纳米孔的制备方法和其用途

纳米孔的制备方法和其用途
【专利摘要】本发明提供用于使用核苷酸类似物和使标签从并入的核苷酸类似物易位通过纳米孔来对核酸测序的系统和方法。在各方面，本发明涉及用于使用标签分子和对从并入所述分子释放的标签易位通过纳米孔进行检测来对核酸测序的组合物、方法和系统。
【专利说明】纳米孔的制备方法和其用途
[0001] 帘叉引巧
[0002] 本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请第61/781,353号、2012年6 月20日提交的美国临时申请第61/662, 330号、2012年6月20日提交的美国临时申请第 61/662, 329号、2012年6月20日提交的美国临时申请第61/662, 334号和2012年4月9 日提交的美国临时申请第61/621，981号的权益，所述申请W全文引用的方式并入本文中。
[0003] 关于联巧赞助的研究的声明
[0004] 本发明在政府支持下在由国家卫生研究院O^JationalInstitutesofHealth)授 予的授权号HG005109下进行。政府拥有本发明中的某些权利。

【背景技术】
[0005] 核酸测序是测定核酸的核酸基体的工艺。所述序列信息可W有助于诊断和/或治 疗受试者。举例来说，受试者的核酸序列可W用来鉴别、诊断和可能开发对于遗传疾病的治 疗。作为另一实例，对于病原体的研究可W导致对于传染疾病的治疗。
[0006] 可获得可W用来对核酸测序的方法。然而，所述方法是昂贵的，并且在一段时间内 并且在一定精确性下可能不会提供序列信息，所述时间和精确性可能为诊断和/或治疗受 试者所必需。


【发明内容】

[0007] 涉及单链核酸分子通过纳米孔的核酸测序方法可能具有不充足的灵敏度。包含 核酸分子的核酸碱基（例如腺嘿岭（A)、胞嚼巧（C)、鸟嘿岭佑)、胸嚼巧（T)和/或尿嚼巧 扣)）可能不提供与彼此充分不同的信号。具体来说，嘿岭（即A和G)具有彼此类似的大 小、形状和电荷，并且在一些情况下提供不充分不同的信号。此外，嚼巧（即C、T和U)具有 彼此类似的大小、形状和电荷，并且在一些情况下提供不充分不同的信号。本文中认识到对 于改进用于核酸分子鉴别和核酸测序的方法的需要。
[0008] 本发明的一方面提供一种用于对核酸分子测序的方法，所述方法包含；(a)提供 包含可个别寻址的纳米孔的芯片，其中所述多个可个别寻址的纳米孔的可个别寻址的纳米 孔在与电极相邻安置的膜中包含纳米孔，其中所述纳米孔与核酸聚合酶连接，并且其中每 个可个别寻址的纳米孔适于检测在加标签的核巧酸聚合后从所述加标签的核巧酸释放的 标签；化）引导所述核酸分子W与所述纳米孔相邻或接近；（C)借助于所述聚合酶，使核巧 酸沿着所述核酸分子聚合W产生与所述核酸分子的至少一部分互补的链，其中在聚合期 间，标签从所述核巧酸的个别核巧酸释放，并且其中所述释放的标签流动通过或接近所述 纳米孔；和（d)借助于所述电极检测所述标签，其中所述标签在从所述个别核巧酸释放之 后进行检测。在一些实施例中，（d)的所述检测进一步包含鉴别所述标签。在一些情况下， 所述方法进一步包含使所述鉴别的标签与一类所述个别核巧酸相关联。在一些情况下，所 述方法进一步包含借助于计算机处理器、基于在聚合期间检测的所述标签的评估来产生所 述核酸分子的核酸序列。
[0009] 本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，所述方法包含；(a)使核酸发 夹连接到双链核酸分子的一端上；化）使所述双链核酸分子与发夹解离W形成单链核酸模 板；（C)使用加标签的核巧酸延伸与所述单链核酸模板杂交的引物，其中与个别核巧酸相 关联的标签在延伸后释放；和（d)借助于纳米孔检测所述释放的标签，由此测定双链核酸 分子的核酸序列。在一些情况下，所述方法进一步包含引导从所述个别核巧酸释放的所述 标签通过所述纳米孔。在一些情况下，所述方法进一步包含引导从所述个别核巧酸释放的 所述标签到与所述纳米孔相邻的位置。
[0010] 本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，所述方法包含；(a)使加标签 的核巧酸W第一速率聚合，其中与个别核巧酸相关联的标签在聚合后释放；和化）通过使 所述标签W第二速率通过纳米孔来检测所述释放的标签，其中所述第二速率大于或等于所 述第一速率。
[0011] 本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，所述方法包含；(a)使加标签 的核巧酸聚合，其中与个别核巧酸相关联的标签在聚合后释放；和化）借助于纳米孔检测 所述释放的标签。在一些情况下，所述方法进一步包含引导从所述个别核巧酸释放的所述 标签通过所述纳米孔。在一些情况下，所述方法进一步包含引导从所述个别核巧酸释放的 所述标签到与所述纳米孔相邻的位置。
