对于过酸的生产有用的酶的制作方法
【专利摘要】本文提供了乙酰基木聚糖酯酶及其具有过水解活性的变体，以用于从羧酸酯和过氧源来产生过氧羧酸。还提供了包括具有过水解活性的酶催化剂的多组分的过酸生成体系，以及使用本发明的酶催化剂来产生过氧羧酸的方法。具有过水解活性的多肽可被用于产生适合用于诸如清洁、消毒、卫生处理、漂白、木浆加工、纸浆加工、和个人护理应用的多种应用的过氧羧酸。
【专利说明】对于过酸的生产有用的酶
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2012年3月30日提交的美国临时申请61/618, 383的权益，所述文献 全文以引用方式并入本文。
【技术领域】
[0003] 本公开涉及过氧羧酸生物合成和酶催化领域。更具体地，提供了包括具有过水解 活性的酶催化剂的多组分的过酸生成体系。还提供了使用本发明的酶催化剂来产生过氧羧 酸的方法。
【背景技术】
[0004] 过氧羧酸组合物可为有效的抗微生物剂。已经描述了使用过氧羧酸清洁、灭菌 和/或消毒硬质表面、织物、肉制品、活植物组织和医疗器械以杀灭不良微生物生长的方 法（美国专利6, 545, 047 ;美国专利6, 183, 807 ;美国专利6, 518, 307 ;美国专利申请公 布2003-0026846 ;和美国专利5, 683, 724)。过氧羧酸也已被用于多种漂白应用中，包 括但不限于木浆漂白/去木质化和衣物洗涤护理应用（欧洲专利1040222B1 ;美国专利 5, 552, 018 ;美国专利3, 974, 082 ;美国专利5, 296, 161 ;和美国专利5, 364, 554)。在1分 钟至5分钟反应时间内和中性下，所期望的过氧羧酸有效浓度可以根据产品的应用而变化 (例如，对于医疗器械消毒而言大约500ppm至lOOOppm，对于衣物漂白或消毒应用而言大约 30ppm 至 80ppm)。
[0005] 结构上被归类为糖酯酶家族7 (CE-7)的成员的酶，已被用作过水解酶，于碱性至 酸性pH范围（从大约pH 10至大约pH 5)在水中催化过氧化氢（或替代性的过氧化物试 齐U)与羧酸的烷基酯的反应，以产生有效浓度的过氧羧酸，用于诸如消毒（例如医疗器械、 硬质表面、纺织物）、漂白（例如木浆或纸浆加工/去木质化、纺织物漂白和衣物洗涤护理 应用）、和其他衣物洗涤护理应用如脱色、除臭、和消毒的应用、以及个人护理应用（美国专 利 7, 964, 378 ;7, 951，566 ;和 7, 723, 083 ;公布的美国专利申请 2008-0176299, DiCosimo 等人；和公布的美国专利申请2012-0317733和2012-0328534, Chisholm等人）。CE-7酶 类已被发现具有针对酯类尤其是醇、二醇和三醇的乙酰基酯类的过水解的高的特异性活 性。DiCosimo等人报道了来源于多个物种的具有改善的性能的变体CE-7过水解酶（美国 专利 7, 927, 854 ;7, 923, 233 ;7, 932, 072 ;7, 910, 347 ;7, 960, 528 ;8, 062, 875 ;8, 206, 964 ; 8, 389, 254 ;和 8, 389, 255 ;和公布的美国专利申请 2011-0236336 和 2011-0236338)。
[0006] 先前报道的具有过水解活性的CE-7糖酯酶（野生型的和其变体）包含如Vincent 等人所定义的保守的结构性"特征"基序（J. Mol. Biol.，330 :593-606(2003))。更具体地， 被用于在结构式鉴定和定义CE-7糖酯酶家族成员的CE-7特征基序包括三个保守的子基 序：l)Argll8-Glyll9-Glnl20 的 "RGQ" 子基序，2)Glyl86-Xaal87-Serl88-Glnl89-Glyl90 的"GXSQG"子基序，和3) His303-Glu304的"HE"基序（残基编号和取向是相对于作为SEQ ID NO :2提供的海栖热袍菌（Thermotoga maritima)参考序列）。
[0007] 尽管大多数被分类为CE-7糖酯酶的酶包含由Vincent等人定义的特征基 序，有多个不包含"HE"子基序的多肽序列被添加到糖酯酶的家族7(Cantarel等人， "The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy) ：an expert resource for Glycogenomics"，NAR，37 :D233-D238 (2009))。过水解活性在这个子群体内的存在还未被报 道。
[0008] 过水解酶技术向一些应用中的掺入可能需要新的过水解酶的鉴定。如此，仍然存 在鉴定包括具有显著的过水解活性的多肽的另外的酶催化剂的需求。
【发明内容】
[0009] 具有适合用于以有效浓度生产过酸的过水解活性的多种酶已被鉴定。
[0010] 在一个实施例中，提供了酶催化的过酸生成体系，包括一组反应组分，所述反应组 分包含：
[0011] ⑴至少一种选自下列的底物：
[0012] ⑴一种或多种具有以下结构的酯：
[0013] [XlmR5
[0014] 其中
[0015] X =式 R6-C(O)O 的酯基；
[0016] R6 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支化或环状烃基部分，其中 对于R6 = C2-C7, R6任选地包含一个或多个醚键；
[0017] R5 =任选地被羟基取代的CI-C6直链、支化或环状烃基部分，或五元环状杂芳族部 分，或六元环状芳族或杂芳族部分；其中R5中的每个碳原子单独地包含不超过一个羟基，或 不超过一个酯或羧酸基；其中R 5任选地包含一个或多个醚键；
[0018] m = 1至1?5中碳原子数范围内的整数；并且其中所述酯在25°C下具有至少5ppm的 水中溶解度；
[0019] (ii) 一种或多种具有以下结构的甘油酯：
[0020]
【权利要求】
