用于从衍生自多能干细胞的细胞培养物中分离神经元的细胞表面特征物的制作方法

用于从衍生自多能干细胞的细胞培养物中分离神经元的细胞表面特征物的制作方法
【专利摘要】诸位发明人披露了提供用于直接从异质细胞培养物分离并纯化神经元的多种方法和系统。在多能干细胞中检查了各种细胞粘附分子的表达。这些分子中的一个或多个的表达变化与从非定向到神经细胞的细胞进展相关联。与针对CD200具有特异性的抗体相结合，使用针对这些分子的一种或多种抗体将使得能够从细胞群体中识别并分离神经元。
【专利说明】用于从衍生自多能干细胞的细胞培养物中分离神经元的细 胞表面特征物
[0001] 相关申请的交叉引用 根据美国法典第35部分119(e)条，本申请要求在2012年5月16日提交的美国临时专 利申请序列号为61/647, 951的申请日的优先权，将该申请的披露内容通过引用结合在此。

【技术领域】
[0002] 本发明涉及用于分离神经元的多种方法和组合物。
[0003] 发明背景
[0004] 人类胚胎干细胞（hESC)和人类诱导性多能干细胞（hiPSC)两者都具有分化成多 种体细胞的能力。因而hESC和hiPSC的分化给医疗发展、药物筛选、疾病模型、以及组织置 换提供了契机。然而，开发完善的条件来产生特定细胞类型的单纯群体对实现这些目标至 关重要。存在若干神经诱导方法，这些方法使用自发分化、化学诱导、或者小鼠基质饲养细 胞来诱导细胞培养物形成神经干细胞（NSC)。NSC可以通过人工分离与繁殖作为单层培养 延续很多代。原则上，这些细胞可以分化成神经元和神经胶质，为体内和体外试验无限供给 细胞。令人遗憾的是这些方法的稳健性会受到分离的NSC的批次间变异性的妨碍。此外， NSC的分化经常导致变异的和异质的神经元、神经胶质以及未分化的细胞的培养物，其能够 阻碍需要纯化或者界定细胞群体的下游应用，例如体内试验、移植、以及微型阵列。针对该 问题的一个可能的解决方案是识别在NSC、神经胶质、以及神经元上表达的细胞表面标志物 从而界定和纯化不同的细胞类型。
[0005] 已描述了细胞表面标志物表达用于通过荧光激活细胞分选法（FACS)从来自多个 物种的胚胎和成人组织识别和分离许多神经细胞类型。糖蛋白CD133在很多组织中是一种 已知的干/祖细胞标志物，并且已经被用于从人脑中分离NSC。碳水化物部分CD15,也被称 为阶段特异性胚胎抗原-1或者LeX，已经被用于从小鼠脑室下区（SVZ)中分离NSC和放射 状胶质细胞。⑶184, 一种G蛋白偶联受体，通过结合⑶15被成功地用于从小鼠胚胎前脑和 成体SVZ中分离NSC。⑶24是一种细胞粘附分子，其已经被用于通过FACS从小鼠大脑中分 离NSC。另外，已经使用神经干细胞标志物的基因启动子-报告子从人类大脑组织分离出神 经干细胞和神经祖细胞。
[0006] 同样地，通过FACS识别和分离hESC来源的神经细胞也有了进展。普路扎克 (Pruszak)等人（干细胞（Stem Cells) 25 :2257-2268, 2007)报告称可以利用细胞表面标志 物在不同发育阶段测验分化成为神经系的hESC培养物，并且可以使用CD56 (NCAM)的抗体 富集神经元细胞。⑶1847⑶326-标志物已经被用于从分化中的hESC纯化能够分化成神经 元的神经祖细胞。另外，佩赫（Peh)等人（干细胞与发育（Stem Cells Dev) 18:269-282， 2009)报告了基于⑶133,⑶15和GCTM-2的表达，自hESC神经诱导培养物富集形成神经球 的NSC。运用类似的策略，戈莱比瓦斯卡（Golebiewska)等人（干细胞27 :1298-1308, 2009) 曾使用⑶133+/⑶457⑶3407人分化中的hESC中分离NSC。普路扎克等人（2009)论证了 ⑶24,⑶15和⑶29作为表面标志物密码的用途，用于从hESC神经诱导培养物分离不同细 胞群体，包括NSC，以及成神经细胞和神经元的混合群体。
[0007] 袁（Yuan)等人（公共科学图书馆?综合（PLoS One. )2011. 03. 02 ;6 (3) :el7540) 描述了基于细胞表面特征物通过FACS分离多能干细胞的神经干细胞（NSC)、神经分化培养 物的方法，将其通过引用结合在此。这些方法被用于从hESC神经诱导培养物以及人类诱导 性多能干细胞（hiPSC)中分离一个为⑶1847⑶27Γ/⑶447⑶24+的NSC群体。基于细胞表 面特征物的方法还被用于富集来自多种常见神经诱导培养系统的NSC。袁等人还确定了细 胞表面特征物，用于从分离的NSC培养物的分离培养物中分离神经元和神经胶质。随后，一 个为⑶1847⑶447⑶15低（LOW) /⑶24+的神经元群体和一个为⑶184 7⑶44+的神经胶质 群体从分化中的NSC分离培养物中被纯化。BD Stemflow?神经细胞分离试剂盒（BD生物 科学公司（BD Biosciences)，圣何塞，加州）是一种被设计成允许从分化的NSC中分离衍 生自人类多能干细胞的神经干细胞（NSC)或者神经元和神经胶质细胞的试剂盒。该方法与 像人工分离这样的传统方法截然相反，其降低了 NSC分离群之间的变异量，但是需要在神 经元在培养物中分离和富集之前诱导和分离NSC。需要用于提供对衍生自异质细胞群体的 神经元的识别和分离，并且减少神经元识别、分离和富集所涉及步骤的方法。
[0008] 概述
[0009] 本发明提供了用于从异质群体细胞中分离或富集神经元的多种细胞表面特征物， 方法和系统。这些方法可以用于从一组新细胞表面蛋白（细胞表面特征物）的表达模式中 识别神经元。本方法使得能够分离或富集来自不同类型的细胞培养物的神经元，包括分化 中的多能干细胞（hPSC)的细胞培养物，例如人类诱导性多能干细胞（iPSC)和人类胚胎干 细胞（EPSC)，或者hPSC衍生的神经干细胞，以及已经被基因转导而转分化成神经元（诱导 神经元）的成纤维细胞培养物。
