重组牛分枝杆菌菌株、免疫原性组合物和用途

重组牛分枝杆菌菌株、免疫原性组合物和用途【专利摘要】本发明涉及重组分枝杆菌菌株，其编码突变的大肠杆菌LT不耐热毒素或突变的大肠杆菌LT不耐热毒素的A亚单位。本发明还涉及分枝杆菌菌株，其编码在位置63处突变的大肠杆菌LT不耐热毒素或所述LT不耐热毒素的A亚单位。确切地说，本发明涉及分枝杆菌菌株，其编码在位置63处由丝氨酸向赖氨酸突变的大肠杆菌LT不耐热毒素或所述LT不耐热毒素的A亚单位。本发明还提供包含本发明的菌株的免疫原性组合物。本发明进一步提供所述菌株和免疫学组合物在生产用于预防结核病以及由结核分枝杆菌引起的感染的疫苗中的用途。最后，本发明涉及用于在动物中预防或治疗结核病的方法。【专利说明】重组牛分枝杆菌菌株、免疫原性组合物和用途[0001]本发明涉及重组分枝杆菌菌株，其编码突变的大肠杆菌不耐热毒素LT或突变的大肠杆菌不耐热毒素的A亚单位。[0002]本发明还涉及分枝杆菌菌株，其编码在位置63处突变的大肠杆菌不耐热毒素LT或不耐热毒素LT的A亚单位。[0003]具体地，本发明涉及分枝杆菌菌株，其编码在位置63处由丝氨酸向赖氨酸突变的大肠杆菌不耐热毒素LT或不耐热毒素LT的A亚单位。[0004]本发明还提供包括本发明的菌株的免疫原性组合物。[0005]本发明还提供上述菌株和免疫学组合物在生产用于预防结核病以及由结核分枝杆菌引起的感染的疫苗中的用途。[0006]最后，本发明涉及用于在动物中预防或治疗结核病的方法。[0007]发明背景[0008]分枝杆菌[0009]分枝杆菌构成放线菌纲的放线菌目的分枝杆菌科的分枝杆菌属。形成这个属的分枝杆菌形状像稍微弯曲的棒体，测量的长度为1至10Um并且直径为0.2至0.6ym。这些细菌不能被分类为革兰阳性或革兰阴性。这种杆菌最突出特点是其细胞包膜的复杂性质，所述包膜含有相对较高百分比的脂质，这些脂质包括分枝菌酸的长链。这种包膜赋予强疏水性，使其抗溶菌并且对于抗生素及其它化学剂比较不易透过。该杆菌被标记为耐酸-醇的，即：它们耐受在用品红或类似染料染色之后由弱酸引起的变色。基因组DNA含有高含量的鸟苷/胞嘧啶，在58-79%之间，这损害了细菌大肠杆菌作为遗传宿主的使用。这些方面被认为是用于将杆菌鉴定为分枝杆菌属的成员的基本特征[0RME，I.(1995)MedicalIntelligentUnit:ImmunitytoMycobacteria.Austin:R.G.LandsCompany,p.5；JAWETZ，E.，MELNICK，J.L.&ADELBERG，E.A.(1998)MedicalMicrobiology?第21版Appleton&Lange,Stamford,Connecticut；SHINNICK,T.M.&G00D,R.C.(1994)Mycobacterialtaxonomy.EurJClinMicrobiolInfectMDis11:884-901]。[0010]分枝杆菌已被分为两个主要群组：生长迟缓的细菌，其具有大约13小时的传代时间并且可能花费3周至3个月的培养时间以提供可见菌落；以及生长快速的细菌，其具有大约2至5小时的传代时间。所述生长迟缓的分枝杆菌包括许多最大的动物以及人类病原体，如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、副结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、麻风分枝杆菌等等，而快速生长的分枝杆菌包括非致病性物种，如：耻垢分枝杆菌、金色分枝杆菌、牝牛分枝杆菌等等。5个致病性分枝杆菌种中的4个被分类在结核分枝杆菌复合物的组中，4个种的这组可能引起结核疾病（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、马科福特分枝杆菌（M.microft)以及非洲分枝杆菌）；第五个是麻风分枝杆菌，它是引起汉森氏病（Hansen'sdisease)(非正式地称为麻风病）的病原菌[SHINNICK，T.M.&G00D，R.C.(1994)Mycobacterialtaxonomy.EurJClinMicrobiolInfectDis11:884-901；0RME,I.(1995)MedicalIntelligentUnit:ImmunitytoMycobacteria.Austin:R.G.LandsCompany,第5页；CONNELL，N.D.(2001)ExpressionsystemsforuseinActinomycetesandrelatedorganisms.CurrentOpinioninBiotechnology12:446-449]。[0011]结核分枝杆菌（MTB)主要经由呼吸道传播并且虽然它可以在若干器官中引起疾病，但是肺结核是最常见的。