[0012] 本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，其包含借助于纳米孔检测核巧 酸向核酸分子中的并入，其中所述核酸分子不通过所述纳米孔。
[0013] 本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，其包含借助于纳米孔检测个别 核巧酸并入事件的副产物。
[0014] 一种用于对核酸分子测序的方法，其包含W大于4O的精确性区别个别核巧酸并 入事件。
[0015] 本发明的另一方面提供一种用于核酸测序的方法，所述方法包含；(a)提供纳米 孔阵列，其中所述阵列中的个别纳米孔与核酸聚合酶结合；和化）用所述聚合酶使加标签 的核巧酸聚合，其中个别加标签的核巧酸包含标签，并且其中所述标签被释放并且借助于 所述纳米孔进行检测。
[0016] 本发明的另一方面提供一种加标签的核巧酸，其中所述核巧酸包含能够在核巧酸 聚合事件中裂解并且借助于包含纳米孔阵列的芯片中的纳米孔进行检测的标签。
[0017] 本发明的另一方面提供一种用于对核酸分子测序的系统，其包含；(a)包含可个 别寻址的纳米孔的芯片，其中所述多个可个别寻址的纳米孔的可个别寻址的纳米孔在与电 极相邻安置的膜中包含至少一个纳米孔，其中每个可个别寻址的纳米孔适于帮助检测在于 与所述核酸分子互补的核酸链中并入加标签的核巧酸后从所述加标签的核巧酸释放的标 签；和化）与所述可个别寻址的纳米孔禪接的计算机处理器，其中所述计算机处理器被程 序化W帮助基于从所述多个可个别寻址的纳米孔接收的电信号来表征所述核酸分子的核 酸序列，其中个别电信号与在于与所述核酸分子互补的核酸链中并入加标签的核巧酸之后 从所述加标签的核巧酸释放的标签相关联。
[0018] 本发明的另一方面提供一种用于对核酸分子测序的方法，所述方法包含W每皿2 至少约500个位点的密度提供可个别寻址的位点阵列，每个位点具有与核酸聚合酶连接的 纳米孔；和在所述阵列的既定位点处，用聚合酶使加标签的核巧酸聚合，其中在聚合后标签 在所述既定位点处被释放并且通过纳米孔进行检测。在一些情况下，所述方法进一步包含 引导借助于处理器、基于所述检测的标签来产生所述核酸分子的核酸序列。
[0019]本发明的另一方面提供一种电导测量系统（^conductancemeasurementsystem)， 其包含；(a)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障（physical barrier)间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；(b)用于施加穿过所述屏 障的电场的构件；（C)用于测量所述电场的变化的构件；（d)至少一种与所述孔隙连接的聚 合酶；和（e)多于一种与所述孔隙连接的磯酸酶。
[0020] 本发明的另一方面提供一种具有W下结构的化合物：
[0021]

【权利要求】
1. 一种电导测量系统，其包含： (a) 第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至 少一个直径是纳米级的孔隙； (b) 用于施加穿过所述屏障的电场的构件； (c) 用于测量所述电场的变化的构件； (d) 至少一种与所述孔隙连接的聚合酶；和 (e) 多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶。
2. 根据权利要求1所述的电导测量系统，其中所述孔隙的直径是约1到10nm。
3. 根据权利要求1所述的电导测量系统，其中所述聚合酶和所述磷酸酶与所述孔隙共 价连接。
4. 根据权利要求1所述的电导测量系统，其中与聚合酶相比更多磷酸酶与所述孔隙连 接。
5. 根据权利要求1到4中任一项所述的电导测量系统，其中所述磷酸酶被定位成使得 在聚合酶反应中由所述聚合酶制造的聚磷酸酯在进入所述孔隙之前与所述磷酸酶相互作 用。
6. 根据权利要求5所述的电导测量系统，其中所述磷酸酶与所述聚磷酸酯之间的相互 作用的速率与所述聚合酶制造所述聚磷酸酯的速率相比更快或相等。
7. 根据权利要求1到6中任一项所述的电导测量系统，其中所述第一和所述第二隔室 中的每一者具有电荷。
8. 根据权利要求1到7中任一项所述的电导测量系统，其中所述孔隙的内部具有负电 荷。
9. 根据权利要求1到8中任一项所述的电导测量系统，其中所述孔隙是生物或合成的。