[0010] 在一些实施例中，提供了一种在一个包含神经元和神经胶质的细胞培养物中区分 神经元的方法，该方法包括用特异性结合到CD200的一个第一抗体和特异性结合到一个第 二蛋白的至少一个第二抗体接触该细胞培养物，其中该第二蛋白选自下组，该组由以下各 项组成：HLA-A、HLA-B、HLA-C、（HLA-A、B、C)CD49f、CD151 和 CD340 或其任意组合；并且检 测是^200+细胞的并且还展示出!11^-4、!11^-8、!11^-(：、^49厂^151和^340中的一个或 多个的低至阴性表达的细胞。在一些实施例中，该细胞培养物包括人类诱导性多能干细胞 (hiPSC)、人类胚胎干细胞（hEPSC)、成纤维细胞培养物、神经干细胞、神经上皮、神经玫瑰 结、神经祖细胞、或神经嵴细胞。在一些实施例中，该细胞培养物衍生自一个细胞异质混合 物。⑶200+细胞可以是⑶200巾等以及⑶200?并且不是⑶200?。在一些实施例中，该细胞 培养物包括不经历一个神经干细胞富集步骤的神经玫瑰结。检测细胞的步骤可以通过一个 流式细胞仪来进行。在一些实施例中，该第一和第二抗体是通过与一个荧光团的直接接合 可检测地和可辨别地标记的，该荧光团是例如异硫氰酸荧光素、别藻蓝素、多甲藻素叶绿 素蛋白、藻红素、菁蓝5或BV421。神经元可以通过分离或富集是⑶200 +#或⑶200s并且还 是HLA-A、B、C_，⑶49Γ，⑶15Γ或⑶340 _的细胞的细胞群体被分离或富集。在一些实施例 中，该在一个细胞培养物中富集神经元含量的方法包括在一个细胞培养物中诱导神经分化 从而形成神经元和神经胶质，用特异性结合到CD200的一个第一抗体和特异性结合到一个 第二蛋白的至少一个第二抗体接触该细胞培养物，其中该第二蛋白选自下组，该组由以下 各项组成：HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151和⑶340,及其任意组合；并且流式细胞计数 地选择是⑶200+细胞的并且还是HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151以及⑶340中的一个 或多个的阴性或低的细胞。在一些实施例中，从该神经玫瑰结直接诱导神经元形成。在一 些实施例中，是CD200+的细胞不是CD200 。在一些实施例中，该细胞培养物不经历一个神 经干细胞富集步骤。该第一和第二抗体可以是通过与一个荧光团的直接接合可检测地和可 辨别地标记的，该荧光团是例如异硫氰酸荧光素、别藻蓝素、多甲藻素叶绿素蛋白、藻红素、 BV421或菁蓝5。在一些实施例中，富集神经元的含量包括用对于下组中的至少一个具有选 择性的抗体接触来自一个细胞培养物的细胞，从而形成一个抗体-细胞复合物，该组由以 下各项组成：HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、和⑶340,其中这些抗体被附接到可以被 一个磁场吸引或排斥的一个表面上；并且通过向这些细胞施加一个磁场从该细胞培养物选 择性地分离所述抗体-细胞复合物。该富集可以大于4倍。
[0011] 在一些实施例中，一个细胞培养物与结合到⑶200的一个第一抗体和结合到 HLA-A，HLA-B或HLA-C的一个第二抗体（即HLA-A、B、C抗体）接触，并且方法进一步包括 将该细胞培养物与包括⑶49f、⑶151或⑶340的一个第三抗体接触并且针对是⑶200+和 HLA-A、B、或C_，并且还是⑶49Γ、⑶15Γ或⑶340 _的细胞进行选择。在一些实施例中，描述 了一种用于从衍生自多能干细胞中分离或富集神经元的系统，该系统包括：特异性结合到 CD200的一个第一抗体；特异性结合到一种蛋白的至少一个第二抗体，该蛋白选自下组，该 组由以下各项组成：111^4、!11^-8、!11^-(：、^49厂^151和^340，及其任意组合 ；一个包含 神经元的细胞培养物和一个流式细胞仪，该流式细胞仪被配置成用于分选是CD200+并且还 是HLA-A\HLA-B'HLA-(T、CD49r、CD15r和CD34(T中的一个或多个的细胞。该第一和第二 抗体可以是荧光标记的抗体。在一些实施例中，该第二抗体可以是一种磁标记的抗体。
[0012] 在一个实施例中，用于识别在神经分化培养物中的神经元的细胞表面标志特征物 是⑶200的高效表达，例如⑶200++或者⑶200 s，这两者在本文中可互换地使用以表明细胞 是⑶200+细胞并且具有高于平均⑶200信号的表达。在另一些实施例中，细胞可以通过排 除低效表达的CD200(CD200 is )细胞进行选择。在一些实施例中，用于识别神经元的该细胞 表面标志特征物是 HLA-A7HLA-B7HLA-C7CD15l7CD49f7CD3407CD200+。在一些实施例中， 描述了一种用于在一个细胞群体中识别神经元的系统，该系统包括：特异性结合到CD200 的一个第一抗体；特异性结合到包括HLA-A、HLA-B、和HLA-C的一组蛋白中的至少一种上 的一个第二抗体；特异性结合到包括⑶49f、⑶151和⑶340的一组蛋白中的至少一种上的 一个第三抗体；一个细胞样本；以及一个流式细胞仪，该流式细胞仪被配置成用于识别是 CD200+和 HLA-A、Β、(Γ，并且还是 0)49Γ、ΟΗ5Γ或 CD34(T的细胞。
[0013] 附图简要说明
[0014] 图1描述了现有技术中用于神经胶质和神经元富集的细胞分选法。
[0015] 图2示出了描述该发明的一个实施例中的步骤的流程图。
[0016] 图3阐明了本发明的一个实施例，是一种用于神经元富集的细胞分选法，该方法 无需富集神经干细胞（NSC)的中间步骤。
