] 本发明的另一方面涉及用于产生PHA的方法，其包括以下步骤：
[0046] a.培养本发明的微生物或细胞和
[0047]b.从培养基中回收PHA。
[0048] 用于在合适的条件下培养微生物或细胞的标准方法是现有技术中众做周知的。例 如，参见以下实施例、材料以及Sambrook&Russel1 (2001)。PHA可以通过常规程序从培养基 中回收，所述程序包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，沉淀或过滤成分（PHA)，随后 纯化，例如通过层析程序如离子交换、层析、亲和层析或相似的本领域认可的程序来纯化。
[0049] 优选的是在上述过程中的PHA是利用具有3至8个碳原子的酮、优选用丙酮提取 的。与提取溶剂无关，提取优选在60°C或更低的温度下、优选在20至40°C进行。
[0050] 在本申请的一个特别优选的实施方案中，方法不涉及或不需要添加诱导物分子 来引发PHA过量产生和/或过量产生PHA合成酶。此外，在本申请的实践中不必要在抗 生素存在下培养本发明的微生物，原因是已经出乎意料地发现所微生物中所引入的修饰 是稳定的，即使在不存在抗生素的情况下也是如此。这种抗生素包括但不限于亚碲酸盐 (Tellurite)、利福平（Rifampicin)和卡那霉素（Kanamycin)。
[0051] 作为用于上述过程的碳原料，可以利用容易获得的且便宜的可得自植物脂肪和植 物油的脂肪酸。这种脂肪酸的优选实施例包括饱和羧酸例如己酸、庚酸、辛酸和葵烯酸，以 及不饱和脂肪酸例如1-^^一碳烯酸、油酸或亚油酸。此外可以将多元醇用作原料，例如优 选甘油。
[0052] 本发明的另一方面涉及本发明的微生物、核酸、载体和/或细胞用于过量产生 PHA、尤其是中链长度PHA和/长链长度PHA的用途。
[0053] 附图简要说明
[0054] 图1.以下细胞的电子显微照片：PpU(a-c);未诱导的PpU10-33细胞（d-f)和经 诱导的PpU10-33细胞（g-i);未诱导的（j-1)和经诱导的（m-o)AphaZ-PpU10-33细胞。 培养物在含有35mM辛酸钠作为碳源的修改MM培养基中生长（以15mM和20mM两次给予） 并在31小时（&、(1、8、」、111)、48小时〇3、6、11、111)和72小时（〇、厂1、1、〇)取样。
[0055] 图2.pha基因的表达和P.PutidaU中PHA的累积。各柱状图显示PpU(各个编号的 第一列）、非诱导的PpU10_33((a)和（c)中各个编号的第二列）、经诱导的PpU10-33((a) 和（c)中各个编号的第三列）、非诱导的AphaZ-PpU10_33((b)中各个编号的第二列）和经 诱导的AphaZ-PpU10-33((b)中各个编号的第二列）中pha基因表达的归一化倍数增长。 在图（c)中，还以带圆点的直线（PpU)、下方的带三角形的虚线（经诱导的PpU10-33)、圆 点（非诱导的PpU10-33)、上方的带三角形的虚线（非诱导的AphaZPpU10-33)以及带 矩形的虚线（经诱导的AphaZPpU10-33)显示PHA浓度。
[0056] 图3.P.putidaU中用于超表达phaC2的基因组织的两部分系统。该图显示被整 合进染色体的两个载体：pCNBlmini_Tn5xylS/Pm: :T7pol和pUTminiTn5-Tel_T7phaC2。
[0057] 图4.以下微生物中随着时间的PHA产生：野生型PpU(方形）以及非诱导的基因工 程构造PpU10-33(实心环形）、经诱导的PpU(空心环形）、非诱导的AphaZ-PpU10-33(实 心矩形）和经诱导的AphaZ-PpU10-33(空心矩形）。
[0058] 图5.在存在和不存在相应抗生素的情况下，当在作为底物的辛酸盐（20mM)和 MM+0. 1%YE培养基中培养时，PpU和PpU10-33-AphaZ的生物量和PHA产率。结果是指 复制数。
