方法和设备的制作方法
【专利摘要】描述了确定胚胎例如体外孵育的人胚胎的发育潜能的方法，以及用于实施此类方法的设备。某些实施例中，方法包括获得与观察期期间胚胎的发育相关的多个形态动力学特征，例如与胚胎的时间或形态发育相关的特征。通过以预定的方式组合获得的这些特征的值与相应的参考值之间的差来确定连续变量的值。可以例如从所获得的至少一个具有已知发育潜能的参考胚胎的多个特征的值来确定参考值。然后基于所确定的连续变量的值来确立胚胎的发育潜能。
【专利说明】方法和设备
【技术领域】
[0001] 本发明涉及确定胚胎发育潜能的方法和设备。
【背景技术】
[0002] 不育症影响全世界8千多万的人。据估计所有夫妻中有10%经历原发性或继发性 不育。辅助生殖治疗（ART)是一种可选的医学治疗，其可为用其他方式无法怀孕的夫妻提 供妊娠的机会。辅助生殖治疗的过程是将卵（卵母细胞）从女性的卵巢中取出，然后在实 验室里用精子受精。然后将该过程中产生的胚胎放置于子宫内以进行可能的着床。为了避 免多次妊娠和多胞胎生育，仅转移少数几个胚胎（一般少于4个，理想情况是只有1个）。 因此选择要转移的胚胎是任何ART中关键的一步，ART结果数据的回顾性分析对于确定改 善的胚胎选择标准非常重要。
[0003] 可用已知的着床数据（KID)来构建、评价和验证胚胎选择模型，其中阳性KID胚胎 是已知后续已着床的胚胎，阴性KID胚胎是已知后续未着床的胚胎。
[0004] 如果胚胎达到了胚泡阶段，也可通过观察来构建、评价和验证胚胎选择模型。
[0005] 目前的选择程序很大程度是基于用标准的立体显微镜在胚胎发育的不同的时间 点对胚胎进行形态学评价，尤其是在转移的时候进行评价。但是，普遍认识到对于改进已知 的评价程序存在着需求。
[0006] 现有的一种方法是使用"早期卵裂"至2-细胞阶段（S卩，在授精/注射之后25_27h 之前）作为质量指标/选择标准。这种方法中，受精之后目视观察胚胎25-27小时以确定 第一次细胞分裂是否已完成。
[0007] 几项研究已表明了与细胞分裂相关的时间确定在确定胚胎质量中的重要性。2001 年，例如，Lundin等人报道了早期的第一次卵裂作为人IVF中胚胎质量的重要指标（Lundin 等，2001) ,Meseguer等报道了几个胚胎形态学参数对于后续胚胎着床的重要性（Meseguer 等，2011)。
[0008] 在Lemmen et al.，2008中使用了缩时（time-lapse)系统来研究在从受精卵至卵 裂状态的胚胎的早期发育期间各事件的发生时间及其协调。受精后原核的早期消失和第一 次卵裂的开始与收获卵母细胞后第2天数量更多的卵裂球相关。此外，第一次卵裂后核同 步出现与妊娠成功相关。
[0009] 近年来，缩时设备被越来越广泛地应用于孵育和监测体外发育过程中的胚胎。缩 时设备是一种在孵育过程中以时间间隔（例如如果需要的话频率可以达每5分钟一次） 拍照（显微镜图像）的装置。与较早期的方式相比，这使得能够容易地确定发育过程中各 细胞事件的更精确的发生时间，例如细胞分裂的发生时间。这些增加的对胚胎发育的了 解使得有可能改善对胚胎的选择（即鉴别具有最大的发育潜能/成功着床可能性的胚胎 的过程）。可在例如以下文献中找到这种方式的一些例子：WO 2012/163363 Al(Unisense Fertilitech),WO 2013/004239 Al(Unisense Fertilitech),WO 2011/025736 Al(Leland Stanford Junior 大学理事会）、US 7, 963, 906B2 (Leland Stanford Junior 大学理事会）， 以及Wong等。