[0017] 图4描述了一个流程图，示出了一种免疫表型筛选途径，该途径用于识别一个用 来分离衍生自分化中的多能干细胞培养物中神经元的细胞表面特征物。
[0018] 图5A和B描述了在图4的筛选途径中识别出的细胞内标志物和候选细胞表面标 志物的荧光谱。
[0019] 图6阐明了用于识别神经元的门控策略，用来进行细胞分选。
[0020] 图7示出了分选之前的神经分化培养物的影像，阐明了细胞培养物的异质性。
[0021] 图8示出了使用本发明的细胞表面标志特征物分选自异质细胞培养物的神经元 的影像。
[0022] 图9A示出了被分选的神经元针对神经元的标志物β -III微管蛋白以及NSC标志 物巢蛋白被染色的影像，其示出了这些细胞纯度高。图9Β示出了分选之前和之后的被分选 的神经元的培养物的半定量流分析。
[0023] 图10A-D示出了一系列在已分化的神经元的流式细胞术分析期间生成的2D图和 直方图。
[0024] 图IlA-D示出了在荧光激活细胞分选之前和之后一系列在已分化的神经元的流 式细胞术分析期间生成的2D图。
[0025] 图12Α-Ε示出了在磁损耗之前和之后一系列在已分化的神经元的流式细胞术分 析期间生成的2D图和影像。
[0026] 详细说明
[0027] 诸位发明人披露了提供用于分离并纯化直接衍生自任何异质细胞群体（例如包 含神经玫瑰结的培养物）的神经元的多种方法和系统。该神经玫瑰结可以衍生自多种干细 胞群体，诸如诱导性多能干细胞（hiPSC)、胚胎干细胞（hESC)、或者成纤维细胞培养物。
[0028] 所述方法和系统以在多能干细胞、神经玫瑰结、神经上皮以及神经元中检查各种 细胞粘附分子的表达谱为基础。所研宄的分子之中，已经证明结合CD200的阳性选择可以 阴性选择!11^4、!11^-8、!11^-(：、^49厂^340或者^151中的一个或多个以识别、分离或者 富集来自一个细胞培养物的一个神经元群体。这些分子中的一个或多个的某些表达变化可 能与从非定向细胞到神经定向细胞的进展相关联。在一些实施例中，与针对CD200的抗体 相结合，针对这些分子111^4、!11^-8、!11^-(：、^49厂^340或者^151的一种或多种抗体提 供来自多能干细胞的神经分化培养物的神经元的识别，分离和/或富集。针对HLA-A、HLA-B 以及HLA-C的抗体可以是一个单一抗体，其选择性结合全部三种蛋白质，统称为HLA-A、B、 Co
[0029] 本领域已知的以及对理解和实践本发明可能有所帮助的定义和其他信息，包括 科学试验报告以及试剂，提供在贯穿始终所引用的对比文件中，尤其是袁等人，"用于分 离神经干细胞，神经胶质以及衍生自人类多能干细胞的神经元的细胞表面标志特征物 (Cell-Surface Marker Signatures For The Isolation of Neural Stem Cells， Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells) "（公共科学图书馆?综合 2011.03.02 ;6 (3) :el7540)，其中FACS和基于图像的免疫表型分析采用细胞表面标志物的 抗体对天然人类胚胎干细胞（hESC)识别所预期的细胞表面特征物以用于从分离的神经干 细胞中分离神经胶质和神经元。
[0030] 图1描述出了袁等人描述的从干细胞中诱导和分离神经元的现有技术方法的示 意图。天然人类胚胎干细胞（hESC)群体通过用SMD抑制剂（例如：SB431542,头蛋白）进 行处理而被培养和处理从而诱导神经玫瑰结形成。然后，在一个生长培养基中，用一组用于 识别和分离神经干细胞（NSC)的标志物将神经干细胞要么人工地要么流式细胞计数地从 这些细胞中分离出来。经过包含脑源性神经生长因子（BDNF)和胶质细胞源性神经营养因 子（GNDF)的神经元分化培养基处理后，所分选的NSC繁殖很多代并分化成神经元和神经胶 质的混合培养物。随后，一个CD184+/CD447CD15is/CD24+的神经元群体和一个CD184+/CD44+ 的神经胶质群体从衍生自分离的NSC的培养物中被纯化。
[0031] 图2示出了本发明的一个实施例中的步骤，其中使用流式细胞术方法可以识别和 分离定向形成神经元的神经祖细胞，并且无需纯化和分离神经干细胞。本发明的诸多方面 包括培养能够进行神经分化（例如：多能干细胞（hiPSC)、人类胚胎干细胞（hESC)、或者成 纤维细胞培养物）的细胞100。通过本领域任何已知的方式，例如一种或多种SMAD抑制剂 处理、基质源诱导活性、或者无血清类胚体体法，这些细胞可以被诱导形成神经上皮，包括 神经玫瑰结110。通过该方法或者其他方法形成的神经上皮可以进一步被处理以进一步诱 导分化为神经元、神经胶质、星形胶质细胞等。从该异质混合物中诱导神经元分化的处理 可以包括在一个包含BDNF、⑶NF以及单磷酸腺苷（AMP)、上皮细胞生长因子（EGF)、纤维母 细胞生长因子（FGF)的培养基中进行孵育120。诸如神经元的细胞可以通过与所选择的标 志物，例如：⑶200, HLA-A，HLA-B，HLA-C，⑶49f，⑶151，⑶340或其任意组合，抗体接触进行 识别和/或分离130。所述细胞可以通过流式细胞术测定进行选择或者分离140。