10. 根据权利要求9所述的电导测量系统，其中所述孔隙是蛋白质的。
11. 根据权利要求10所述的电导测量系统，其中所述孔隙是α溶血素蛋白质。
12. 根据权利要求1到8中任一项所述的电导测量系统，其中所述孔隙是固态孔隙。
13. 根据权利要求1到12中任一项所述的电导测量系统，其中所述孔隙由石墨烯形成。
14. 根据权利要求1到13中任一项所述的电导测量系统，其进一步包含各自具有实质 上相同特征的孔隙的阵列。
15. 根据权利要求1到13中任一项所述的电导测量系统，其进一步包含不同直径的孔 隙的阵列。
16. 根据权利要求1到13中任一项所述的电导测量系统，其进一步包含孔隙的阵列，其 中所述孔隙被配置成施加穿过所述屏障的不同电场。
17. 根据权利要求1到16中任一项所述的电导测量系统，其中所述电导测量系统与 CMOS电子装置集成。
18. 根据权利要求17所述的电导测量系统，其中所述孔隙或孔隙的阵列如图46中所示 直接集成到CMOS模具中。
19. 一种具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发 光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、烧基、稀基、块基、置氣基或其组合，其中R 1是0H，其中R2是H 或0H，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶、胸嘧啶、尿嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中η是1、2、3或4,并且其中所述标签的电 荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反。
20. 根据权利要求19所述的化合物，其中所述标签上的所述电荷的量级与所述化合物 的所述其余部分上的所述电荷的量级相同。
21. 根据权利要求19或20所述的化合物，其中所述标签包含多个乙二醇单元。
22. 根据权利要求19到21中任一项所述的化合物，其中所述标签包含16、20、24或36 个乙二醇单元。
23. 根据权利要求19到22中任一项所述的化合物，其中所述标签包含另一可鉴别部 分。
24. 根据权利要求23所述的化合物，其中所述另一可鉴别部分是基于香豆素的染料。
25. 根据权利要求19到24中任一项所述的化合物，其中所述标签具有正电荷。
26. 根据权利要求19到25中任一项所述的化合物，其中所述标签的去除改变所述化合 物的电荷。
27. 根据权利要求19到26中任一项所述的化合物，其中所述标签进一步包含适当数目 的赖氨酸或精氨酸以平衡磷酸酯的数目。
28. -种组合物，其包含四种不同类型的具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发 光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、烧基、稀基、块基、置氣基或其组合，其中R 1是0Η，其中R2是H 或0Η，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中η是1、2、3或4,其中所述标签的 电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中第一类型的化合物的碱基是腺 嘌呤或其衍生物，第二类型的化合物的碱基是鸟嘌呤或其衍生物，第三类型的化合物的碱 基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四类型的化合物的碱基是胸嘧啶或其衍生物或尿嘧啶或其 衍生物，并且其中每种类型的化合物上的标签不同于所述其它三种类型的化合物中的每一 者上的标签。
29. 根据权利要求28所述的组合物，其进一步包含第五类型的化合物，其在所述碱基 方面和在所述标签方面不同于所述四种类型的化合物中的每一者，其中如果所述第四类型 的化合物的所述碱基是胸嘧啶或其衍生物，那么所述第五类型的化合物的碱基是尿嘧啶或 其衍生物，或其中如果所述第四类型的化合物的所述碱基是尿嘧啶或其衍生物，那么所述 第五类型的化合物的所述碱基是胸嘧啶或其衍生物。
30. -种用于确定化合物的身份的方法，其包含： (a) 使所述化合物与包含以下的电导测量系统接触：（i)第一和第二隔室，其中第一与 第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；（ii)用 于施加穿过所述屏障的电场的构件；（iii)用于测量所述电场的变化的构件； (b) 记录当所述化合物易位通过所述孔隙时的所述电场的所述变化，其中所述电场的 所述变化是所述化合物、所述电解质与所述孔隙之间的相互作用的结果，并且指示所述化 合物的大小、电荷和组成， 由此使得所述变化与预定值之间相关以确定所述化合物的身份。