[0059] 在下文中，通过实施例的方式进一步说明本申请，但是所述实施例无意于以任何 方式限制本申请的范围。 实施例
[0060] 实验步骤
[0061] 在本工作中所使用的微生物和载体、细菌菌株、突变体和质粒汇总于附录1中。
[0062] 培养基条件
[0063] 除非另有说明，大肠杆菌和恶臭假单胞菌在LuriaMillerBroth(LB)中培养并分 别在37°C和30°C下孵育。在需要的情况下，向培养基中加入的抗生素如下：利福平（Rf，固 体培养基中20ygmr1，液体培养基中5ygmr1)、卡那霉素（Km，固体培养基中25ygmr1， 液体培养基中12. 5ygml-1)、氨苄青霉素（Ap，100ygml-1)、亚碲酸盐（Tel，100ygml-1)、 庆大霉素（Gm，30iigmr1)、氯霉素（Cm，30iigmr1)、异丙基-0-D-硫代半乳糖苷（IPTG， 70yM)和5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-0 -D-半乳糖苷（XGal，34ygmr1)。
[0064]DNA操控
[0065] 所有的基因程序按Sambrook&Russell(2001)所描述的进行。利用相应的Qiagen 试剂盒（德国）按照制造商的使用说明进行基因组和质粒DNA的提取、琼脂糖凝胶纯化和 PCR清洗。在本工作中使用的所有DNA修饰酶（限制性内切酶、DNA连接酶、碱性磷酸酶 等）均购自NEB(美国马萨诸塞州）。聚合酶链式反应（PCR)在Eppendorfvapo.protect ThermalCycler(德国）中进行。50y1PCR反应混合物由以下成分组成：2y1经稀释的 染色体DNA(50ygmrllXPCR缓冲液和 2mMMgCl2(PROMEGA(：〇.，旧六）、0.211河的各引 物（Eurofinsmgw操纵子）、0.2mMdNTPs(Amersham，GEHealthcare,英国）、1.25UGo-Taq 热启动聚合酶（PROMEGACo.，美国）。PCR循环条件为：起始步骤96°C/10分钟，随后为 96°C/30秒至60°C/30秒、72°C/1分钟的30个循环，最后补充72°C/5分钟。通过三亲本杂 交实验将质粒转移到假单胞菌菌株（Selvaraj&Iyer，1983 ;Herrero等人，1990)完成。简单 地说，将带有自杀质粒pCNBlmini_Tn5xylSPm: :T7pol或pUTminiTn5_Tel-phaC2 的E.coli CC18Apir供体菌株、E.coliRK600辅助菌株以及假单胞杆菌受体菌株分别培养8小时， 以0. 75:1:2的比例混合，用LB清洗两次。在硝化纤维素滤器上收集悬浮液，并于30°C在 LB板上孵育过夜。然后将在滤器上生长的细菌重悬于3ml无菌盐溶液（NaCl0.9%)中， 并将连续稀释液接种于补充以相应选择抗生素的LB琼脂。将板于30°C孵育过夜，通过PCR 确认在板上生长的转化结合子克隆。
[0066]DNA测序
[0067] 利用一组特定的寡核苷酸或通用引物M13F和M13R进行用于测序的PCR反应（附 录3)。10y1反应混合物由6-12ng纯化的PCR产物（或200-300ng质粒）、2y1BigDye ReadyReactionMix、lylBigDye测序缓冲液和lyl特异性引物（25yM)组成。循 环条件包括：起始步骤96°C/I分钟，随后96°C/20秒-52°C-58°C/20秒-60°C/4分钟 的25个循环，和60°C/I分钟的最后补充步骤。用双脱氧链终止法确定核苷酸序列（Big DyeTerminatorv3.1 试剂盒，AppliedBiosystems，美国福斯特市）。用QiagenDyeEx 2.0SpinKit(德国）纯化PCR产物。