[0032] 通常地，在本方法中有用的生物学标志物是那些能够告知响应于神经分化诱导的 神经发育系统的状态的，以及可以有利地用于衍生自一个细胞异质群体的细胞培养物的标 志物。能够告知神经元发育途径状态的生物学标志物，以举例但并非限制的方式，包括细胞 表面蛋白，例如⑶200, HLA-A，HLA-B，HLA-C，⑶49f，⑶151以及⑶340。生物学标志物还包 括编码或者另外能够指示前述的蛋白标志物的RNA和DNA分子。在一些实施例中，一个细 胞培养物中的神经元可以通过检测样本中CD200的存在来进行识别，例如通过与特异性结 合到CD200的荧光标记的抗体进行接触。在某些实施例中，除一种或多种来自下组的标志 物的存在之外，对CD200的存在进行测量，该组包括HLA-A，HLA-B，HLA-C，CD49f，CD151和 ⑶340,及其组合，例如HLA-A，HLA-B和/或HLA-C。在一些实施例中，基于被归类为⑶200+ 细胞的并且还是!1^^^、!11^-8^1^-(7、0)49厂、0)151 _或0)340冲的一个或多个的细胞对 神经元进行选择。在一些实施例中，选择是⑶200+的细胞并且还是HLA-A _、HLA-B_、HLA-C_、 ⑶49Γ、⑶15Γ或⑶340 -中的一个或多个的细胞，其中⑶200 +是可以被归类为⑶200 +以及 ⑶200?的细胞，但不包括⑶200?的细胞。在一些实施例中，神经元可以通过用特异性结合 到CD200的一个第一抗体和特异性结合到一个蛋白（其中该蛋白选自下组，该组由以下各 项组成：HLA-A、HLA-B或者HLA-C)的至少一个第二抗体，以及特异性结合到一个蛋白（其 中该蛋白选自下组，该组由以下各项组成：⑶49f，⑶151或者⑶340)的至少一个第三抗体 接触一个细胞培养物；以及通过检测是CD200+，并且还是HLA-A_，HLA-B_，HLA-C_，以及还有 ⑶49Γ、⑶15Γ或⑶34(K中的一个或多个的细胞来进行识别。神经元还可以通过选择是 CD200+细胞的并且具有可检测出的但低效表达的HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151和 CD340中的一个或多个的细胞来进行检测。
[0033] 在某些情况下，通过检测用探针（例如，抗体）染色的细胞染色强度，一个样本中 的细胞通过细胞表面（例如，在一些情况下，一个样本中的⑶200+细胞被识别）上的一种或 多种蛋白质的表达水平来进行识别，该探针对一种感兴趣的细胞表面蛋白（例如，CD200， HLA-A，HLA-B，HLA-C，⑶49f，⑶151，⑶340等）具有特异性。本领域普通技术人员将理解 所陈述的表达水平反映细胞表面上的标志蛋白的可检测出量。一个对染色（例如，CD20(T) 阴性的细胞（标志物特异性试剂的结合水平不可检测地不同于同型匹配对照）仍然可以表 达微量的该标志物和/或其中可以存在微量的染色强度，这并非是由于蛋白质的存在（例 如，"背景"染色）。并且，虽然称细胞对某一特定标志物为"阳性"（+)或者"阴性"是 本领域的常用做法，但实际的表达水平是数量性状。细胞表面上的分子数量可以随着若干 对数处理（log)而变化，但仍然可以被称为"阳性"。例如，此处使用的术语"CD200+"可以 包含术语⑶200 ?#和⑶200?，但是不包含术语⑶200?或者⑶200'
[0034] 可以通过流式细胞计数监控细胞的染色强度，其中激光器检测荧光染料的量化水 平（其与由特异性试剂（例如，抗体）结合的细胞表面标志物量成比例）。流式细胞计数、 或FACS还可以用于基于结合到特异性试剂的强度、及其他参数如细胞大小和光散射来分 出细胞群体。尽管染色的绝对水平可以随着具体荧光染料和试剂制品而不同，但是可以将 数据标准化为对照。
[0035] 为了将分布标准化为对照，将每个细胞记录为具有具体染色强度的一个数据点。 可以根据对数标度显示这些数据点，其中测量单元是任意染色强度。在一个实例中，在样本 中最亮的染色细胞可以比未染色（即，"阴性"）细胞强度高多达4个对数。当以此方式显 示时，明显的是落入染色强度的最高对数内的细胞是"阳性""高"）的，而在最低强度中 的那些是"阴性"或"低"的。"低"阳性染色细胞具有比同型匹配对照更亮的染色水平，但 是其不像通常在群体中发现的较亮染色细胞那么强烈。从最低强度到最亮强度，细胞可以 是"阴性"、"低"、"中等"（即，中间）、或"高"的。"中等"或"高"的细胞被认为是"阳性" 的。在一些情况下，"++"用于指示"高"而" + "用于指示"中等"，但两种强度水平都被认为 是"阳性"。
[0036] 一种替代对照可以在表面上使用底物或具有限定的密度和/或强度的标志物的 底物，例如构造珠 （fabricated bead)或细胞系，这为一个或多个强度水平提供阳性对照。
[0037] 可以通过任何常规技术进行生物标志物的测量。生物标志物分子的测量可以包括 例如指示存在、浓度、表达水平、或任何其他与标志物分子相关联的值的测量。针对测量生 物标志物分子，各种光谱技术是可用的，包括UV、可见的、以及红外光谱。焚光标记、放射性 标记、或其他可易于识别的和量化的标记可以用于帮助标志物分子的测量。结合细胞的标 志物的表达水平可以通过流式细胞计数技术测量。已描述了细胞表面标志物表达用于通过 成像技术（如荧光激活细胞分选法（FACS))从来自多个物种的胚胎和成人组织识别和分离 许多神经细胞类型。在优选实施例中，流式细胞计数可以用于使用本发明的方法对细胞进 行识别和分选。流式细胞计数是用于通过在液体流中对其进行悬浮和捕获在每个细胞通过 激光束时从其发出的光来统计和检查显微粒子（如细胞）的技术。可以在流式细胞计数中 利用经常被称为"分化群"(CD)分子的细胞表面分子来表征细胞群体。例如，在荧光激活细 胞分选中，使用了诊断抗体（用荧光团标记），该诊断抗体结合到呈现在所讨论的细胞群体 上的表面分子（例如，CD分子）并且表示所讨论的细胞群体的特性。此后，由激光束激活 荧光团（附接到抗体）并且由流式细胞仪检测荧光信号。以此方式，荧光标记的抗体可以 用于检测和分选显示特异性CD分子（或CD分子集）的细胞。通过举例而不是限制性方式 用于与此或任何其他检测方法一起使用的荧光团包括异硫氰酸荧光素、别藻蓝素、多甲藻 素叶绿素蛋白、藻红素、以及菁蓝5、BB421或任何其他可以共价接合到抗体上的荧光团。本 发明的系统可以包括一个流式细胞仪，一个针对CD200具有特异性的、可检测地标记的抗 体，针对HLA-A、HLA-B或HLA-C、⑶49f、⑶340或⑶151中的一个或任何组合具有特异性 的、可检测地标记的抗体或多个抗体，以及包括神经元的一个细胞培养物，从而使得可以检 测这些蛋白中的一种或多种。在此所描述的多种方法和系统中所使用的流式细胞仪可以被 配置成用于检测来自荧光标记的抗体的低的、中等的和高的信号。结合信号强度所使用的 的具体抗体可以提供用于识别神经元的特异性模式识别，该神经元衍生自可以包括异质细 胞群体的细胞培养物。