据估计，世界人口的三分之一被杆菌感染并且2亿人将表现出结核病症状，如果不采取控制和预防措施，那么到2020年其中3500万可能死亡（WHOAnnualPublication,2000)〇[0012]结核病的预防以及卡介苗（BacillusCalmette_Gu6rin，BCG)的使用[0013]在上世纪初，AlbertCalmette和CamilleGu6rin使牛分枝杆菌的强毒株减毒。这个菌株目前被称为卡介苗（BCG)，并且是目前成功使用的唯一的结核病疫苗（tuberculosisvaccine)，已经在全世界给药超过30亿个体。[0014]尽管如此，其针对结核病的成人形式的功效还是引起了论争，因为根据研究来看，其功效可以在〇_80%的范围内[Andersen，P?和Doherty，T.M.(2005)ThesuccessandfailureofBCG-implicationsforanoveltuberculosisvaccine.NatRevMicrobiol.3:656-662]〇[0015]因此，在开发新疫苗中已基于以下做出了一些努力：a)重组蛋白或优势MTB抗原；b)这些抗原在多种载体如病毒载体、细菌载体或基于重组BCG的载体中的表达；c)不会引起结核病的其它分枝杆菌，如耻垢分枝杆菌；或d)实际减毒的结核分枝杆菌[Sweeney，K.A,Dao,D.N.,Goldberg,M.F.,Hsu,T.,Venkataswamy,M.M.,Henao-Tamayo,M.,Ordway,D.,Sellers,R.S.,Jain,P.,Chen,B.,Chen,M.,Kim,J.,Lukose,R.,Chan,J.,Orme,I.M.,Porcelli,S.A.以及Jacobs，W.RJr.(2011)ArecombinantMycobacteriumsmegmatisinducespotentbactericidalimmunityagainstMycobacteriumtuberculosis.NatMed.4:1261-1268；Kaufmann,S.H.(2010)Futurevaccinationstrategiesagainsttuberculosis:thinkingoutsidethebox.Immunity33:567-577。[0016]一般来说，这些疫苗背后的想法是寻找一种模拟在真实情况下会发生什么的方式，即，给出死的或活的形式、但减毒的并且不引起感染的整个病原体[Kaufmann，S.H.(2010)Futurevaccinationstrategiesagainsttuberculosis:thinkingoutsidethebox.Immunity33:567-577]，或者使用同一属的另一种（species)，其也是死的或减毒的，如BCG，其具有与所关注的病原体同样重要的抗原。这些疫苗的另一变体是将其用作活的载体用于呈递或表达异种抗原，在这种情况下，MTB分子在BCG或耻垢分枝杆菌中表达[Sweeney，K.A，Dao,D.N.，Goldberg，M.F.，Hsu，T.，Venkataswamy，M.M.，Henao-Tamayo,M.,Ordway,D.,Sellers,R.S.,Jain,P.,Chen,B.,Chen,M.,Kim,J.,Lukose,R.,Chan,J.,Orme,I.M.,Porcelli,S.A.以及Jacobs，W.RJr.(2011)ArecombinantMycobacteriumsmegmatisinducespotentbactericidalimmunityagainstMycobacteriumtuberculosis.NatMed.4:1261-1268；Kaufmann,S.H.(2010)Futurevaccinationstrategiesagainsttuberculosis:thinkingoutsidethebox.Immunity33:567-577]。[0017]尽管做出了努力，但是当与BCG疫苗相比时，动物模型中的结果提示在肺的杆菌负荷中仅l.Olog的降低，尽管遵循基于初次-加强的免疫接种系统。在此免疫接种程序表中，使用上述制剂中的一种给药第一剂量，接着给药在另一制剂中的第二剂量，即：需要用不同制剂或递送的两次免疫接种来实现比目前所用的BCG疫苗更好的结果，所述BCG疫苗是作为单一剂量来给药的[Sweeney，K.A，Dao,D.N.，Goldberg，M.F.,Hsu,T.,Venkataswamy,M.M.,Henao-Tamayo,M.,Ordway,D.,Sellers,R.S.,Jain,P.,Chen,B.,Chen,M.,Kim,J.,Lukose,R.,Chan,J.,Orme,I.M.,Porcelli,S.A.以及Jacobs，W.RJr.