将团粒重悬于20yl水中，然后加载到ABIPRISM 3130遗传分析仪（AppliedBiosystems，美国加利福尼亚州）。将所获得的部分序列与非 冗余核苷酸数据库中的已知序列比对（www.ncbi.nlm.nih.gov)。利用Softberry(http:// linuxl.softberry.com/egi-bin/programs/gfindb/bprom.pi) >Prom-Scan(http: // molbiol-tools.ca/promscan/)和PDBG在线http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter,html)；以及Arnold(http://rna.igmors.u-psud.fr/toolbox/amold/index. php#Results)生物信息学工具来识别潜在的转录启动子区域和端子。
[0068] phaC2超表达菌株PpU10-33的设计和构造
[0069]PpU10-33是恶臭固氮菌U衍生的，其中用17聚合酶启动子：!7聚合酶系统来驱动 phaC2基因表达的额外拷贝。17聚合酶系统由两个染色体整合的盒组成：一个含有从17聚 合酶启动子表达的phaC2基因，另一个含有17聚合酶基因，该基因从Pm启动子表达且受来 源于T0L质粒的同源苯甲酸酯/苯甲酸酯可诱导的XylS调节因子调节。phaC2盒构造如 下：将P.putitaU的phaC2 基因从pBBRlMCS-3-phaC2 质粒中切除（Arias等人，2008)，克 隆进pUC18N〇tI/I7载体（Herrero等人，1993)，并通过测序确认基因的正确取向。然后将 phaC2基因和T7启动子作为盒转移进入pUTminiTn5_Tel载体中（Sanchez-Romero等人， 1998)。首先，通过滤膜接合法将miniTn5衍生物pCNBlxylS/Pm: :I7pol转移至P.putida U，然后通过Km选择标记物进行选择（Harayama等人1989 ;Herrero等人，1993)。由于转座 子在基因组中的整合基本上是随机的，并且不同插入位点可显著地影响被插入的基因的转 录水平，所以准备了约100个转移结合子的池用于第二次转移。将该池的5mLLB培养物孵 育3小时（30°C，180rpm)，并使用受体的池用于pUTmini-Tn5-Tel-I7phaC2构造的转移。通 过当转移结合子转化亚碲酸盐（选择标记物）时其显示的黑色容易地对转移结合子计分， 随后通过PCR确认。随后针对PhaC2和PHA(结果）的水平对两个盒的插入位点不同的最 终受体计分，选择最好的并将其指定为PpU10-33。
[0070]PpU10-33中phaZ的敲除与互补
[0071]通过利用 1983 年Quant&Hynes和 1991 年Donnenberg&Kaper描述的方法完成phaZ 基因的删除，其涉及双重组事件和通过致死sacB基因的表达来选择所需要的突变体。首 先，通过GENERTAG(德国）合成在phaZ基因附近含有ORFs的DNA，其编码PHaCl和PhaC2合 成酶；随后将该基因克隆进含有Gm和SacB选择标记物的PJQ200SK载体。然后将杂交质粒 通过三亲本杂交引入PpUlO-33菌株。在含有Gm+km和Tel的板上选择其中质粒通过单交换 整合进入染色体中的转移结合子，并通过PCR确认。随后在有10%蔗糖的LB板上选择来源 于第二次重组的删除突变体，对针对Gm的敏感度计分，并通过PCR进一步分析以确认删除 的位置和程度。为此，使用了在用于同源重组的片段之外或之内退火的两个不同启动子组， 名称分别为PhaCl-check-F/PhaC2-check-R和RT-phaZF_PpU/RT-phaZR_PpU。选择了一 个删除突变体并指定为AphaZPpU10-33。为了删除突变体的互补，通过PCR(phaZ-F-KpnI lphaZ-R-Xbal)将phaZ基因（921bp)扩增，然后克隆进入pBBRlMCS-5载体中。针对其Gm 抗性选择转移结合子并进一步通过PCR确认。