[0038] 本发明的细胞表面标志物与已知蛋白家族有关。糖蛋白CD200是由广泛范围的细 胞类型所表达的膜蛋白。HLA-A、HLA-B、HLA-C、（可互换地是HLA-A、B、C)是组成主要组织 相容性复合物（MHC)的HLA蛋白分子。在全部脊椎动物中，MHC是由大的基因家族所编码 的细胞表面分子。针对HLA-A、B、C的抗体是结合到或者HLA-A、HLA-B或者HLA-C的抗体。 MHC分子介导是免疫细胞的白细胞（也称作白血细胞（WBC))与其他白细胞或体细胞的相互 作用。针对⑶49f的抗体结合到是整联蛋白α链α6的ITGA6蛋白产物上。整联蛋白是 由一条α链和一条β链组成的完整的细胞表面蛋白。针对CD340的抗体结合到受体酪氨 酸激酶的表皮生长因子（EGF)受体家族的一个成员上。针对CD151的抗体结合到已知与整 联蛋白和其他跨膜4超家族蛋白进行复合的细胞表面糖蛋白上。
[0039] 图3图解说明了本发明的一个实施例，其中将天然人类胚胎干细胞（hESC)群体以 与袁等人相似的方式由SFEB通过SMD抑制来诱导形成神经玫瑰结。在一些实施例中，可能 包括神经祖细胞或注定会形成神经元的细胞的任何细胞培养物可以用本发明的多种方法 和系统进行处理。可以用本发明的多种方法或系统组合的细胞类型包括人类诱导性多能干 细胞（hiPSC)、人类胚胎干细胞（hESC)、或成纤维细胞培养物、神经玫瑰结、神经元和神经 胶质。如在图3中，当用于诱导的细胞是神经玫瑰结，这些细胞可以用将诱导神经分化（如 神经元和神经胶质的形成）的培养基（例如，BNDF、GNDF和/或dbcAMP)来处理。培养基 可以包括试剂如N2或B27或任何其他试剂或本领域已知用于诱导神经分化的方案。在本 发明的多种方法和系统中不需要神经干细胞的纯化、分离或分开的中间步骤。在诱导分化 的处理之后，可以通过将细胞培养物与选择性地结合到CD200的抗体接触来识别和/或分 离神经元。在一些实施例中，可以通过将细胞与选择性地结合⑶200的抗体和选择性地结 合HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任意组合的一个或多个抗体接触来针对 神经元进行选择。在一些实施例中，这些抗体是通过与一个荧光团的直接接合可检测地和 可辨别地标记的。识别可以是通过可以区分荧光信号（例如，流式细胞计数）的任何成像 技术。可以在神经分化诱导之后的任何时间（如在20、25、30或40天之后）用本发明的多 种系统处理细胞培养物来确保识别和/或分离了神经元。因为可以省略NSC分离的步骤， 该方法有益地降低了达到细胞培养物中已富集的神经元群体的时间。
[0040] 本发明的多种方法和系统可以与常规细胞分出技术结合使用来制备神经元富集 的细胞培养物。富集可以基于是⑶200+或⑶200 s的细胞或是⑶200+#和⑶200? (即，排 除是CD200?的细胞）的细胞的选择。在一些实施例中，选择标准可以基于选择是CD200+或 CD200++并且还是 HLA-A、B、C 'CD49r、CD15r或 CD34(T的细胞群体，例如 CD200 ++/HLA-A、B、 Γ。选择可以用任何手段如通过流式细胞计数细胞分选发生。在一些实施例中，是HLA-A、 B、C+、⑶49f+、⑶151+或⑶340 +的细胞可以从细胞样本中磁性地分选出来。磁性选择可以包 括将细胞培养物与针对HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任意组合具有选择 性的抗体接触，其中这些抗体被附接到可以被磁场（如磁珠）吸引或排斥的表面上。在一 些实施例中，本发明的针对标志物具有特异性的抗体进一步包括磁珠，如含铁的金属材料。 优选地，尽管可以使用任何类型的磁珠，但是磁珠是超顺磁性微粒子。可以用任何手段将磁 珠附接到抗体上。可以在抗体结合到感兴趣的标志物之前、或在细胞-抗体复合物的形成 之后附接磁珠。在一些实例中，在复合物的形成之前附接磁珠。在其中细胞-抗体复合物 具有磁珠并且抗体针对HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任意组合具有特异 性的实施例中，从包括神经元的细胞培养物分出这样的复合物优选地包括将细胞培养物与 磁场接触，这样使得具有磁珠的细胞-抗体复合物基本上通过磁场保留并且神经元基本上 不通过磁场保留。磁场的实例可以是磁化的钢丝绒或流式细胞仪中的磁场。然后可以通过 使用针对CD200具有选择性的抗体针对剩余细胞进行选择性地分选。本发明还包括其中 将细胞培养物分出为基本上不具有针对HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任 意组合是阳性的细胞的第一细胞群体和具有针对神经元的已富集的群体的第二细胞群体 的实施例。然后可以针对CD200+或CD200 ++细胞对第二细胞群体进行选择以用于进一步富 集。本发明的多种方法可以产出近似2、4、6或10倍的富集值。