[0010] 然而，虽然早期卵裂的发生时间和其他的发生时间可以有助于提供胚胎发育的质 量指标，但是仍然需要用于更好地确定胚胎诸如体外孵育的人胚胎的发育潜能（活力/质 量）的方法和设备。
[0011] 发明概沭
[0012] 用于从缩时显微镜成像确定胚胎质量的现有的技术一般是基于对给定胚胎发育 事件的发生时间（诸如某一细胞分裂阶段的发生时间）与先前被观察到与高质量胚胎相关 的预定范围的发生时间（例如，基于对阳性KID和阴性KID胚胎的发生时间的分析）的比 较。如果某一胚胎的胚胎发育事件的发生时间落在被认为与高质量胚胎相关的预定范围的 发生时间内，那么该胚胎可被认为是高质量的胚胎。相反，如果该胚胎发育事件的发生时间 落在被认为与高质量胚胎相关的预定范围的发生时间之外，那么该胚胎可被认为是低质量 的胚胎。
[0013] 在这方面，对高质量胚胎（S卩，具有相对高的发育潜能的胚胎）和低质量胚胎 (即，具有相对低的发育潜能的胚胎）的鉴定基于二元模型。虽然这种二元模型简单且稳 定，但是本发明是基于这些模型仅提供相对粗糙的胚胎筛选这一认识完成的。例如，现有的 二元模型不能区分落在"高质量"范围内的不同的胚胎，此外，这些模型不易被修改以引入 另外的变量或考虑患者特征（诸如年龄）的变化。
[0014] 开发了根据本发明某些实施方式的方法，以促进基于胚胎发育过程中提取的形态 学参数和/或动力学参数来选择待被转移用于着床的最优的体外受精胚胎。因此，根据某 些实施方式，用考虑了与胚胎发育相关的多个变量的连续模型来确定胚胎发育潜能。这可 以通过获得与体外胚胎发育相关的多个特征的值来实现，例如使用缩时显微镜成像。然后 可将所述多个不同特征的值与参考值比较，例如通过确定与所确定的阳性KID胚胎的相应 平均值的差，然后组合在一起以产生一个或多个连续变量。然后可基于这些（一个或多个） 连续变量的值来确定胚胎的发育潜能。
【发明内容】
[0015] 根据一个方面，本发明提供一种确定胚胎发育潜能的方法，该方法包括：获得与观 察期期间胚胎发育相关的多个特征的值；通过以预定的方式组合所获得的值与所述多个特 征的相应参考值之间的差来确定连续变量的值；以及，基于所确定的连续变量的值确定胚 胎的发育潜能。
[0016] 根据另一个方面，本发明提供一种确定胚胎发育潜能的设备，该设备包括：数据输 入元件，所述数据输入元件被配置用于获得与观察期期间胚胎发育相关的多个特征的值； 以及处理器元件，所述处理器元件用于通过以预定的方式组合所获得的值与所述多个特征 的相应参考值之间的差来确定连续变量的值并基于所确定的连续变量的值确定胚胎的发 育潜能。
[0017] 附图简沭
[0018] 为了更好地理解本发明并说明本发明如何实施，现在以示例的方式参考附图，附 图中：
[0019] 图1示意性示出了如本文对于卵裂模式所用的一些系统命名，相对于所获得的图 像显示了卵裂时间（t2至t5)、细胞周期持续时间（ccl至cc3)、以及同步时间（synchrony) (s2 和 s3)。
[0020] 图2示意性示出了从初始受精（时间t = 0)和在卵裂时间t2_t8的不同胚胎发 育事件时胚胎外观，以及如本文所用的时间术语的一些相关方面。
[0021] 图3示意性示出了根据本发明实施方式的确定胚胎发育潜能的设备。
[0022] 图4示意性对阳性KID胚胎（以加号⑴表示）和阴性KID胚胎（以减号㈠ 表 示）群体的卵裂时间t2相对于卵裂时间t5进行绘图。
[0023] 图5示意性绘制了来自五个不同诊所的胚胎群体的卵裂时间t5的直方图。