(2011)ArecombinantMycobacteriumsmegmatisinducespotentbactericidalimmunityagainstMycobacteriumtuberculosis.NatMed.4:1261-1268；Kaufmann,S.H.(2010)Futurevaccinationstrategiesagainsttuberculosis:thinkingoutsidethebox.Immunity33:567-577]。[0018]重组BCG[0019]BCG是世界上最广泛使用的疫苗，因为它具有持久的免疫应答和极低的严重不良反应发生率。这个以及其它特征使得BCG成为作为用于经由基于BCG的重组疫苗呈递异种抗原的载体的极佳候选物（美国专利6,673,353)。在这方面，细菌、病毒以及寄生虫的免疫原性结构域的表达已经在BCG中成功使用，产生重组菌株（rBCG)，其产生不仅抗结核杆菌而且抗其蛋白质将在这个rBCG中表达的病原体的免疫应答（美国专利5,504,005)。然而，值得强调的是，在迄今为止所描述的rBCG中，异源免疫原性结构域的加入赋予针对其蛋白质将在上述rBCG中表达的病原体的预期的特异性免疫保护。对不同于那些惯常已知的反应（即：中rBCG赋予与所预期的不同的免疫保护）尚无描述。[0020]大肠杆菌不耐热毒素LT和其免疫调节剂性质[0021]佐剂性质已归因于若干细菌毒素。举例来说，众所周知，破伤风（TT)、白喉（DT)和霍乱（CT)毒素以及大肠杆菌（E.coli)不耐热毒素（LT)用作当与其它抗原共同给药时引导针对Th2的免疫应答的佐剂[Ryan，E.J?等人（2000)ModulationofinnateandacquiredimmuneresponsesbyEscherichiacoliheat-labiletoxin:distinctpro-andanti-inflammatoryeffectsofthenontoxicABcomplexandtheenzymeactivity.JImmunol.165:5750-5759；Miyaji,E.N.等人(2001)InductionofneutralizingantibodiesagainstdiphtheriatoxinbyprimingwithrecombinantMycobacteriumbovisBCGexpressingCRM197,amutantdiphtheriatoxin.InfectImmun.69:869-874]。[0022]具体地，大肠杆菌LT毒素是迄今为止所描述的最有效力的佐剂之一[Lycke，N.等人（1992)TheadjuvanteffectofVibriocholeraeandEscherichiacoliheat-labileenterotoxinsislinkedtotheirADP-ribosyltransferaseactivity.EurJImmunol.22:2277-2281;Pizza，M?等人（2001)Mucosalvaccines:nontoxicderivativesofLTandCTasmucosaladjuvants.Vaccine，19:2534-2541]〇[0023]大肠杆菌LT毒素是通过具有ADP-核糖基转移酶活性的单个A亚单位分子（LTA，27kDa)结合至B亚单位五聚物（LTB，每个11.6kDa)形成，所述五聚物结合至哺乳动物细胞的神经节苷脂（ganli〇side)GMl受体。LT-B亚单位是能调节免疫应答的有效力的信号分子。LTB的免疫刺激效应似乎与其增加抗原经由I类（MHC-I)和II类（MHC-II)主要的组织相容性复合物（除了其它因子以外）的递送能力有关。LTB的佐剂作用又与经由B细胞和⑶4+T细胞的活化，借助于这些细胞的B亚单位五聚物与GM1受体的相互作用而结合至GM1的活性直接相关。此外，LTB经由树突细胞（DC)及其它抗原呈递细胞（APC)的活化增加抗原呈递。结合至神经节苷脂GM1的LTB允许毒性A亚单位进入细胞[Spangler,B.D.(1992)StructureandfunctionofcholeratoxinandtherelatedEscherichiacoliheat-labileenterotoxin.MicrobiolRev.56:622-647]〇[0024]LT用作佐剂是不推荐的，原因在于A亚单位的毒性。因为B亚单位没有毒性，所以它已被更频繁地用作佐剂[deHaan,L.，Verweij,W.R.，Feil,I.K.，Holtrop,M.，Hoi,W.G.，Agsteribbe，E?以及Wilschut，J.(1998)RoleofGMlbindinginthemucosalimmunogenicityandadjuvantactivityoftheEscherichiacoliheat-labileenterotoxinanditsBsubunit.Immunology,94:424-430]〇[0025]造成LT的免疫原性和保护效能提高的免疫调节性质已被广泛研究。