[0041] 本发明的系统可以包括细胞培养物（包括神经元或神经祖细胞）、特异性结合到 CD200的抗体和被配置成用于分选是CD200+的细胞的流式细胞仪。本发明的多种系统还 可以包括特异性结合到至少一种蛋白的第二抗体，该蛋白选自下组，该组由以下各项组成： HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151或⑶340,其中该系统可以包括针对2种或更多种、3种 或更多种、4种或更多种、5种或更多种、包括所有6种这些蛋白具有特异性的抗体（例如， 包括针对这6种不同蛋白中的每种具有特异性的抗体的系统），其中流式细胞仪被配置成 用于分选是⑶200+并且是HLA-A、B、C '⑶49Γ、⑶15Γ或⑶340 -中的一个或多个的细胞。 在一些实施例中，本发明的这些系统还可以包括特异性结合到至少一种蛋白的第三抗体， 该蛋白选自下组，该组由以下各项组成：⑶49f、⑶151或⑶340,其中流式细胞仪被配置成 用于分选是⑶200+和HLA-A、B、C -并且是⑶49f '⑶15Γ或⑶340 -中的一个或多个的细胞。 本发明的其他系统包括针对从hPSC的神经分化培养物和来自成纤维细胞的诱导性神经元 培养物的神经细胞类型分离或富集的试剂、试剂盒（kit)和测定。本发明的多种方法和系 统可以用于针对衍生自患者的细胞的神经细胞类型分析的诊断工具。用于筛选药物（或 小分子）的神经细胞类型的富集作为用于衍生自异质细胞培养物组合物（如神经玫瑰结、 hPSC或患者的细胞）的神经细胞类型的候选。以下非限制性实例进一步展示了本发明。
[0042] 实例
[0043] 实例 1
[0044] 从维塞公司（WiCell)(麦迪逊（Madison)，威斯康辛州（WI))获得的H9hESC的培 养物是扩增的细胞，然后对其进行如下分化：
[0045] 第1天：通过用分散酶处理制作类胚体（EB)并将其放置在包含 10 μ mY-27632 (Rock 抑制剂）、2· 5 μ m Dorsomorphin、10 μ m SB43152 的无血清替换物 (knock-out serum replacement) (KOSR)培养基（标准WiCelI hESC培养基 w/o bFGF)中。 使用了低粘附6孔板并且每孔加入4ml的培养基。
[0046] 第2天：移除了 Rock抑制剂并且将细胞转移至包含2. 5 μ m Dorsomorphiru 10 μ m SB43152的KOSR培养基中。
[0047] 第 4/5 天：在 ITS 培养基（+2. 5 μ m Dorsomorphin+10 μ m SB43152)中将 EB 涂板 在基质胶涂覆的板上。将4ml的EB涂板在孔中并且将IOml的ITS培养基加入到IOcm涂 覆的板中。每2-3天喂养EB。
[0048] 第10/11天：细胞培养基变化为ITS。
[0049] 第15/18+天：培养基变化为ITS培养基+20ng/ml FGF，持续24-48小时。观察到 细胞死亡和神经元分化。
[0050] 第 18/20 天：使用生命技术公司（Life Technologies) StemPro? EZPassage? 传代工具将正方形切割成培养物。刮掉并将正方形压成丸。一个IOcm的培养物被涂板到两 个在D-MEM/F-12w/GlutamaxTM培养基中涂覆有聚鸟氨酸和层粘连蛋白的T150烧瓶中。培 养基还包含 Iym dbcAMP+10ng/ml BDNF+10ng/ml ⑶NF。
[0051] 第40天：对培养物进行分选分析并分析。图4描述了此处使用的神经元分离免疫 表型发现工作流程。神经诱导培养物用BD Lyoplate?人类细胞表面标志物筛板进行染色来 针对表面标志物进行筛选，并且然后用S0X1、S0X2、PAX6和DCX后续染色来使用细胞内标志 物针对神经元进行筛选。最终，分析细胞表面标志物表达群体来确定针对来自细胞异质群 体的神经元的新的细胞表面标志物。2D图（图5A)示出了被识别为神经元的DCX +Soxr和 DCX+Soxl+群体。将分化培养物分析为能够分离/富集神经元。图5B中示出的四个直方图示 出了在屏幕中识别的在神经元上差异性表达的各种标志物的采样，如与其他群体相比较。
[0052] 在近似于20psi处用100 μ m喷嘴分选神经元。在基础培养基中染色并在基础培养 基中收集细胞。图6示出了门控策略用于从神经诱导培养物分选神经元。以从左上侧顺时 针方向将神经门识别为以下：基于光散射的ΡΓ细胞、基于光散射的P2 +P3_单个细胞，并且 基于⑶200和HLA-A、B、C表达，P4被识别为神经元。还具有示出了在神经元门P4 (⑶200+7 HLA-A' HLA-B' HLA-(T)中细胞的CD340和CD184表达的2个附加图。
[0053] 图7和图8示出了分选前和分选后两天的培养物的光学显微镜图像。基于外观， 在分选后图像中成像的神经元性质非常纯净。在图7中观察到的圆环样结构是包含NSC的 神经上皮。从神经集开始，识别神经元投影。
[0054] 图9A示出了分选后7天的、已分选的CD200++/HLA-A' HLA-B' HLA-Γ的荧光显微 镜图像。在96孔成像板中以约50, 000细胞/孔分选和涂板这些细胞并且在包含IX N2和 IX B27的D-MEM/F-12w/Glutamax?培养基中培养7天。通过β微管蛋白染色来识别神经 元，污染的"非神经元"通过巢蛋白染色来识别并且所有细胞核通过DAPI染色来识别。
[0055] 在图9Β中示出的2D图说明了紧接在细胞分选之前和紧接在细胞分选之后的神经 细胞培养物的分析。左上门由"非神经元"组成，如通过巢蛋白++/DCF染色所看到。在右上 方的门由神经元组成，如通过巢蛋白+/DCX +染色所看到。这些图指示已分选的神经元培养 物为大约60 %纯净。