31. 根据权利要求30所述的方法，其进一步包含在步骤（a)之前用磷酸酶处理所述化 合物的步骤。
32. -种用于确定化合物是标签还是所述标签的前体的方法，其包含： (a) 使所述化合物与包含以下的电导测量系统接触：（i)第一和第二隔室，其中第一与 第二电解质溶液由物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；（ii)用 于施加穿过所述屏障的电场的构件；（iii)用于测量所述电场的变化的构件； (b) 记录当所述化合物易位通过所述孔隙时的所述电场的所述变化；和 (c) 将所述电场的所述变化与对应于所述标签和所述标签的所述前体的预定值比较， 由此确定所述化合物是所述标签还是其所述前体。
33. 根据权利要求30到32中任一项所述的方法，其进一步包含在步骤（a)中调节所述 电场的电流偏置的步骤。
34. -种用于测定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含： (a)使所述单链DNA与 包含以下的电导测量系统接触：（i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由 物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；（ii)用于施加穿过所述屏 障的电场的构件；（iii)用于测量所述电场的变化的构件；（iv)至少一种与所述孔隙连接 的聚合酶；和（V)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和 一种组合物，其包含四种不同类型的具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发 光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、烧基、稀基、块基、置氣基或其组合，其中R1是0H，其中R2是H 或0H，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中η是1、2、3或4,其中所述标签的 电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中第一类型的化合物的碱基是腺 嘌呤或其衍生物，第二类型的化合物的碱基是鸟嘌呤或其衍生物，第三类型的化合物的碱 基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四类型的化合物的碱基是胸嘧啶或其衍生物，并且其中每 种类型的化合物上的标签不同于所述其它三种类型的化合物中的每一者上的标签， 其中所述单链DNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述 单链DNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链DNA的在所述单链DNA 的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在 允许所述聚合酶催化所述化合物之一并入到所述引物中的条件下，以便形成DNA延伸产 物， 其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯， 其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标 签； (b) 通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤（a)易位通过所述孔隙中产生的由所 述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成 步骤（a)中的所述DNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所 述单链DNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和 (c) 对于所测序的所述单链DNA的每种核苷酸残基重复进行步骤（b)， 由此测定所述单链DNA的所述核苷酸序列。
