用于预测从巴雷特食管到高度发育异常食管腺癌的进展的方法

用于预测从巴雷特食管到高度发育异常食管腺癌的进展的方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于辅助预测受试者中从巴雷特食管至高度发育异常或食道腺癌的进展可能性的方法，此方法包括：(a)提供来自所述受试者的食管样品；(b)测定所述样品是否与米曲霉凝集素着色异常；(c)测定在所述样品中是否存在DNA含量异常；和(d)测定在所述样品中是否存在低度发育异常；其中，如果(b)是异常的且(c)是异常的，并且存在低度发育异常，则测定进展有增加的可能性。本发明还涉及一种装置以及某些材料的不同用途。
【专利说明】用于预测从巴雷特食管到高度发育异常食管腺癌的进展的 方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及预测从巴雷特食管（Barrett's Esophagus)到高度发育异常或食管腺 癌的进展。特别地，本发明涉及用于辅助预测此进展的可能性的方法。

【背景技术】
[0002] 胃食管反流可导致巴雷特食管（BE)，其中末端食道的鳞状上皮被替换成柱状上 皮。3%的反流症状的内窥镜检查患者中发现了 BE并且在所有接受内窥镜检查的患者中， 1 %的患者发现了 BE (1，2)。BE的重要性在于其通过化生-发育异常-腺癌的续发事件进展 至食管腺癌（EAC)的潜在可能性。EAC继续具有糟糕的预后，其五年整体存活率小于20%
[3] 〇
[0003] 基于最近的meta分析（4-6)和基于大量人群的研宄，从非发育异常BE (NDBE)进 展至EAC的速率在每年0. 2-0. 5%的区间内。这表明在一般人群中存在小但显著增长的相 对风险。辅导单个患者是困难的，这是因为大多数患有NDBE的患者不会进展至EAC，并且目 前，预测哪个患者具有风险的能力还十分有限（4)。这是本领域存在的问题。
[0004] 用以监测从NDBE进展至发育异常或EAC的内窥镜监测计划是非常昂贵的，并且需 要高度熟练的内窥镜医师。此外，其存在成本效益的问题，且其在降低癌症死亡率方面的价 值还未得到证明。
[0005] 越来越多的证据表明，大多数产生于BE的EAC的发生与染色体不稳定相关，其特 征在于染色体数目的广泛不平衡（非整倍体/四倍体）和杂合性缺失。这些核型异常通常 与在与癌症诱发和进展相关的特定肿瘤抑制基因和致癌基因中的突变的积累相关（7)。早 期检测研宄网络（EDRN)已确定一个通路，在将假定的生物标记物用于常规临床使用之前， 必须通过此通路来验证该假定的生物标记物（8)。已经在代表性的2期和3期研宄中鉴定 出几种具有临床用于BE的潜力的生物标记物。先前已证实细胞周期蛋白A(增殖的细胞的 比例的标志物）的表面表达与BE内的发育异常程度相关，并且可以使用组织化学进行评估 (9)。先前通过流式细胞仪测量的DNA含量异常（非整倍体/四倍体）（10、11)也可以使用 图像细胞计数DNA分析（DNA拷贝数）（可应用于石蜡切片）来进行精确的评估（12)。肿瘤 抑制基因 P53基因的失活已被鉴定为EAC进展中的关键事件，并且p53的双等位基因失活 与EAC的后续进展相关（13)。
[0006] 聚糖表达的协调变化已被证实发生于EAC的进展中。基因表达分析表明，大多数 在进展至EAC的过程中最有助于聚糖通路的富集的基因在Lewis抗原的合成中起作用，已 知Lewis抗原在其它癌症中改变了（16-18)。Lewis抗原的3期研宄（使用免疫组织化学） 确认了 sLea(也称为CA19-9)和Lex(⑶15)的表达与BE内的发育异常程度相关。也通过 凝集素组织化学证实了凝集素（特异性聚糖结合蛋白）小麦胚芽凝集素（WGA)和米曲霉 (Aspergillus oryzae)凝集素（AOL)在进展至EAC的过程中具有高度显著降低的结合力。
[0007] 在BE诊断中个体化进展风险的目标标记物将允许临床医生对具有尚风险的患者 进行靶向干预如内窥镜检查或微创治疗，而那些具有低风险的患者可以安心并避免了不必 要且昂贵的后续跟进。但是，目前没有这样的个体化的风险评估，并且并不知晓从BE到EAC 的进展中的可靠的分子预测物，这是本领域中的问题。
[0008] 本发明旨在克服与现有技术相关的问题。


【发明内容】

[0009] 从巴雷特食管（BE)进展至食管腺癌（EAC)的风险较低且难以预测。现有技术中 不存在精确的风险预测工具。