[0072] 焚光显微镜法
[0073] 在1. 5ml微量离心管中将1毫升培养物与2滴尼罗红二甲亚砜（0. 25mg/ml)溶 液混合，于4°C以6500转每分钟离心5分钟。用2mlMgCl2(10mM)洗沉淀物两次，重悬于 500y1溶液中，将5-10y1细胞悬浮液放置在显微镜载玻片上。利用装备有Cy3滤镜（EX 8? 550/25,85?1 570，已]\18? 605/70)(2￡155，>的，德国）和六叉1〇￥181〇11代14.6.3软件 的ZEISSAxioImagerA1落射荧光显微镜可以看到PHA颗粒的存在和形貌。以1. 1秒的 曝光时间使细胞成像（Bassas等人，2009)。
[0074] 透射电子显微镜法
[0075] 在4°C下，在生长培养基中用2%戊二醛和5%甲醛固定细菌，用二甲砷酸盐缓冲 液（0. 1M二甲砷酸盐，0. 01MCaCl2,0. 01MMgCl2,0. 09M蔗糖，pH6. 9)冲洗，在室温下用 1% 锇水溶液锇化1小时。然后将样品在分级系列丙酮（10%、30%、50%、70%、90%、和100% ) 中脱水，每个步骤30分钟。70%丙酮脱水步骤包括2%醋酸双氧铀，并且执行过夜。利用 根据用于固体树脂的Spurr配方的环氧树脂浸润样品，所述环氧树脂为一种用于电镜的低 粘度环氧树脂包埋介质（Spurr，1969)。用纯树脂的浸润进行数天。用金刚石刀切成超薄 切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅复染，在TEM910透射电子显微镜（CarlZeiss，德国）中以 80kV加速电压检查。利用线复制品以带刻度的放大倍率拍摄图像，并用具有ITEM-软件 (OlympusSoftImagingSolutions,德国）的慢速扫描CCD-Camera(ProScan,l〇24xl〇24, Scheuring,德国）数字化地记录。
[0076]RNA操控
[0077] 从生长阶段过程中（处、711、2411、2711、3111、4811和5511)的培养物中取样品（31111)并 立即与等体积的RNA保护缓冲液（Qiagen，德国）混合。室温下孵育5分钟后，将悬浮液以 13000转每分钟离心，弃去上清液，将沉淀物在-80°C保存。利用包括脱氧核糖核酸酶处理 的RNeasy迷你试剂盒（Qiagen，德国）按照制造商的使用说明提取总RNA。最后，在100y1 不含核糖核酸酶的水中洗脱RNA并保存在-80°C。RNA的完整度通过甲醛琼脂糖凝胶电泳评 估，浓度和纯度通过分光光度计确定（分光光度计ND-100，peQIab-bi〇techn〇l〇gieGmbH， 德国）。
[0078]cDNA利用10yg总RNA和随机引物在20y1反应体系中进行。所有试剂（包括 SuperscriptIIIRT)购自Invitrogen(USA)且反应根据制造商的方案进行。将其中未添 加SuperscriptIIIRT的样品用作阴性对照。在cDNA合成后，用1MNaOH将残留的RNA 沉淀，以65°C孵育10分钟，随后在25°C孵育10分钟。立即用KC1 1M平衡反应。然后利用 PCR纯化试剂盒（Qiagen)将产生的cDNA纯化，用分光光度计测量浓度和纯度。用DEPC水 将cDNA稀释至100ng/y1并在4°C保存。
[0079] 相对RT-PCR分析