35. -种用于测定单链DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含： (a)使所述单链DNA与 包含以下的电导测量系统接触：（i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由 物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；（ii)用于施加穿过所述屏 障的电场的构件；（iii)用于测量所述电场的变化的构件；（iv)至少一种与所述孔隙连接 的聚合酶；和（V)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和 一种具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发 光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、烧基、稀基、块基、置氣基或其组合，其中R 1是0H，其中R2是H 或0H，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶、胸嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中η是1、2、3或4,并且其中所述标签的电荷相对于 所述化合物的其余部分上的电荷正负相反， 其中所述单链DNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述 单链DNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链DNA的在所述单链DNA 的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在 允许所述聚合酶催化其并入到所述引物中的条件下，以便形成DNA延伸产物， 其中如果不并入所述化合物，那么反复重复接触不同化合物直到并入化合物，其限制 条件为（1)所述化合物上的碱基的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的碱基的类 型，和（2)所述化合物上的标签的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的标签的类 型， 其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯， 其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标 签； (b) 通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤（a)易位通过所述孔隙中产生的由所 述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成 步骤（a)中的所述DNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所 述单链DNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和 (c) 对于所测序的所述单链DNA的每种核苷酸残基反复进行步骤（a)和（b)，由此测定 所述单链DNA的所述核苷酸序列。
36. -种用于测定单链RNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含： (a)使所述单链RNA与 包含以下的电导测量系统接触：（i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由 物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；（ii)用于施加穿过所述屏 障的电场的构件；（iii)用于测量所述电场的变化的构件；（iv)至少一种与所述孔隙连接 的聚合酶；和（V)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和 一种组合物，其包含四种不同类型的具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发 光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、烧基、稀基、块基、置氣基或其组合，其中R 1是0H，其中R2是H 或0H，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中η是1、2、3或4,其中所述标签的 电荷相对于所述化合物的其余部分上的电荷正负相反，其中第一类型的化合物的碱基是腺 