虽然造成这种作用的机制没被充分表征，但是一些方面如炎性细胞因子的增加及趋化因子的产生以及免疫系统的效应细胞至发炎部位的瞬时募集已被确认为重要因素。LT还可以影响树突细胞成熟、抗原呈递以及T细胞活化，此外还在动物模型中促进由抗原特异性细胞毒性T细胞诱导的应答。LT用作佐剂通常导致细胞因子的平衡，包括在小鼠和人类中通过具有Thl和Th2特征的细胞因子以及一些抗体种类产生应答。[0026]这种毒素在当其与另一抗原同时存在于粘膜表面上或者通过口服、鼻内或肠胃外给药时，能够激活针对所述另一抗原的免疫应答[Holmgren，J.，Lycke，N.以及Czerkinsky,C.(1993)CholeratoxinandcholeraBsubunitasoral-mucosaladjuvantandantigenvectorsystems.Vaccine,11:1179-1184]〇[0027]由于这些性质，所以LT已被广泛地用作动物模型中的佐剂。然而，尽管LT有免疫调节作用，但所述物质具有高毒性并且不适合于人类的临床使用。因此，为了避免与使用天然毒素相关的毒性，同时维持其佐剂性质，已经使用不同的策略，包括分离B亚单位（无毒的）以及构建含有特异性定点突变的LT的无毒突变体。使用LT蛋白质的结构的计算建模研究，已经能够鉴定潜在地涉及这种蛋白质的酶活性中的一些氨基酸，这可以经由它们通过定点突变的交换进行研究[Magagnoli，C?等人，（1996)InfectImmun.64:5434-5438]。这些突变体中的一些，如LTR192G(在位置192处用甘氨酸取代精氨酸），在蛋白酶敏感的处理区具有突变，使得这一区域对蛋白酶的作用不敏感，蛋白酶的作用是酶活性，并且因此是其毒性激活的一个必要阶段。其它突变体显示在A亚单位的酶活性区中的突变，如LTR72(在位置72处用精氨酸取代丙氨酸），这保持了仅1%的ADP-核糖基转移酶活性。[0028]另一个重要的突变体是LTK63(在位置63处用赖氨酸取代丝氨酸）。这个突变在消除毒性的同时消除了与毒性相关的ADP-核糖基转移酶活性。然而，它保留了所有其它的生物学性质，包括天然LT的佐剂性质[Pizza，M.，等人，（2001)Mucosalvaccines:nontoxicderivativesofLTandCTasmucosaladjuvants.Vaccine,19:2534-2541]〇[0029]LTK63已经显示当以胃肠外方式或经由粘膜给药时作为有力的佐剂。DeHaan和合作者[DeHaan,L.，Holtrop,M.，Verweij,W.R.，Agsteribbe,E?以及Wilschut,J.(1999)MucosalimmunogenicityandadjuvantactivityoftherecombinantAsubunitoftheEscherichiacoliheat-labileenterotoxin.Immunology,97:706-7013]建议使用与LTB五聚物相关联的无毒LTA的佐剂可能比单独使用B亚单位的佐剂更有效，因为所述复合物与单独的每个分子相比可以更强烈地刺激免疫系统。指示无酶活性的A亚单位在诱导免疫应答以及免疫调节活性（如对抗原加工和呈递的作用）中的重要功能的数据支持这一观点。[0030]LT和其变体的表达[0031]重组LTB和LTK63通常在大肠杆菌中表达。然而，已经使用其它表达系统。LTB分子在牛分枝杆菌BCG、干酪乳杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤氏酵母、以及包括水稻（米）、莴苣（Lactucasativa或lettuce)以及透明豆瓣绿中表达。LTK63还已在烟草和叶绿体以及减毒的肠道鼠伤寒沙门氏菌（SalmonellaentericaserovarTyphimurium)中表达[daHora,V.P.等人（2011)Non_toxicderivativesofLTaspotentadjuvants.Vaccine,29:1538-1544]。[0032]然而，所有这些研究的目标是使用LT分子或其亚单位或变体中之一来产生抗大肠杆菌的疫苗。LT在结核病疫苗中的使用未曾在现有文献中被描述或提示。[0033]发明目的[0034]本发明的一个目的是提供重组分枝杆菌菌株，其编码突变的大肠杆菌不耐热毒素LT或突变的大肠杆菌不耐热毒素LT的A亚单位。[0035]具体地，本发明的一个目的是提供牛分枝杆菌卡介苗（BCG)的重组菌株，其编码突变的大肠杆菌不耐热毒素LT或突变的大肠杆菌不耐热毒素LT的A亚单位。[0036]更具体地，本发明的一个目的是提供分枝杆菌，特别是牛分枝杆菌卡介苗（BCG)的菌株，其编码在位置63处突变的大肠杆菌不耐热毒素LT或A亚单位。