[0080]借助于引物 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)和OligoCalc(http:// www.basic,northwestern,edu/biotools/oligocalc.html)生物信息工具设计用于RT-PCR 分析（EurofinsmgwOperon,德国）的寡核苷酸，该寡核苷酸汇总于附录2。各个组设计 成具有相似的G+C含量，因此具有相似的退火温度（约60°C)，并具有大小不长于300bp的 扩增子，不存在预测的发夹环、双链体或引物-去引物（dimmer)结构。按照用于实验设计 的MIQE指南（Bustin等人，2009)。首先，分析各组引物的最佳PCR条件，利用标准组样品 (染色体DNA)作为模板确定退火温度和引物浓度。通过熔点曲线分析和扩增条带的凝胶 可视化确定引物特异性。用cDNA池确定引物有效性并在五个点上进行连续的4倍稀释序 列以执行标准曲线。执行标准PCR方案，对每次稀释执行三次。在所有情况下，所测量的 有效性在89%至100%之间。对于该分析，使用了CFX96?实时PCR检测系统（Bio-Rad，美 国）和CFX管理软件（版本1. 5. 534. 0511，Bio-Rad)。鉴于良好的变异系数值和约0. 5-1 的M值，利用存在于CFS软件中的geNorm法并且考虑到在不同实验条件之间和时间点之间 的目标稳定性来选择用于数据归一化的适宜参考基因。测试了数个候选基因，包括"管家" 基因0^1)、在一般代谢中涉及的其他基因（8]^、83口-141'〇(：141'〇02)、细胞分裂（1]1^13、 ftsZ)或信号功能（ffH)，最后选择gltA和pr〇C2作为参考基因。对于相对RT-PCR，为了 数据归一化，执行实验的三个重复，包括总是在各个板中的内部校准器。将没有cDNA的样 品用作阴性对照。PCR反应含有 12. 5yl的iQ?SYBRGreenSupermix(2X) (Bio-Rad，美 国）、lyl正向引物（10yM)、lyl逆向引物（lOyM)、2yl〇0嫩(1/10稀释），并用至多 20y1的milliQ水进行反应。PCR循环条件为：50°C/2分钟和95°C/10分钟，随后95°C/15 秒-60°C/30秒-72°C/30秒，40个循环，最后补充72°C/10分钟。在各个循环结束时测量 荧光。对于熔点曲线，设定初始变性步骤在95°C/10分钟，随后以0. 5°C/5秒从65°C增加 到95°C，然后继续信号采集。用采用均数的标准偏差和归一化表达方法（AA(Ct))的CFX 软件（Bio-Road，美国）计算目标基因的相对表达比例。以表达的归一化倍数增长来表示数 值。
[0081] 用于PHA产生的培养条件
[0082] 将3-苯甲酸甲酯（3-MB)作为用于通过Pm启动子激活XylS转录激活因子的诱导 物，所述Pm启动子驱动17聚合酶基因，其进而触发phaC2合成酶的表达。为了确定用于 PpU10-33中phaC2表达/PHA合成的最佳条件，在不同条件下提高3-MB(从0. 2至3mM)、 诱导次数（〇D55Clnm 0.4-1.5)和碳源浓度。用在具有20mM琥珀酸盐的MM琼脂板上30°C下培 养过夜的细胞悬浮液接种于含有400mlMM修改培养基（Martinez-Bianco等人，1990)加 上0. 1%酵母提取物、15mM辛酸钠以及合适的抗生素的锥形瓶。然后将锥形瓶以180转每 分钟在旋转振荡器（INFORSAG，瑞士）于30°C下孵育。一旦培养物0D55tol达到约0.8,将 培养物分成两份（1升锥形瓶中含有200ml)，然后向锥形瓶中的一个添加3-MB至最终浓度 0.5mM。同时，第二次加入辛酸钠（20mM)。对于野生型对照菌株，程序是相同的但是没有诱 导。每24小时收集一次样品并测定生物量（CDW，细胞干重）、PHA、0D55tol、尼罗红染色和NH4+ 浓度。对于CDW测定，样品在80°C干燥24小时，并以原始培养物的g/1表示。
[0083] PHA提取和纯化