嘌呤或其衍生物，第二类型的化合物的碱基是鸟嘌呤或其衍生物，第三类型的化合物的碱 基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四类型的化合物的碱基是尿嘧啶或其衍生物，并且其中每 种类型的化合物上的标签不同于所述其它三种类型的化合物中的每一者上的标签， 其中所述单链RNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述 单链RNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链RNA的在所述单链RNA 的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在 允许所述聚合酶催化所述化合物之一并入到所述引物中的条件下，以便形成RNA延伸产 物， 其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯， 其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标 签； (b) 通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤（a)易位通过所述孔隙中产生的由所 述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成 步骤（a)中的所述RNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所 述单链RNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和 (c) 对于所测序的所述单链RNA的每种核苷酸残基重复进行步骤（b)， 由此测定所述单链RNA的所述核苷酸序列。
37. -种用于测定单链RNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含： (a)使所述单链RNA与 包含以下的电导测量系统接触：（i)第一和第二隔室，其中第一与第二电解质溶液由 物理屏障间隔开，所述屏障具有至少一个直径是纳米级的孔隙；（ii)用于施加穿过所述屏 障的电场的构件；（iii)用于测量所述电场的变化的构件；（iv)至少一种与所述孔隙连接 的聚合酶；和（V)多于一种与所述孔隙连接的磷酸酶，和 一种具有以下结构的化合物：
其中所述标签包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发 光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、烧基、稀基、块基、置氣基或其组合，其中R 1是0H，其中R2是H 或0H，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶、尿嘧啶或这些碱基之一的衍生物，其中η是1、2、3或4,并且其中所述标签的电荷相对于 所述化合物的其余部分上的电荷正负相反， 其中所述单链RNA在电解质溶液中接触与所述孔隙连接的所述聚合酶，并且其中所述 单链RNA具有与其一部分杂交的引物，如果所述化合物与所述单链RNA的在所述单链DNA 的与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的紧密5'的核苷酸残基互补，那么在 允许所述聚合酶催化其并入到所述引物中的条件下，以便形成RNA延伸产物， 其中如果不并入所述化合物，那么反复重复接触不同化合物直到并入化合物，其限制 条件为（1)所述化合物上的碱基的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的碱基的类 型，和（2)所述化合物上的标签的类型不同于所述先前化合物中的每一者上的标签的类 型， 其中所述化合物的并入导致释放有所述标签与其连接的聚磷酸酯， 其中与所述孔隙连接的所述磷酸酶使所述标签从所述聚磷酸酯裂解以释放所述标 签； (b) 通过施加穿过所述屏障的电场并且测量步骤（a)易位通过所述孔隙中产生的由所 述标签引起的穿过所述孔隙的电子变化，来确定哪种化合物已经并入到所述引物中以形成 步骤（a)中的所述RNA延伸产物，其中所述电子变化对于每种类型的标签不同，由此鉴别所 述单链RNA中与所述并入的化合物互补的所述核苷酸残基；和 (c) 对于所测序的所述单链RNA的每种核苷酸残基反复进行步骤（a)和（b)，由此测定 所述单链RNA的所述核苷酸序列。
38. 根据权利要求34到37中任一项所述的方法，其中与聚合酶相比更多磷酸酶与所述 孔隙连接。