[0024] 图6是一个流程图，示意性表示了一种根据本发明的某些实施方式确定胚胎发育 潜能的方法。
[0025] 图7A、8A、9A和IOA示意性对阳性KID胚胎（以加号⑴表示）和阴性KID胚胎 (以减号（_)表示）群体根据本发明实施方式确定的不同对的参数进行绘图。
[0026] 图7B、8B、9B和IOB是图7B、8B、9B和IOB的左下角的放大图。
[0027] 图11示意性对根据本发明实施方式确定的四个模型的阳性KID胚胎和相应的模 型预测在一定范围的数据百分位数的发生率进行绘图。
【具体实施方式】
[0028] 除非另有定义，本文所用的科技术语具有本公开所属【技术领域】的普通技术 人员通常理解的含义。Singleton等，微生物和分子生物学词典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology), 20Ed. , John Wiley and Sons, New York(1994), 和 Hale&Marham, The Harper Collins 生物学词典（The Harper Collins Dictionary of Biology) ,Harper Perennial, NY(1991)为本领域技术人员提供了本公开中所用的很多术 语的一般词典。
[0029] 本公开内容不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文描述的方法和 材料类似或等同的方法和材料均可用于实施或测试本公开内容的实施方式。
[0030] 当提供一个数值范围时，可以理解，也具体公开了该范围的上限和下限之间的每 个中间数值，直至下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。在某个描述的范围中的 任何描述的数值或中间数值和该描述的范围中的任何其他描述的数值或中间数值之间的 每个较小的范围均涵盖在本公开内容中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或不包 括在该范围中，上限和下限中的一个、零个或俩个包括在该较小范围中的每个范围也涵盖 在本公开内容中，以所描述的范围中任何具体排除的限值为度。当描述的范围包括上限和 下限中的一个或两个时，排除了那些包括的上限或下限的一个或两个的范围也包括在本公 开内容中。
[0031] 必须指出，如本文和所附权利要求书所用，单数形式"a/an ( -"和"该"（或"这"、 "那"、"其"）包括复数指代，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提到"an embryo(-个 胚胎）"时包括多个这种候选胚胎，等等。
[0032] 本文讨论的出版物仅仅是因为它们的
【公开日】期早于本申请的申请日。本文任何内 容都不应理解为承认这些出版物构成了本文所附权利要求书的现有技术。
[0033] 本文引用的所有专利和非专利文献也通过引用以其整体纳入本文。
[0034] 本发明的一些示例性实施方式涉及一种确定胚胎发育潜能的方法，该方法包括： 获得与观察期期间胚胎发育相关的多个特征的值；通过以预定的方式组合获得的值与所述 多个特征的相应参考值之间的差来确定连续变量的值；以及，基于所确定的连续变量的值 确定胚胎的发育潜能。
[0035] 根据一些示例性实施方式，由从至少一个具有已知发育潜能的参考胚胎获得的多 个特征的值确定参考值。
[0036] 根据一些示例性实施方式，组合获得的值与参考值之间的差的步骤考虑了与参考 值中的每一个相关的加权值。