[0084]将培养样品于 4°C以 6500xg离心 15 分钟（Allegra25R,BeckmanCoulter,美 国），在蒸馏水中清洗沉淀物两次，然后在-59°C和0. 140mbar下冻干（Lyophilizeralpha1-4LSC，Christ,德国）。从生长期取5ml样品以监测PHA产生并按如上所述冻干。如前 所述的，用l〇ml氯仿于80°C提取经冻干的生物量3小时（Basas-Galia等人，2012)。PHA 含量（重量％ )被定义为由PHA表示的CDW百分比。
[0085]NMR分析
[0086] 对于1H-NMR分析，将5-10mg聚合物溶解于0? 7ml的CDC13，使用5-10mg的聚合物 用于记录13C谱。在300K下在BrukerDPX-300NMR波谱仪上记录屯谱和13C谱，所述波谱仪 锁定于溶剂⑶(：13的氘共振。以相对于溶剂信号的ppm给出化学位移（屮：7. 26,13C77. 3)， 以Hz给出耦合常数。全部使用标准Bruker脉冲程序。
[0087] 检测PHA的分子量
[0088] 在具有色谱柱StyragelHR5E并装备有2414示差检测器（Waters，美国）的HPLC 系统中（Waters2695AllianceseparationsModule)，通过凝胶渗透色谱法测定平均分 子量。在45°C，以流速0. 5ml/分钟（等度的），用四氢呋喃（THF)作为洗脱剂。样品浓 度和进样体积分别为〇. 5mg/ml和50y1。利用聚苯乙烯标准物试剂盒获得分子量范围在 10000-700000g/mol的标准曲线。
[0089]PHA的热性能
[0090] 利用10_20mg用于分析的经纯化的聚合物，通过差示扫描量热法（DSC)测定微生 物聚醋的热性能，用DSC-30(MettlerToledoInstruments，美国）执行DSC分析。将样品 放置在铝盘上，在氮气条件下（80ml/分钟）以10°C/分钟从_100°C加热至400°C。所有数 据是通过STARe系统采集和处理软件（MettlerToledo)获得。
[0091] 实施例1 :恶臭假单胞菌U中phaC2的超表达
[0092] 设计了两部分的用于PpUPhaC2合成酶的基于微型转座子的超表达系统，其由以 下两部分构成：（i)特殊化的mini-Tn5,pCNBlxylS/Pm: :I7pol，其由XylS-3-苯甲酸甲醋 (3-MB)-调节的启动子Pm表达17聚合酶；和（ii)杂交pUT-miniTn5-Tel衍生物，其由T7 聚合酶启动子表达phaC2 (见图3)。两个微型转座子组件单独并随机地插入P.putidaU(下 文中为"PpU"）染色体中。在两轮筛选后选出最佳的PHA生产者，所述两轮筛选涉及通过细 胞蛋白的SDS-PAGE分离来半定量PhaC2生产，和通过尼罗红染色的细胞的荧光显微镜法检 查PHA颗粒形成。该菌株被指定为PpU10-33。
[0093] 在下文中，将非诱导培养物称作NI，将用0. 5mM的3-MB诱导的细胞成为I。分析 phaC2基因的剂量对重组菌株PpU10-33中PHA浓度的影响。培养物分别在具有辛酸钠的修 改的丽中生长，所述辛酸钠以15mM和20mM分两次给予（第二次是在诱导时给予）。对于两 个菌株PpU和PpU10-33均在48小时后达到峰值生物量生产（分别为3. 1和3. 2g1-1CDW)。 结果示于表1中：
[0094]表1 :菌株PpU、PpU10-33和PpU10-33-AphaZ的生物量产率
[0095]
【权利要求】
1. 一种天然产生PHA的微生物的基因工程形式，其与具有编码聚羟基烷羧酸酯（PHA) 合成酶的至少一个基因的野生型微生物相比具有增加的拷贝数，其中所述增加的拷贝数提 供所述PHA合成酶的均衡性过量产生，并且其中所述基因工程使所述微生物在24小时后与 所述野生型相比以至少1.2倍的量来过量产生中链长度的PHA或长链长度的PHA，其中用于 评估所述过量产生的参考条件为含有15mM辛酸钠的经修改的MM培养基。