39. 根据权利要求34到37中任一项所述的方法，其中所述单链DNA或RNA通过使双链 DNA或RNA变性而获得，以适用者为准。
40. 根据权利要求34到37中任一项所述的方法，其中相同单链DNA或RNA的多个拷贝 固定于珠子上。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述单链DNA或RNA的所述核苷酸序列使用所 述相同单链DNA或RNA的多个拷贝来测定。
42. 根据权利要求34到41中任一项所述的方法，其进一步在每个反复的步骤（b)之后 包含洗涤步骤以去除未并入的化合物以免与所述单链DNA或RNA接触。
43. 根据权利要求34到42中任一项所述的方法，其进一步在每个反复的步骤（b)之后 包含确定与所述标签连接的另一可鉴别部分的身份的步骤。
44. 根据权利要求34到43中任一项所述的方法，其中至少85-99%的所述释放的标签 易位通过所述孔隙。
45. 根据权利要求34到44中任一项所述的方法，其中所述化合物进一步包含可逆终止 子。
46. 根据权利要求45所述的方法，其进一步包含在每个反复的步骤（b)之后去除所述 可逆终止子的步骤。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中所述可逆终止子通过生物手段、化学手段、物理 手段或通过光照射而去除。
48. 根据权利要求34到47中任一项所述的方法，其中所述孔隙的内部的电荷相对于所 述标签或有所述标签与其连接的所述聚磷酸酯的电荷正负相反。
49. 根据权利要求34到48中任一项所述的方法，其中所述电导测量系统的所述第一和 所述第二隔室中的每一者具有电荷。
50. 根据权利要求49所述的方法，其中所述第一与所述第二隔室的所述电荷极性相 反。
51. 根据权利要求49所述的方法，其中所述第一和所述第二隔室的所述电荷是可调节 的。
52. 根据权利要求34到51中任一项所述的方法，其中在步骤（b)中所述标签易位通过 所述孔隙的速率基于标签的所述电荷以及所述第一和所述第二隔室的所述电荷来测定。
53. 根据权利要求34到52中任一项所述的方法，其中所述第一和所述第二隔室中的每 一者的电荷使得在步骤（b)中所述标签以与在步骤（a)中所述标签或有所述标签与其连接 的所述聚磷酸酯被释放的速率相比更快或相等的速率易位通过所述孔隙。
54. -种电导测量系统，其包含： 间隔开至少第一与第二电解质溶液的电阻屏障； 所述电阻屏障包含至少一个直径是纳米级的孔隙； 在所述第一和第二电解质溶液中的至少一者中的至少一种具有标签的化合物； 所述至少一个孔隙被配置成允许离子电流由施加的电势驱动穿过所述第一和第二电 解质溶液； 所述至少一个孔隙包含被配置成使所述标签从所述化合物裂解以释放所述标签的特 征；和 测量所述离子电流的构件和将其时间过程记录为时间序列的构件，所述时间序列包括 所述至少一个孔隙不受所述标签阻塞的时间段以及所述标签产生降低的电导的脉冲的时 间段。
55. 根据权利要求54所述的电导测量系统，其中所述标签在所述孔隙中的滞留时间大 于测量所述离子电流的所述构件的离子电流带宽和电流散弹噪声的限度。
56. -种将电导时间序列的片段划定为与不受阻塞的孔隙电导水平统计一致的区域和 降低的电导的脉冲以及降低的电导的个别脉冲内的统计稳定片段的方法，所述电导时间序 列用包含以下的电导测量系统产生： 间隔开至少第一与第二电解质溶液的电阻屏障； 所述电阻屏障包含至少一个直径是纳米级的孔隙； 在所述第一和第二电解质溶液中的至少一者中的至少一种具有标签的化合物； 所述至少一个孔隙被配置成允许离子电流由施加的电势驱动穿过所述第一和第二电 解质溶液； 所述至少一个孔隙包含被配置成使所述标签从所述化合物裂解以释放所述标签的特 征；和 测量所述离子电流的构件和记录所述电导时间序列的构件，所述时间序列包括所述至 少一个孔隙不受所述标签阻塞的时间段以及所述标签产生降低的电导的脉冲的时间段； 划定电导时间序列的片段的所述方法选自由以下组成的群组： (a) 对从所述原始电导时间序列估计的连续密度隐马尔可夫模型的最大似然状态序列 进行维特比解码； (b) 经由与偏离开放孔隙电导水平的差幅的阈值比较来划定降低的电导的脉冲的区 域；和 (c) 通过估计每一片段的离子电流水平的集中趋势或通过一起测量集中趋势和片段持 续时间来表征降低的电导的脉冲的构件，片段集中趋势的量度选自由以下组成的群组： (i) 作为连续密度隐马尔可夫模型的一部分从所述电导时间序列估计的第一 GMM的高 斯分量的平均参数； (ii) 算术平均值； (iii) 截尾平均值； (iv) 中值；和 (V)样品位置的最大后验概率估计量或样品位置的最大似然估计量。