[0037] 根据一些示例性实施方式，加权值是通过由具有已知发育潜能的多个参考胚胎获 得的多个特征的值统计确定的。
[0038] 根据一些示例性实施方式，加权值是通过由多个参考胚胎获得的值的方差来确定 的。
[0039] 根据一些示例性实施方式，所述多个特征与胚胎的形态学发育相关。
[0040] 根据一些示例性实施方式，连续变量代表胚胎的形态学发育中的规律性的量度。
[0041] 根据一些示例性实施方式，所述多个特征与胚胎的时间（temporal)发育相关。
[0042] 根据一些示例性实施方式，连续变量代表胚胎的时间发育中的规律性的量度。
[0043] 根据一些示例性实施方式，所述多个特征包括胚胎的多个细胞周期持续时间cci。
[0044] 根据一些示例性实施方式，所述多个特征包括胚胎的后续细胞分裂之间的多个时 间差Δ t j。
[0045] 本发明的一些示例性实施方式还包括：获得与观察期期间胚胎发育相关的另外的 多个特征的值；通过以另外的预定的方式组合获得的值与所述另外的多个特征的相应参考 值之间的差来确定另外的连续变量的值；以及，还基于所确定的另外的连续变量的值确定 胚胎的发育潜能。
[0046] 根据一些示例性实施方式，用缩时显微镜获得数值。
[0047] 本发明的一些示例性实施方式涉及一种确定胚胎发育潜能的设备，该设备包括： 数据输入元件，所述数据输入元件被配置成获得与观察期期间胚胎发育相关的多个特征的 值；以及处理器元件，所述处理器元件用于通过以预定的方式组合获得的值与所述多个特 征的相应参考值之间的差来确定连续变量的值，并基于所确定的连续变量的值确定胚胎的 发育潜能。
[0048] 本发明的一些示例性实施方式涉及非暂时性（non-transitory)计算机程序产 品，该产品带有用于执行根据本发明其他示例性实施方式的方法的机器可读性指令。
[0049] 本发明的一些示例性实施方式涉及一种设备，该设备加载有机器可读指令，并且 可操作以执行所述机器可读指令，该机器可读性指令用于执行根据本发明其他示例性实施 方式的方法。
[0050] 本文可根据以下定义使用各种术语（除非上下文要求其他含义）。
[0051] 卵裂时间被定义为第一个观察到新形成的分裂球被汇合的细胞膜完全分隔开的 时间点，因此卵裂时间是分裂球分裂完成的时间。在本发明上下文中，各卵裂时间经常被表 示为胞浆内精子注射（ICSI)显微注射之后的小时数，即受精（配子成功融合形成新的有机 体受精卵）时间。因此卵裂时间如下：
[0052] 籲t2:分裂为2分裂球胚胎的时间
[0053] 籲t3:分裂为3分裂球胚胎的时间
[0054] · t4:分裂为4分裂球胚胎的时间
[0055] · t5:分裂为5分裂球胚胎的时间
[0056] · t6:分裂为6分裂球胚胎的时间
[0057] 籲t7:分裂为7分裂球胚胎的时间
[0058] · t8:分裂为8分裂球胚胎的时间
[0059] 籲tn:分裂为η分裂球胚胎的时间
[0060] 第一个细胞周期持续时间CCl是受精至卵裂时间t2(提供第一对子细胞，即最早 出现的第二代细胞）之间的时间段。第二个细胞周期持续时间cc2是卵裂时间t2(提供 第一对子细胞）和卵裂时间t3(提供第一对孙代细胞，即最早出现的第三代细胞）之间的 时间段。第三个细胞周期持续时间cc3是卵裂时间t3(提供第一对孙代细胞）和卵裂时间 t5(提供第一对曾孙代细胞，即最早出现的第四代细胞）之间的时间段。第四个细胞周期持 续时间cc4是卵裂时间t5 (提供第一对曾孙代细胞）和卵裂时间t9 (提供第一对玄孙代细 胞，即最早出现的第五代细胞）之间的时间段。