[0056] 实例 2
[0057] 图10A示出了细胞培养和分化过程的概述。从由维塞公司（麦迪逊，威斯康辛州） 获得的细胞培养和扩增H9hESC。然后将它们进行如下分化：
[0058] 第7天：通过用分散酶制作类胚体（EB)并将其放置在包含10 μ mY-27632 (Rock抑 制剂）、2·5μπι Dorsomorphin、以及 ΙΟμπι SB43152 的 KOSR 培养基（标准 WiCell hESC 培 养基w/o bFGF)中。使用了低粘附6孔板并且每孔加入4ml的培养基。
[0059] 第8天：移除了 Rock抑制剂并且培养基变化为包含2· 5 μ m Dorsomorphin、10 μ m SB43152的KOSR培养基。
[0060] 第 10/11 天：在 ITS 培养基（+2. 5 μπι Dorsomorphin+10 μπι SB43152)中将 EB 涂 板在基质胶涂覆的板上。将4ml的EB涂板在孔中并且将IOml的ITS培养基加入到IOcm 涂覆的板中。每2-3天喂养EB。
[0061] 第15/11天：细胞培养基变化为ITS。
[0062] 第20/23天：培养基变化为ITS培养基+20ng/ml FGF，持续24-48小时。观察到 细胞死亡和神经元分化。
[0063] 第 23/25 天：使用生命技术公司（Life Technologies) StemPro? EZPassage? 传代工具将正方形切割成培养物。一个10cm的培养物被涂板到两个在D-MEM/F-12w/ Glutamax?培养基中涂覆有聚鸟氨酸和层粘连蛋白的T150烧瓶中，该培养基包含IX N2和 IX B27 连同 Ιμπι dbcAMP+10ng/ml BDNF+10ng/ml ⑶NF。
[0064] 第45天：对培养物进行分选分析并分析。
[0065] 用DCX和Soxl对神经诱导培养物进行染色从而提供针对神经元分化的细胞内对 照。图10B示出了说明门控策略的2D图。将DCX +Soxr和DCX +Soxl+群体定义为神经元。 在屏幕中被识别的标志物的重叠直方图在图10C中示出。CD200被识别为针对神经元的阳 性标志物。^^4、!11^-8、!11^-(：、^151、^340和^49€被识别为培养物中污染的细胞的阴 性标志物。这些标志物的差异性表达可以允许神经元分离。识别用于分选的标志物的组合 的⑶200与HLA-A、HLA-B、HLA-C或⑶340或⑶49f的共染色结果在图10D中的2D图上示 出。
[0066] 图IlA-D示出了用于从神经诱导培养物分选神经元的门控分析的结果。图IlA 所描绘的图示出了用于基于光散射分选细胞的散射辨别来解释双重辨别确保分析了基于 光散射的单个细胞。CD200++/HLA-A7HLA-B7HLA-r图用于基于CD200和HLA-A、HLA-B或 HLA-C表达识别神经元并且确认使用DCX/S0X2/Ki67分析。图IlB描绘了分选之前的神经 培养物的流式分析。通过DCX的表达和Sox2和Ki-67的缺乏表达（DCX+Sox2_ki67_)来识 别神经元。图IlC描绘了神经培养物的细胞分选之后的CD200 ++/HLA-A7HLA-B7HLA-C^ 胞的流式分析。通过DCX的表达、Sox2和ΚΓ67的缺乏表达（DCX+Sox2_ki67)来识别神经 元。图IlD描绘了神经培养物的细胞分选之后的⑶200+/HLA-A、B、C +细胞的流式分析。通 过DCX的表达和Sox2和Ki67的缺乏表达（DCX+/Sox27ki67〇来识别神经元。
[0067] 实例 3
[0068] 如以上所描述诱导神经元形成。用以下抗体：PE CD340、PE HLA-A、B、C和PE CD49f 接触细胞培养物。然后使这些细胞经受磁性损耗。接合到结合PE的抗体的磁性纳米粒子用 于结合在细胞培养物上使用的PE接合的抗体。然后通过将其紧挨磁场放置从细胞溶液分 出磁性纳米粒子。然后通过流式细胞计数和图像分析来分析已富集的和已损耗的部分。在 图12A和12B中示出在磁性损耗之前（12A)和之后（12B)的神经培养物图像分析。对神经 培养物进行解离、用接合的抗体染色并且将其涂板在96孔成像板上并培养7天。通过Tujl 的表达和巢蛋白和Ki67的缺乏表达（Tujl+/巢蛋白7ki67〇来识别神经元。将核用DAPI 进行染色。损耗的部分的流式分析（图12C)示出了通过DCX的表达和Sox2和Ki-67的缺 乏表达识别的神经元群体。示出了损耗之前（12D)和损耗之后（12E)的样本的2个图。通 过DCX的表达和Sox2和Ki67的缺乏表达（DCX+/S〇x27ki67_)来识别神经元。数据分析指 示在包括神经元与磁性标记的针对PE⑶340、PEHLA-A、B、C和PE⑶49f具有特异性的抗 体的细胞培养物中的细胞损耗将导致细胞培养物中神经元的富集。
[0069] 在此提出的所有专利、专利出版物、和其他已出版的参考通过引用以其全文特此 结合，如同每个已在此通过引用单独地和特别地结合。尽管描述了本发明的优选说明性 实施例，但是将对本领域技术人员明显的是可以在其中进行各种变化和修改而不偏离本发 明，并且在所附权利要求书中旨在覆盖所有落入本发明的真实精神和范围内的这样的变化 和修改。
【权利要求】
1. 一种在一个细胞培养物中区分神经元的方法，该方法包括： 用特异性结合到CD200的一个第一抗体和特异性结合到一种蛋白的至少一个第二抗 体接触该细胞培养物，该蛋白选自下组，该组由W下各项组成出LA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、 CD151 和 CD：MO ;并且 检测是CD200+细胞的并且还展示出HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151和CD340中的 一个或多个的低至阴性表达的细胞。