1. 一种生产过氧羧酸的方法，包括： (a) 提供一组包含以下物质的反应组分： (1)至少一种选自下列的底物： (i) 一种或多种具有以下结构的酯： [XlfflR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支化或环状烃基部分，其中对于 R6 = C2-C7, R6任选地包含一个或多个醚键； R5 =任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部分，或五元环状杂芳族部分， 或六元环状芳族或杂芳族部分；其中R5中的每个碳原子单独地包含不超过一个羟基，或不 超过一个酯基或羧酸基；其中R5任选地包含一个或多个醚键； m = 1至R5中碳原子数范围内的整数；并且其中所述酯在25°C下具有至少5ppm的水 中溶解度； (ii) 一种或多种具有以下结构的甘油酯：
其中R1 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C21直链或支链烷基，并且R3和R4单独地为H或R1C(O); (iii) 一种或多种下式的酯：
其中R1 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2 = Cl-ClO直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、（CH2CH2O)"、或 (CH2CH(CH3) -0)nH，并且 n 为 1 至 10 ; (iv) -种或多种酰化的单糖、酰化的二糖、或酰化的多糖；和 (V)⑴至（iv)的任何组合； ⑵过氧源；和 (3)包含多肽的酶催化剂，所述多肽具有过水解活性以及与SEQ ID NO :12中所示的 氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，前提条件是结合至起催化作用的组氨酸的 C-末端侧的氨基酸残基不是谷氨酸； (b) 在合适的反应条件下合并该组反应组分，从而产生过氧羧酸；以及 (c) 任选地，稀释步骤（b)中产生的过氧羧酸。
2. 根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：d)使硬质表面或无生命物体与步骤 (b)或步骤（c)中产生的过氧羧酸接触；从而所述硬质表面或所述无生命物体被消毒、漂 白、脱色或它们的组合。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述无生命物体是医疗器械。
4. 根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：d)使衣物制品或纺织物与步骤（b) 或步骤（c)中产生的过氧羧酸接触；从而所述衣物制品或纺织物获得有益效果。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述有益效果选自消毒、卫生处理、漂白、脱色、除 臭、以及它们的组合。
6. 根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：d)使木浆或纸浆与步骤（b)或步骤 (c)中产生的过氧羧酸接触；从而所述木浆或纸浆被漂白。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述底物选自：甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘 油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯； 甘油三丁酸酯；葡糖五乙酸酯；P -D-半乳糖五乙酸酯、山梨醇六乙酸酯、蔗糖八乙酸酯、 木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；P -D-呋喃核糖-1，2, 3, 5-四乙酸酯； 三-O-乙酰基-D-半乳醛；三-O-乙酰基-D-葡萄烯糖；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙 二醇、1，2-丁二醇、1，3- 丁二醇、2, 3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2, 5-戊二醇、1， 6_戊二醇、1，2-己二醇、2, 5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯；4-乙酰氧基苯甲酸；以及 它们的混合物。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述底物是甘油三乙酸酯。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所产生的过氧羧酸为过乙酸、过丙酸、过丁酸、过 乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-￠-羟基丁酸、或它们的混合物。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述酶催化剂为微生物细胞、透化的微生物细 胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶、或纯化的酶的形式。
11. 一种组合物，包含： (a) -组包含以下物质的反应组分的组： (1)至少一种选自下列的底物： (i) 一种或多种具有以下结构的酯： [XlfflR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支化或环状烃基部分，其中对于 R6 = C2-C7, R6任选地包含一个或多个醚键； R5 =任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部分，或五元环状杂芳族部分， 或六元环状芳族或杂芳族部分；其中R5中的每个碳原子单独地包含不超过一个羟基，或不 超过一个酯基或羧酸基；其中R5任选地包含一个或多个醚键； m = 1至1?5中碳原子数范围内的整数；并且 其中所述酯在25°C下具有至少5ppm的水中溶解度； (ii) 一种或多种具有以下结构的甘油酯：