[0037]更具体地，本发明的一个目的是提供分枝杆菌、具体地牛分枝杆菌卡介苗（BCG)的菌株，其编码在位置63处由丝氨酸向赖氨酸突变的大肠杆菌不耐热毒素LT或A亚单位，分别是rBCG-LTK63和rBCG-LTAK63。[0038]本发明还旨在提供包括本发明的菌株的免疫原性组合物。[0039]本发明的另一目的是提供上述菌株和免疫组合物在生产用于预防结核病和/或由结核分枝杆菌或其它分枝杆菌引起的感染的疫苗中的用途。[0040]具体地，本发明的目的是提供针对结核病的改进的BCG疫苗（即，诱导比常规BCG菌株更好的保护），其包括本发明的牛分枝杆菌卡介苗（BCG)的重组菌株。[0041]本发明还被计划提供用于在动物、更具体地在人类中预防或治疗结核病的方法。[0042]定义[0043]缩写在本专利申请的范围内使用若干次。如本申请中使用的定义概述如下：[0044]?BCG是指减毒的牛分枝杆菌，卡介苗；[0045]?LTK63是指含有通过定点诱变来修饰的A亚单位的大肠杆菌不耐热毒素；[0046]?LTAK63是指大肠杆菌不耐热毒素通过定点诱变进行修饰的A亚单位；以及[0047]?rBCG-LTK63或rBCG-LTAK63是指表达LTK63或LTAK63的重组BCG。【专利附图】【附图说明】[0048]下图是本申请的一部分并且被在此包括来说明本发明的某些方面。参考这些图中的一个或多个以及在此给出的所选形式的详细说明可以更好地理解本发明的目的。[0049]图1说明含有PCR产物的琼脂糖凝胶，其证实LTK63基因在重组BCG(rBCG-LTK63)中的存在。PCR产物由使用特异性起始剂寡核苷酸从rBCG-LTK63构建提取的质粒DNA扩增以扩增LTA亚单位或LTB单位。1Kb加（plus)，分子量；孔1，完整的LTA片段（?700bp);孔2,完整的LTB片段（?316bp)。[0050]图2说明在重组BCG中LTAK63表达（?31.OkDa)的表征。将用pLNIP-LTAK63(A)或空的BCG作为阴性对照⑶转化的rBCG的可溶性蛋白质（?10yg)的提取物用于这个免疫测定中。使用抗LT1:1000(多克隆）兔血清。[0051]图3和图4说明针对由BCG培养基上清液-PDS回收的蛋白质诱导的抗体IgGl和IgG2a的应答的比较分析。来自USP(S3〇Paulo大学）兽医学院的动物设施的四周龄的雌性BALB/c小鼠（18-22g)用BCG或rBCG-LT(图3)或用BCG或rBCG-LTAK63(图4)免疫并且在MTB激发前一天或免疫接种之后90天在分离的血清中测定同种型。通过ELISA，使用特异性小鼠抗IgGl和IgG2a抗体个别地分析每组5只动物的血清。[0052]图5和图6说明由在H)S存在下培养的脾细胞产生IFN-Y。雌性BALB/c小鼠用1X106CFU的BCG或rBGC-LT(图5)或BCG或rBCG-LTAK63(图6)免疫并且分别在4周或8周之后回收脾并且在2.Oilg/mLPDS存在下体外培养（2X106个细胞/孔）单细胞制剂。48h之后回收培养物的上清液并通过ELISA测定IFN-Y的水平。[0053]图7和图8说明由在H)S存在下培养的脾细胞产生TNF-a。雌性BALB/c小鼠用1X106CFU的BCG或rBGC-LT(图7)或BCG或rBCG-LTAK63(图8)免疫。4周（图7)或8周（图8)之后，回收脾并在2.0yg/mLPDS的存在下体外培养（2X106个细胞/孔）单细胞制剂。在24h(图7)或48h(图8)之后回收培养基上清液并且通过ELISP0T(图7)或ELISA(图8,分别地）测定TNF-a水平。SFU=斑点形成单位。[0054]图9和图10说明分别产生细胞因子INFi和TNF-a的⑶4+T细胞的概况。雌性BALB/c小鼠（n=5/组）用1x106CFU/动物的BCG或rBCG-LTK63经由单一皮下注射来免疫。非免疫组用作阴性对照。免疫接种之后八周，回收脾并且在2.Oilg/mLPDS的存在下体外培养（2X106个细胞/孔）单细胞制剂。产生各种细胞因子的CD4+T细胞的概况通过流式细胞术（FAC)使用以适当荧光染料标记的特异性抗⑶4、抗INF-Y以及抗TNF-a抗体进行分析。[0055]图11说明涉及用结核分枝杆菌H37Rv菌株进行气管内激发的保护测定的结果。雌性BALB/c小鼠（n=10/组）A和B用牛分枝杆菌BCG或用rBCG-LT的单一注射进行皮下免疫。非免疫组用作阴性对照。免疫接种之后八周，动物通过气管内途径用1X105CFU的结核分枝杆菌H37Rv来激发。误差棒表示与平均值的标准偏差。A和B表示在相同条件下在不同时间进行的两项测定。C表示用以牛分枝杆菌BCG或rBCG-LTA的单一注射皮下免疫的雌性C57BL/6小鼠（n=10/组）进行的测定。免疫接种之后八周，动物通过气管内径路用1X105CFU的结核分枝杆菌H37Rv来激发。误差棒表示与平均值的标准偏差。