2. 如权利要求1所述的方法，其中该细胞培养物包括人类诱导性多能干细胞化iPSC)、 人类胚胎干细胞化EPSC)、神经崎细胞、成纤维细胞、神经干细胞或其任意组合。
3. 如权利要求1所述的方法，其中该细胞培养物衍生自一个细胞异质群体。
4. 如权利要求1所述的方法，其中该细胞培养物包括神经玫瑰结。
5. 如权利要求1所述的方法，其中该细胞培养物包括神经上皮。 ^
6. 如权利要求1所述的方法，其中该些CD200 +细胞是CD200 *等（CD20〇med)和CD200? (CD20〇hish)。
7. 如权利要求1所述的方法，其中该细胞培养物不经历一个神经干细胞富集步骤。
8. 如权利要求1所述的方法，其中该检测细胞的步骤通过一个流式细胞仪来进行。
9. 如权利要求1所述的方法，其中该第一和第二抗体是通过与一个巧光团的直接接合 可检测地和可辨别地标记的。
10. 如权利要求9所述的方法，其中该巧光团选自下组，该组由W下各项组成；异硫氯 酸巧光素、别藻藍素、多甲藻素叶绿素蛋白、藻红素、菁藍5和BV421。
11. 如权利要求1所述的方法进一步包括富集是CD200 ++细胞的并且还是HLA-A \ HLA-B-、HLA-C-、CD49f-、CD15厂或CD340 -中的一个或多个的细胞群体。
12. -种在一个细胞培养物中富集神经元的含量的方法，该方法包括： 在包括神经上皮的一个细胞培养物中诱导神经分化从而形成神经元和神经胶质； 用特异性结合到CD200的一个第一抗体和特异性结合到一种蛋白的至少一个第二抗 体接触该细胞培养物，该蛋白选自下组，该组由W下各项组成出LA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、 CD151 和 CD：M0 ;并且 流式细胞计数地选择是CD200+细胞的并且还是HLA-A -、HLA-日-、HLA-C-、CD49f-、 CD15厂或CD340 -中的一个或多个的细胞。
13. 如权利要求12所述的方法，其中从神经上皮直接诱导神经元形成。
14. 如权利要求12所述的方法，其中是CD200 +的细胞不是CD200 ? (CD20〇i?)。
15. 如权利要求12所述的方法，其中该细胞培养物不经历一个神经干细胞富集步骤。
16. 如权利要求12所述的方法，其中该第一和第二抗体是通过与一个巧光团的直接接 合可检测地和可辨别地标记的。
17. 如权利要求16所述的方法，其中该巧光团选自下组，该组由W下各项组成；异硫氯 酸巧光素、别藻藍素、多甲藻素叶绿素蛋白、藻红素、BV421和菁藍5。
18. 如权利要求12所述的方法，其中富集神经元的含量包括 用对于下组中的至少一个具有选择性的抗体接触来自一个细胞培养物的细胞，从而形 成一个抗体-细胞复合物，该组由W下各项组成出LA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151、和 CD340,其中该些抗体被附接到可W被一个磁场吸引或排斥的一个表面上；并且 通过向该些细胞施加一个磁场从该细胞培养物选择性地分出所述抗体-细胞复合物。
19. 如权利要求12所述的方法，其中该第一和第二抗体是巧光标记的单克隆抗体。
20. 如权利要求12所述的方法，其中该富集大于4倍。
21. 如权利要求12所述的方法，其中该第二抗体结合到HLA-A、HLA-B或HLA-(T并且进 一步包括将该第二细胞培养物与包括CD49f、CD151或CD340的一个第=抗体接触；W及 针对是 CD200+和 HLA-A -、HLA-B-、或 HLA-C-，并且还是 CD49f-、CD151-或 CD340 -的细胞 进行选择。
22. -种用于从一个细胞培养物分离或富集神经元的系统，该系统包括： 特异性结合到CD200的一个第一抗体； 特异性结合到一种蛋白的一个第二抗体，该蛋白选自下组，该组由W下各项组成： HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151 和 CD：M0 ; 包括神经元的一个细胞培养物；W及 一个流式细胞仪，被配置成用于分选是CD200+和HLA-A -、HLA-B-、HLA-C-、CD49f-、 CD15厂或CD340 -中的一个或多个的细胞。
23. 如权利要求22所述的系统，其中该第一和第二抗体是巧光标记的抗体。
24. 如权利要求22所述的系统，其中该第二抗体是用一种含铁的金属材料标记的。
25. -种用于在一个细胞群体中识别神经元的系统，该系统包括： 特异性结合到CD200的一个第一抗体； 特异性结合到一种蛋白的一个第二抗体，该蛋白选自下组，该组由W下各项组成： HLA-A、HLA-B 和 HLA-C ; 特异性结合到一种蛋白的一个第=抗体，该蛋白选自下组，该组由W下各项组成： CD49f、CD151 和 CD：M0 ; 一个细胞样本；W及 一个流式细胞仪，被配置成用于识别是CD200+和HLA-A-、HLA-扩或HLA-C-中的一个或 多个、并且还是CD49f、CD15厂或CD340 -中的一个或多个的细胞。
【文档编号】C12Q1/04GK104471073SQ201380019615
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年4月23日 优先权日:2012年5月16日
【发明者】克里斯汀·T·卡森, 乔迪·马丁, 杰森·G·维达尔 申请人:贝克顿·迪金森公司