57. 根据权利要求56所述的方法，其进一步包含以下至少一者： (a) 基于电导片段的集中趋势的所述量度对第二高斯混合模型进行最大似然估计； (b) 借助于插值寻峰，和使所述电导时间序列的片段的集中趋势的估计的经验概率密 度平滑，和对插值函数的导数求根；和 (c) 定位多峰分布估计量的模式的另一构件。
58. -种用于测定溶液中的化合物的至少一个参数的方法，其包含以下步骤： 将第一流体放置于第一储槽中； 将第二流体放置于第二储槽中； 所述第一和所述第二流体中的至少一者包含至少一种化合物，其中所述化合物是加标 签的核苷酸或从加标签的核苷酸裂解的标签； 所述第一储槽中的所述第一流体用电阻屏障与所述第二储槽中的所述第二流体间隔 开； 所述电阻屏障包含至少一个孔隙； 用所述第一与所述第二流体之间的电势使离子电流通过所述第一流体、所述至少一个 孔隙和所述第二流体； 测量通过所述至少一个孔隙的所述离子电流和所述离子电流的变化的持续时间； 所述离子电流的所述测量进行一段时间，以足以测量由所述化合物与所述至少一个孔 隙相互作用而引起的所述离子电流的降低； 和通过数学分析在所述时间段内所述离子电流的所述变化和所述离子电流的所述变 化的所述持续时间，来测定所述化合物的至少一个参数； 所述数学分析包含至少一个选自由以下组成的群组的步骤： i) 作为连续密度隐马尔可夫模型的一部分从所述电导时间序列估计的第一 GMM的高 斯分量的平均参数； ii) 事件平均值抽取； iii) 最大似然事件状态指定； iv) 阈值检测和平均； V)滑动窗分析； vi) 算术平均值； vii) 截尾平均值； viii) 中值；和 ix) 样品位置的最大后验概率估计量或样品位置的最大似然估计量。
59. 根据权利要求56到58中任一项所述的方法，其中所述化合物在测量所述离子电流 的所述降低之前用磷酸酶进行处理。
60. 根据权利要求56到59中任一项所述的方法，其中所述化合物是交替地带电的化合 物，其具有第一净电荷，并且在化学、物理或生物反应之后具有不同的第二净电荷。
61. 根据权利要求56到60中任一项所述的方法，其中所述数学分析选自由以下组成的 群组：GMM、阈值检测和平均以及滑动窗分析。
62. 根据权利要求56到61中任一项所述的方法，其中所述至少一个参数选自由以下组 成的群组：所述化合物的浓度、大小、电荷和组成。
63. 根据权利要求30到53和56到62中任一项所述的方法，其进一步包含校准所述电 导测量系统的步骤。
64. 根据权利要求30到53和56到63中任一项所述的方法，其中精确性大于4 σ。
65. 根据权利要求30到53和56到63中任一项所述的方法，其中所述精确性大于5 σ。
66. 根据权利要求30到53和56到63中任一项所述的方法，其中所述精确性大于6 σ。
67. -种加标签的核苷酸，其中所述核苷酸包含能够在核苷酸聚合事件中裂解并且借 助于纳米孔进行检测的标签。
68. 根据权利要求67所述的核苷酸，其中所述标签与所述核苷酸的5' -磷酸酯连接。
69. 根据权利要求67所述的核苷酸，其中所述标签不是荧光团。
70. 根据权利要求67所述的核苷酸，其中所述标签可通过其电荷、形状、大小或其任何 组合而检测。
71. 根据权利要求1所述的电导测量系统，其中所述第一与第二电解质溶液相同。
72. 根据权利要求54所述的电导测量系统，其中所述第一与所述第二电解质溶液相 同。
73. 根据权利要求56所述的方法，其中所述第一与所述第二电解质溶液相同。
74. 根据权利要求58所述的方法，其中所述第一流体与所述第二流体相同。
75. -种加标签的核苷酸，其中所述核苷酸包含能够在核苷酸聚合事件中裂解并且借 助于纳米孔进行检测的标签。
76. 根据权利要求75所述的核苷酸，其中所述标签与所述核苷酸的5' -磷酸酯连接。
77. 根据权利要求75所述的核苷酸，其中所述标签不是荧光团。
78. 根据权利要求75所述的核苷酸，其中所述标签可通过其电荷、形状、大小或其任何 组合而检测。
79. -种用于核酸测序的方法，所述方法包含提供可个别寻址的位点阵列，每个位点具 有与核酸聚合酶连接的纳米孔；和在所述阵列的既定位点处，用聚合酶使加标签的核苷酸 聚合，其中标签在所述既定位点处被释放并且通过纳米孔进行检测。
【文档编号】C12Q1/42GK104379761SQ201380025837
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年4月8日 优先权日:2012年4月9日
【发明者】静月·居, 希尔·库玛尔, 传娟·陶, 民辰·钱, 詹姆斯·J·拉索, 约翰·J·卡希恩沃维奇, 约瑟夫·W·F·罗伯森 申请人:纽约哥伦比亚大学理事会, 由商务部长代表的美国政府