[0010] 本发明人考虑了通过WGA检测的包括sLea、Lex、唾液酸残基和通过AOL检测的 Fuc a l-6GlcNAc残基的宽范围的候选标记物，以预测BE中进展至EAC的进程。此外，早期 分子变化（其甚至早于发育异常的出现就被发现）被认为是进展至EAC的风险的可能的生 物标记物。但是本领域中没有教导，任何此类标记物具有任何作为进展至EAC的关键参数 的预测价值。通过设-H个研宄来评估候选生物标记物在预测BE中肿瘤（neoplastic)进 展过程中的性能以及创制生物标记物组（panel)作为风险分级工具，本发明人解决了这些 问题。
[0011] 本发明人公开了基于3期人群的研宄，其揭示了用于巴雷特食管的新的风险分 级生物标记物组。作为这项研宄的结果，本发明人已经能够获得生物标记物的小且集中 (focused)的组，其提供了对于进展至EAC而言具有稳健统计意义的预测工具。这种预测进 展至EAC的新的能力本身就是显著的进步。此外，使用这一工具能进一步利于如优化监测 和干预机制。
[0012] 本发明基于这些重要的发现。
[0013] 发明详述
[0014] 在一个方面中，本发明涉及一种辅助预测受试者中从巴雷特食管进展至高度发育 异常或食道腺癌的可能性的方法，此方法包括：
[0015] (a)提供来自所述受试者的食管（oesophagal)样品
[0016] (b)测定所述样品是否与米曲霉（Aspergillus oryzae)凝集素着色异常；
[0017] (c)测定所述样品中是否存在DNA含量异常；和
[0018] (d)测定所述样品中是否存在低度发育异常；
[0019] 其中，如果（b)是异常的且（C)是异常的，并且存在低度发育异常，则测定进展有 增加的可能性。
[0020] 适当地，米曲霉凝集素对应于EMBL登录号BAB88318的序列，如
[0021] MSTPGAQEVLFRTGIAAVNSTNHLRVYFQDSHGSIRESLYESGWANGTAKNVIAKAKLGTPLAATSK ELKNIRVYSLTEDNVLQEAAYDSGSGWYNGALAGAKFTVAPYSRIGSVFLAGTNALQLRIYAQKTDNTIQEYMWN ⑶GWKEGTNLGVALPGTGIGVTCWRYTDYDGPSIRVWFQTDNLKLVQRAYDPHTGWFKELTTIFDKAPPRCAIAA TNFNPGKSSIYMRIYFVNSDNTIffQVCffDHGQGYHDKRTITPVIQGSEIAIISffEGPELRLYFQNGTYVSAISEff SffARHGSQLGRRALPPAE
[0022] 进展增加的可能性意味着进展的可能性对于不显示特定异常标记物的等同受试 者而言，具有比标准或正常进展风险更高的风险。换言之，具有更高进展可能性的受试者具 有更大的机会进展至EAC。
[0023] 适当地，等同受试者尽可能多地匹配基本标准，如年龄、性别等。对照受试者的选 择在临床研宄中是公知的，并在下文和实施例部分进行了更详细的讨论。
[0024] 在另一个方面中，本发明涉及一种如上所述的方法，其进一步包括以下步骤：
[0025] (e)测定所述样品是否对CA19-9着色异常；
[0026] 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及，如果（e) 是异常的，则测定进展有进一步增加的可能性。
[0027] CA19-9也被称为Lewis抗原81^3并且其在本领域中是公知的；如果需要任何进一 步的指导，可参照CAS-No. 92448-22-1。
[0028] 在另一个方面中，本发明涉及一种如上所述的方法，其进一步包括以下步骤：
[0029] (f)测定所述样品是否对细胞周期蛋白A着色异常；
[0030] 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（f) 是异常的，则测定进展有进一步增加的可能性。
[0031] 适当地，细胞周期蛋白A是指NCBI登录号CAA02087。适当地，其具有序列：
[0032] I mlgnsapgpa trealgaasi aadgaprgpg eyqpgkgsar pttadpgala vlksgnprgl 61 aheqrpktrr vapIkdlpvn dehvtvppwk anskqpafti hvdeaekeaq kkpaesqkie 121 redalafnsa islpgprkpl vpldypradgs fesphtmdms ivledekpvs vnevpdyhed 181 ihtylremev kckpkvgymk kqpditnsmr ailvdwlvev geeykIqnet ihlavnyidr 241 flssmsvlrg klqlvgtaam llaskfeeiy ppevaefvyi tddtytkkqv Irmehlvlkv 301 Itfdlaaptv nqfItqyfIh qqpanckves lamflgelsl idadpylkyl psviagaafh 361 laiytvtgqs wpeslirktg ytleslkpcl mdlhqtylka pqhaqqsire kyknskyhgv 421 sllnppetln I