[0056]发明详述[0057]菌株的描述[0058]本发明涉及编码突变的大肠杆菌不耐热毒素LT的重组分枝杆菌菌株。[0059]本发明还涉及编码突变的大肠杆菌不耐热毒素LT的A亚单位的重组分枝杆菌菌株。[0060]具体地，本发明涉及分枝杆菌菌株，其编码在位置63处突变的大肠杆菌不耐热毒素LT或不耐热毒素LT的A亚单位。[0061]更具体地，本发明涉及分枝杆菌菌株，其编码在位置63处由丝氨酸向赖氨酸突变的大肠杆菌不耐热毒素LT或不耐热毒素的A亚单位，分别是rBCG-LTK63和rBCG-LTAK63。[0062]上述突变允许由分枝杆菌编码的大肠杆菌不耐热毒素LT或大肠杆菌不耐热毒素LT的A亚单位维持天然LT的佐剂性质，然而它们失去与毒性相关的ADP-核糖基转移酶活性，因此在人或其它动物的情况下避免毒性问题。[0063]编码在其序列中呈现其它突变的不耐热毒素LT或大肠杆菌不耐热毒素LT的A亚单位的分枝杆菌菌株也包括在本发明中，所述其它突变靶定相同作用，即：天然LT的佐剂性质的维持以及毒性的降低或抑制也包括在本发明中。此类突变可以包括但不限于位置72和192。[0064]本发明的菌株是从分枝杆菌属的任何菌株作为用于呈递不同有机体的一种或多种抗原的载体获得，其在分枝杆菌中在表达载体中获得并克隆并且通过基因操作插入。[0065]本发明的重组分枝杆菌菌株优选包括以下菌株：MTB复合物，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、马科福特分枝杆菌以及非洲分枝杆菌；或快速生长分枝杆菌，耻垢分枝杆菌、金色分枝杆菌、牝牛分枝杆菌等等。[0066]本发明的重组分枝杆菌菌株更优选地包括牛分枝杆菌卡介苗（BCG)菌株。[0067]免疫原性组合物的描述[0068]本发明涉及免疫原性组合物，其包括本发明的一种或多种菌株以及生理学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或溶剂中的一种或多种。[0069]本发明的组合物优选包括牛分枝杆菌卡介苗（BCG)菌株，其编码在位置63处由丝氨酸向赖氨酸突变的不耐热毒素LT，即rBCG-LTK63。[0070]可选地，本发明的组合物优选包括牛分枝杆菌卡介苗（BCG)的菌株，其编码在位置63处由丝氨酸向赖氨酸突变的不耐热毒素LT的A亚单位，即rBCG-LTAK63。[0071]本发明的组合物还可以包括牛分枝杆菌卡介苗（BCG)菌株的混合物，其编码在位置63处由丝氨酸向赖氨酸突变的不耐热毒素LT，即rBCG-LTK63,以及在位置63处由丝氨酸向赖氨酸突变的不耐热毒素LT的A亚单位，即rBCG-LTAK63。[0072]本发明的免疫原性组合物还可另外涉及一种或多种抗原，优选灭活毒素。这样的抗原可以用于预防和/或治疗结核病或由不同病原体引起的其它疾病。本发明的协同免疫原性组合物的灭活组分可使用技术中已知的任何方法获得，如化学过程，如用甲醛或过氧化氢处理，或甚至DNA重组技术。[0073]根据本发明，佐剂是减毒的或死的分子、组分、大分子或微生物，其能够对免疫接种应答，减少所需抗原的量并引导将要显现的免疫应答的类型，此外作为免疫原使应答持续较长时段；其是改变免疫应答的类型、速度、强度或持续时间的任何材料或物质。[0074]本发明的组合物还可以包括赋形剂，如杀细菌剂、抑菌剂、抗氧化剂、防腐剂、缓冲剂、稳定剂、pH调节剂、渗透性调节剂、止泡剂及表面活性剂；以及抗原灭活的残基或分级剂、生长培养基组分以及疫苗生产中常用的溶剂；这些类型的组分的实例可以见于EpidemiologyandPreventionofVaccine-PreventableDiseasesThePinkBook,第11片反，"VaccineExcipient&MediaSummary"（CentersforDiseaseControlandPrevention.EpidemiologyandPreventionofVaccine-PreventableDiseases.AtkinsonW，WolfeS，HamborskyJ，McIntyreL编，第11版WashingtonDC:PublicHealthFoundation，2009)中，所述文献通过引用并入本文。[0075]如用于本发明中，使用术语"药学上可接受的"意指惰性无毒固体、半固体液体赋形剂、稀释剂、任何种类的辅助制剂、或仅仅是无菌含水介质，如盐水溶液。可以充当药学上可接受的载体的物质的一些实例是糖，如乳糖、葡萄糖及蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠盐、乙基纤维素及乙酸纤维素、环糊精；油类，如花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油；二醇类，如丙二醇；聚油类，如甘油醇、山梨糖醇、甘露醇及聚乙烯；酯类，如十二烷酸乙酯、油酸乙酯、琼脂；缓冲剂，如氢氧化铝和氢氧化镁；褐藻酸；无热原水；等渗盐水、林格氏溶液（Ringer'ssolution);乙醇与磷酸盐的缓冲溶液；以及用于药物制剂中的其它相容的无毒物质。