[0061] 这些细胞周期持续时间因此是基于新的每一代分裂球分裂的最快速度。但是，还 有与较慢的分裂球的分裂相关的其他细胞周期持续时间。
[0062] 例如，除细胞周期持续时间cc2之外，还有细胞周期持续时间cc2b，其对应于卵裂 时间t2(提供第一对子细胞）和卵裂时间t4(提供第二对孙代细胞）之间的时间段。在这 方面，为命名的简单起见，细胞周期持续时间cc2也可称为细胞周期持续时间cc2a。
[0063] 此外，除细胞周期持续时间cc3之外，还有细胞周期持续时间cc3b，其对应于卵裂 时间t3(提供第一对孙代细胞）和卵裂时间t6(提供第二对曾孙代细胞）之间的时间段。 还有细胞周期持续时间cc3c，其对应于卵裂时间t4(提供第二对孙代细胞）和卵裂时间 t7(提供第三对曾孙代细胞）之间的时间段。还有细胞周期持续时间cc3d，其对应于卵裂 时间t4 (提供第二对孙代细胞）和卵裂时间t8 (提供第四对曾孙代细胞）之间的时间段。 在这方面，为命名的一致性起见，细胞周期持续时间cc3也可称为细胞周期持续时间cc3a。
[0064] 因此，细胞周期的持续时间定义如下：
[0065] · ccl = t2:第一个细胞周期
[0066] · cc2(也称为cc2a) = t3_t2:第二个细胞周期，作为2分裂球胚胎的持续时间 段。
[0067] · cc2b = t4_t2:两个分裂球的第二个细胞周期，作为2分裂球胚胎和3分裂球 胚胎的持续时间段。
[0068] · cc3 (也称为cc3a) = t5_t3:第三个细胞周期，作为3分裂球胚胎和4分裂球 胚胎的持续时间段。
[0069] · cc2_3 = t5_t2:第二个和第三个细胞周期，作为2分裂球胚胎、3分裂球胚胎和 4分裂球胚胎的持续时间段（即CC2+CC3)。
[0070] · cc4 = t9_t5:第四个细胞周期，作为5分裂球胚胎、6分裂球胚胎、7分裂球胚 胎和8分裂球胚胎的持续时间段。
[0071] 同步时间定义如下：
[0072] · s2 = t4_t3:从2分裂球胚胎至4分裂球胚胎的分裂同步化。
[0073] · s3 = t8_t5:从4分裂球胚胎至8分裂球胚胎的分裂同步化。
[0074] · s3a = t6_t5 ;s3b = t7_t6 ;s3c = t8_t7:从4分裂球胚胎至8分裂球胚胎的 发育中涉及的各细胞分裂的持续时间。
[0075] · cc3b, cc3c, cc3d = t6_t3 ;t7_t4 ;和t8_t4分别为：较慢分裂球的第三个细胞 周期，分别作为3分裂球胚胎、4分裂球胚胎、和5分裂球胚胎的持续时间段；作为4分裂球 胚胎、5分裂球胚胎和6分裂球胚胎的持续时间段，和作为4分裂球胚胎、5分裂球胚胎、6分 裂球胚胎和7分裂球胚胎的持续时间段。
[0076] 图1和2示意性示出了本文所用术语的某些方面，这些术语是关于一些胚胎发育 事件诸如上文所讨论的那些事件的发生时间和持续时间。图1显示了各个发育阶段的胚胎 的多个图像，并且指示与各个发育事件诸如t2、t3、t4、t5、ccl、cc2 (本文也可称为cc2a)、 cc3(本文也可称为cc3a)、s2和s3相关的各个发生时间。图2从左到右示意性示出了经 历了 1分裂球阶段、2分裂球阶段、3分裂球阶段、4分裂球阶段、5分裂球阶段、6分裂球阶 段、7分裂球阶段和8分裂球阶段的胚胎发育。沿着底轴示意性标出了时间t2至t8,在这 些时间点完成了相应的细胞分裂阶段。图2还示意性指示了细胞周期持续时间ccl、 cc2a、 cc2b、cc3a、cc3b、cc3c 和 cc3d 以及同步时间 S2 和 S3。