2. 权利要求1中所述的基因工程微生物，其中所述基因编码PhaC2合成酶或其同系物。
3. 权利要求1或2中所述的基因工程微生物，其中所述PHA合成酶的表达由启动子系 统调节，所述启动子系统优选为基于蛋白质的，更优选为T7聚合酶/T7聚合酶启动子系统。
4. 权利要求1至3中任一项所述的基因工程微生物，其还在编码所述微生物中的PHA 降解中涉及的蛋白质的至少一个基因中具有至少一个修饰，其中所述修饰使编码所述PHA 降解中涉及的蛋白质的基因完全或部分失活，更优选地使所述基因完全失活。
5. 权利要求4中所述的基因工程微生物，其中所述PHA降解中涉及的蛋白质是PHA解 聚酶，优选地是PhaZ和其同系物。
6. 权利要求1至5中任一项所述的基因工程微生物，其中所述基因修饰在经繁殖和/ 或培养的所述微生物中被维持，优选地在不存在或存在抗生素的两种情况下均被维持。
7. 前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述基因工程使所述微生物在 24小时后与野生型相比优选地以至少1. 5倍的量、更优选以至少2倍的量来过量产生中链 聚羟基烷羧酸酯PHA，其中用于评估所述过量产生的参考条件为含有15mM辛酸钠的经修改 的丽培养基。
8. 前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物选自恶臭假单 胞菌、绿脓假单胞杆菌、丁香假单胞杆菌、荧光假单胞杆菌、嗜酸假单胞菌、Pseudomonas olevarans、热液海源菌、泊库岛食烷菌、不动杆菌属、新月柄杆菌、真养产碱菌属、肥大产碱 杆菌、棕色固氮菌、富养红球菌、青紫色素杆菌或酒色着色菌，优选为恶臭假单胞菌菌株，更 优选为恶臭假单胞杆菌U。
9. 前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物能够在没有添加诱 导物分子的情况下产生PHA。
10. 前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物能够产生为单个 细胞内颗粒形式的PHA。
11. 前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物在暴露于含有辛 酸钠的经修改的丽培养基24小时后能够生产最大的PHA含量，并且优选地也能够将在所 述最大的PHA含量±20重量％范围内的PHA含量维持至少48小时的时间。
12. -种用于产生PHA的方法，其包括以下步骤： a. 培养权利要求1至11中任一项所述的微生物；和 b. 从培养基中回收PHA。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述方法不涉及或不需要添加用以引发所述微 生物中的PHA过量产生和/或PHA合成酶过量产生的诱导物分子，和/或不涉及或不需要 添加用以防止丢失基因修饰的抗生素。
14. 根据权利要求12或13所述的方法，其中所述PHA是利用具有3至8个碳原子的 酮、优选丙酮在60°C或更低的温度下、优选地在20°C至40°C的温度下通过提取来回收的。
15.权利要求1至11中任一项所述的基因工程微生物用于过量产生中链长度PHA和/ 或长链长度PHA的用途。
【文档编号】C12N1/20GK104520433SQ201380019207
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年4月11日 优先权日:2012年4月11日
【发明者】萨格拉里奥·阿里亚斯, 莫尼卡·巴萨斯, 加布里埃尔·莫里纳瑞, 肯尼思·奈杰尔·蒂莫斯 申请人:赫姆霍尔兹传染病研究中心有限责任公司