[0076]用于本发明中所述的免疫疗法组合物和疫苗的一系列给药途径是可利用的。所选的具体方法将取决于所选的具体活性成分、针对治疗效能的必需剂量以及将要被给药所述组合物的患者。本发明的方法一般可以使用任何生物学上可接受的给药手段来实施，即：产生有效水平的免疫应答而没有引起临床上不希望有的不良反应的任何方法。这样的给药方法包括皮内、口服、直肠、舌下、局部、鼻、经皮或胃肠外途径。术语"胃肠外"包括皮下、静脉内、硬膜外、灌洗、肌内、释放或输注泵。在本发明中，特别地，皮内、口服、肠胃外以及经鼻途径优选用于给药在此主张的组合物。[0077]对于胃肠外施给药，活性成分可以溶解于药物载体中并且作为溶液剂、或乳剂(包括微乳剂和纳米乳剂）、或混悬剂给药。适当的载体的实例是水、盐水、葡萄糖溶液、果糖溶液或者动物、植物或合成来源的油。[0078]对于经鼻给药，活性成分可以溶解于药物载体中并且作为溶液剂、或乳剂（包括微乳剂和纳米乳剂）、或混悬剂给药。适当的载体的实例是水和盐水溶液或固体混悬液，如喷雾剂、乳糖、果糖或壳聚糖薄片。其它载体还可以含有其它成分，例如：防腐剂、悬浮剂、增溶剂、缓冲剂等。[0079]本发明的免疫原性组合物优选用于皮内、口服以及胃肠外给药。[0080]本发明的菌株和免疫原性组合物的性质[0081]本发明的菌株和免疫原性组合物呈现对于针对分枝杆菌的免疫应答意料不到的协同效应。LTK63或LTAK63的重组抗原呈现出诱发针对实际分枝杆菌的蛋白质的佐剂效应的意料不到的技术效果。[0082]如在以下实施例中可见，本发明的菌株和免疫原性组合物呈现出与包括传统BCG的疫苗相比产生更强的抗TB免疫应答的意料不到的技术效果。换句话说，免疫原性结构域如大肠杆菌不耐热毒素（已知所述不耐热毒素不与任何类型的分枝杆菌成键）的无毒亚单位LTAK63在重组分枝杆菌（具体地，BCG)中的加入带来对结核病的保护应答的增强。[0083]具体地，本发明的菌株和免疫原性组合物促进动物结核病模型中肺中的杆菌负荷的下降。[0084]此外，本发明的菌株和免疫原性组合物造成与对照组相比IFN-Y表达的显著增力口，IFN-Y是一种被认为在针对结核病的应答中必需的细胞因子；该事实指示Thl极化应答。[0085]本发明的菌株和免疫原性组合物还导致TNF-a的显著增加。因为TNF-a是作为促炎性作用的相关信号员（signaler)，表征由杆菌触发的炎症过程的急性期，所以本发明的疫苗促进免疫系统的直接活化。[0086]最终，可以得出结论，本发明的菌株和免疫原性组合物将分枝杆菌（具体地，BCG)与其它病原体（优选大肠杆菌）的毒素衍生物组合起来生成重组分枝杆菌菌株，从而构成一种新的疫苗，所述疫苗对于针对结核病的预防或免疫接种比常规的BCG更有力和有效。[0087]本发明的菌株和免疫原性组合物的用途。[0088]考虑到本发明的重组分枝杆菌菌株和免疫原性组合物的性质，本发明的另一方面是使用免疫原性组合物来在动物（更具体地，人类）中预防由分枝杆菌（具体地，结核分枝杆菌）引起的感染。[0089]本发明的另一方面是本发明的一种或多种重组分枝杆菌菌株或一种或多种免疫原性组合物在生产疫苗中的用途。[0090]更具体地，本发明的一方面是本发明的一种或多种重组分枝杆菌菌株或一种或多种免疫原性组合物在生产用于预防和/或治疗结核病和/或由分枝杆菌引起的感染的疫苗中的用途。[0091]本发明的又一方面是用于在动物、更具体地在人类中预防或治疗结核病的方法。实施例[0092]为了更好地理解本发明并清楚地说明所获得的技术进步，以下给出对于本发明进行的不同测定的结果作为实施例。[0093]在实施例1中，描述了本发明的疫苗的获得。其它实施例（2至3)用于说明本发明的疫苗的性质以及用途。这些实施例仅为了说明而提出且决不应视为限制本发明的范围和领域。[0094]实施例1:rBCG-LTK63和rBCG-LTAK63疫苗的获得[0095]这个实施例描述了rBCG-LTK63和rBGC-LTAK63疫苗的获得。[0096]a)制备充足的BCG储备液批次：为了制备充足的BCG的储备液，将一个或多个BCG菌落在Middlebrook7H9加吐温80液体培养基且补充有10%白蛋白葡萄糖过氧化氢酶(MB7H9/Tw/ADC)中培养直到指数生长期。根据制造商（Difco-BD)的Middlebrook7H9培养基的组成：硫酸铵、L-谷氨酸、柠檬酸钠、吡哆醇、生物素、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、硫酸镁、氯化钙、硫酸锌以及硫酸铜。