[0077] 卵裂时段被定义为从第一次观察到细胞膜凹进（表示细胞质分裂的开始）到细胞 质的细胞分裂完成从而分裂球被汇合的细胞膜完全分开的时间段。也称为胞质分裂持续时 间。
[0078] 受精和卵裂是胚胎的主要形态学事件，至少到8分裂球阶段。卵裂时间、细胞周 期、分裂同步化和卵裂时段是可以从这些主要形态学事件中定义的胚胎形态学参数的例 子，这些胚胎形态学参数中的每一个被定义为两个形态学事件之间的（例如以小时计）持 续时间段。
[0079] 归一化的胚胎形态学参数被定义为两个胚胎形态学参数的比率，例如cc2除以 cc3 (cc2/cc3)，或 cc2/cc2_3 或 cc3/t5 或 s2/cc2。
[0080] 可组合多个细胞周期的持续时间（例如CC1，CC2, CC3和CC4)以形成共同的归一 化参数：
[0081]
【权利要求】
1. 一种确定胚胎发育潜能的方法，该方法包括： 获得与观察期期间所述胚胎的发育相关的多个特征的值； 通过以预定的方式组合所获得的值与所述多个特征的相应参考值之间的差来确定连 续变量的值；以及 基于所确定的连续变量的值确定所述胚胎的发育潜能。
2. 权利要求1的方法，其中所述参考值是从所获得的至少一个具有已知发育潜能的参 考胚胎的多个特征的值确定的。
3. 权利要求1或2的方法，其中组合所获得的值与所述参考值之间的差的步骤考虑与 所述参考值中的每一个相关的加权值。
4. 权利要求3的方法，其中所述加权值是从所获得的多个具有已知发育潜能的参考胚 胎的多个特征的值统计确定的。
5. 权利要求4的方法，其中所述加权值是从所获得的多个参考胚胎的值的方差来确定 的。
6. 任一在前权利要求的方法，其中所述多个特征与胚胎的形态学发育相关。
7. 权利要求6的方法，其中所述连续变量代表胚胎的形态学发育中的规律性的量度。
8. 任一在前权利要求的方法，其中所述多个特征与胚胎的时间发育相关。
9. 权利要求8的方法，其中所述连续变量代表胚胎的时间发育中的规律性的量度。
10. 任一在前权利要求的方法，其中所述多个特征包括胚胎的多个细胞周期持续时间 cci 〇
11. 任一在前权利要求的方法，其中所述多个特征包括胚胎的后续细胞分裂之间的多 个时间差Atj。
12. 任一在前权利要求的方法，还包括： 获得与观察期期间所述胚胎的发育相关的另外的多个特征的值； 通过以另外预定的方式组合所获得的值与所述另外的多个特征的相应参考值之间的 差来确定另外的连续变量的值；以及 也基于所确定的另外的连续变量的值确定所述胚胎的发育潜能。
13. 任一在前权利要求的方法，其中通过缩时显微镜获得所述值。
14. 一种确定胚胎发育潜能的设备，该设备包括： 数据输入元件，所述数据输入元件被配置成获得与观察期期间胚胎的发育相关的多个 特征的值；以及 处理器元件，所述处理器元件用于通过以预定的方式组合所获得的值与所述多个特征 的相应参考值之间的差来确定连续变量的值，并基于所确定的连续变量的值确定胚胎的发 育潜能。
15. -种非暂时性计算机程序产品，其带有用于执行权利要求1-13中任一项所述的方 法的机器可读指令。
16. -种设备，其加载有用于执行权利要求1-13中任一项所述的方法的机器可读指 令，并且可操作以执行所述机器可读指令。
【文档编号】C12N5/02GK104411817SQ201380032956
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年6月25日 优先权日:2012年6月25日
【发明者】索伦·伯斯戈德, 梅特·莱格德斯曼德, 英吉·埃雷波·阿格霍姆 申请人:尤尼森斯繁殖技术公司