其中R1 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C21直链或支链烷基，并且R3和R4单独地为H或R1C (O); (iii) 一种或多种下式的酯：
其中R1 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2 = Cl-ClO直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、（CH2CH2O)"、或 (CH2CH(CH3) -0)nH，并且 n 为 1 至 10 ; (iv) -种或多种酰化的单糖、酰化的二糖、或酰化的多糖；和 (V)⑴至（iv)的任何组合； ⑵过氧源；和 (3)包含多肽的酶催化剂，所述多肽具有过水解活性以及与SEQ ID NO :12中所示的 氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，前提条件是结合至起催化作用的组氨酸的 C-末端侧的氨基酸残基不是谷氨酸；和 (b)在混合（a)的该组反应组分时形成的至少一种过氧羧酸。
12. -种过酸生成和递送体系，包括： (a)第一隔室，所述第一隔室包含： (1) 包含多肽的酶催化剂，所述多肽具有过水解活性和与SEQ ID NO :12中所示的氨 基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，前提条件是结合至起催化作用的组氨酸的 C-末端侧的氨基酸残基不是谷氨酸； (2) 至少一种选自下列的底物： (i) 一种或多种具有以下结构的酯： [XlfflR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支化或环状烃基部分，其中对于 R6 = C2-C7, R6任选地包含一个或多个醚键； R5 =任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部分，或五元环状杂芳族部分， 或六元环状芳族或杂芳族部分；其中R5中的每个碳原子单独地包含不超过一个羟基，或不 超过一个酯基或羧酸基；其中R5任选地包含一个或多个醚键； m = 1至1?5中碳原子数范围内的整数；并且 其中所述酯在25°C下具有至少5ppm的水中溶解度； (ii) 一种或多种具有以下结构的甘油酯：
其中R1 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C21直链或支链烷基，并且R3和R4单独地为H或R1C (O); (iii) 一种或多种下式的酯：
其中R1 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2 = Cl-ClO直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、（CH2CH2O)"、或 (CH2CH(CH3) -0)nH，并且 n 为 1 至 10 ; (iv) -种或多种酰化的单糖、酰化的二糖、或酰化的多糖；和 (V)⑴至（iv)的任何组合；和 ⑶任选的缓冲液；和 (b)第二隔室，所述第二隔室包含： (1) 过氧源； (2) 过氧化物稳定剂；和 (3) 任选的缓冲液。
13. 根据权利要求12所述的过酸生成和递送体系，其中所述底物包括甘油三乙酸酯。
14. 一种衣物洗涤护理组合物，包含： a) 多肽，所述多肽具有过水解活性和与SEQ ID NO :12中所示的氨基酸序列具有至少 80%同一性的氨基酸序列，前提条件是结合至起催化作用的组氨酸的C-末端侧的氨基酸 残基不是谷氨酸； b) 至少一种选自下列的底物： (i) 一种或多种具有以下结构的酯： [XlfflR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支化或环状烃基部分，其中对于 R6 = C2-C7, R6任选地包含一个或多个醚键； R5 =任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部分，或五元环状杂芳族部分， 或六元环状芳族或杂芳族部分；其中R5中的每个碳原子单独地包含不超过一个羟基，或不 超过一个酯基或羧酸基；其中R5任选地包含一个或多个醚键； m = 1至1?5中碳原子数范围内的整数；并且 其中所述酯在25°C下具有至少5ppm的水中溶解度； (ii) 一种或多种具有以下结构的甘油酯：
其中R1 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C21直链或支链烷基，并且R3和R4单独地为H或R1C (O); (iii) 一种或多种下式的酯：
其中R1 =任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2 = Cl-ClO直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、（CH2CH2O)"、或 (CH2CH(CH3) -0)nH，并且 n 为 1 至 10 ; (iv) -种或多种酰化的单糖、酰化的二糖、或酰化的多糖；和 (V)⑴至（iv)的任何组合；和 c) 过氧源；和 d) 至少一种表面活性剂。
15. -种个人护理产品，包含具有过水解活性的多肽，所述多肽具有与SEQ ID NO :12 中所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，前提条件是结合至起催化作用的 组氨酸的C-末端侧的氨基酸残基不是谷氨酸。
16. 根据权利要求15所述的个人护理产品，其中所述产品是洗发剂、爽身水、沐浴凝 胶、局部保湿剂、牙膏、牙胶、漱口水、含漱液、抗牙斑漱口液或局部清洁剂。
【文档编号】C12N9/18GK104334736SQ201380028332
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2012年3月30日
【发明者】M.S.佩恩, R.迪科西莫 申请人:纳幕尔杜邦公司