此后，将培养物通过在4000rpm下离心沉淀并且用10%甘油在4°C洗涤两次，接着最终再悬浮于5%原始体积（具有10%甘油）中并在-70°C下保存直到通过用PNL12-LTK63质粒或用pNL12-LTAK63质粒电穿孔进行转化。[0097]b)在本文称为pNL12-LTK63的重组BCG中构建LTK63基因的表达载体：用于在重组BCG中表达LTK63的分枝杆菌表达载体被称为pMIP12并由LeDantec描述[LeDantec等人2001JBacteriol.183:2157-2164]OLTK63基因是由RinoRappuoli博士（Novartis，诺华）友好地捐助。使用常规的分子生物学方法在重组BCG中构建LTK63基因的表达载体。使用以下起始剂寡核苷酸通过PCR扩增LTK63基因：N-端（5'-TAGGGTACCCAAAAATATAACTTCATmTTTTAmT-3')，含有KpnI限制性位点（加下划线的）以及C-端（5'-TAGCTGCAGCTAGTTTTTCATACTGATTGCCC-3')，含有PstI限制性位点（加下划线的）。使用以下PCR条件生成对应于LTK63基因的PCR产物：94°C持续4分钟；25个循环：94°C持续1分钟，50°C持续1分钟及72°C持续30秒；以及最终4°C。接着将这个PCR产物用限制酶KpnI和PstI消化并接着在表达载体PMIP12中克隆，所述表达载体先前也用同样的酶KpnI和PstI消化，由此生成称为PMIP12/LTK63的表达载体。[0098]质粒pNP12-LTK63的基因序列【权利要求】1.重组分枝杆菌菌株，其特征在于其编码突变的大肠杆菌不耐热毒素LT。2.重组分枝杆菌菌株，其特征在于其编码突变的大肠杆菌不耐热毒素LT的A亚单位。3.根据权利要求1或2所述的重组分枝杆菌菌株，其特征在于所述大肠杆菌不耐热毒素LT在位置63处突变。4.根据权利要求3所述的重组分枝杆菌菌株，其特征在于所述突变是用丝氨酸取代赖氨酸。5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组分枝杆菌菌株，其特征在于所述重组分枝杆菌菌株选自由以下菌株组成的组：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、马科福特分枝杆菌、非洲分枝杆菌或耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牝牛分枝杆菌等。6.根据权利要求5所述的重组分枝杆菌菌株，其特征在于所述重组分枝杆菌菌株是牛分枝杆菌卡介苗（BCG)的菌株。7.免疫原性组合物，其特征在于其包含至少一种如权利要求1至6中任一项所定义的重组牛分枝杆菌卡介苗（BCG)菌株，以及生理学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或溶剂中的一种或多种。8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其特征在于其还包括一种或多种抗原。9.根据权利要求7或8所述的免疫原性组合物，其特征在于其是用于皮内、口服或肠胃外给药。10.-种或多种如权利要求1至6中所定义的重组分枝杆菌菌株或一种或多种如权利要求7至9中任一项所定义的免疫原性组合物的用途，其特征在于其用于生产疫苗。11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于其用于生产用于预防和/或治疗由所述分枝杆菌属的细菌引起的疾病和/或感染的疫苗。12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于其用于生产用于预防和/或治疗由结核分枝杆菌引起的疾病和/或感染的疫苗。13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于其用于生产用于预防和/或治疗结核病的疫苗。14.用于在动物中预防或治疗由所述分枝杆菌属的细菌引起的疾病和/或感染的方法，其特征在于将有效量的一种或多种如权利要求1至6中所定义的重组分枝杆菌菌株或一种或多种如权利要求7至9中任一项所定义的免疫原性组合物向所述动物给药。15.用于在动物中预防或治疗结核病的方法，其特征在于将有效量的一种或多种如权利要求1至6中所定义的重组分枝杆菌菌株或一种或多种如权利要求7至9中任一项所定义的免疫原性组合物向所述动物给药。16.根据权利要求14或15中任一项所述的方法，其特征在于所述动物是哺乳动物。17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述哺乳动物是人。【文档编号】C12R1/32GK104271733SQ201380020308【公开日】2015年1月7日申请日期:2013年2月18日优先权日:2012年2月17日【发明者】L·C·德塞凯拉·莱特,I·佩雷拉·纳西门托申请人:布坦坦基金会