[0033] 在另一个方面中，本发明涉及一种如上所述的方法，其进一步包括以下步骤：
[0034] (g)测定所述样品是否对p53着色异常；
[0035] 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（g) 是异常的，则测定进展有进一步增加的可能性。
[0036] 适当地，p53是指NCBI登录号AAD28535。适当地，其具有序列：
[0037] I meepqsdpsv epplsqetfs dlwkllpenn vlsplpsqam ddlmlspddi eqwftedpgp
[0038] 61 deaprmpeaa prvapapaap tpaapapaps wplsssvpsq ktyqgsygfr lgflhsgtak
[0039] 121 svtctyspal nkmfcqlakt cpvqlwvdst pppgtrvram aiykqsqhmt evvrrcphhe
[0040] 181 rcsdsdglap pqhlirvegn lrveylddrn tfrhsvvvpy eppevgsdct tihynymcns
[0041] 241 scmggmnrrp iltiitleds sgnllgrnsf evrvcacpgr drrtekenlr kkgephhelp
[0042] 301 pgstkralpn ntssspqpkk kpldgeyftl qirgrerfem frelnealel kdaqagkepg
[0043] 361 gsrahsshlk skkgqstsrh kklmfktegp dsd
[0044] 在另一个方面中，本发明涉及一种如上所述的方法，其进一步包括以下步骤：
[0045] (h)测定所述样品是否对小麦胚芽凝集素 （Wheat Germ Agglutinin)凝集素着色 异常；
[0046] 其中，如果（b)是异常的且（C)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（h) 是异常的，则测定进展有进一步增加的可能性。
[0047] 适当地，小麦胚芽凝集素凝集素是指NCBI登录号AAA34257. 1或GI : 170668。适 当地，其具有序列：
[0048] I qrcgeqgsgm ecpnnlccsq ygycgmggdy cgkgcqngac wtskrcgsqa ggktcpnnhc
[0049] 61 csqyghcgfg aeycgagcqg gpcradikcg sqaggklcpn nlccsqwgyc glgsefcgeg
[0050] 121 cqngacstdk pcgkdaggrv ctnnyccskw gscgigpgyc gagcqsggcd gvfaeaiatn
[0051] 181 stllae
[0052] 在另一个方面中，本发明涉及一种如上所述的方法，其进一步包括以下步骤：
[0053] (f)测定所述样品是否对细胞周期蛋白A着色异常；
[0054] (g)测定所述样品是否对p53着色异常；
[0055] (h)测定所述样品是否对小麦胚芽凝集素凝集素着色异常；
[0056] 其中，如果（b)是异常的且（C)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（f) 是异常的且（g)是异常的且（h)是异常的，则测定进展有进一步增加的可能性。
[0057] 在另一个方面中，本发明涉及一种如上所述的方法，其进一步包括以下步骤：
[0058] (f)测定所述样品是否对细胞周期蛋白A着色异常；
[0059] (g)测定所述样品是否对p53着色异常；
[0060] (h)测定所述样品是否对小麦胚芽凝集素凝集素着色异常；
[0061] 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（e) 是异常的且（f)是异常的且（g)是异常的且（h)是异常的，则测定进展有进一步增加的可 能性。
[0062] 在另一个方面中，本发明涉及一种选择治疗方案的分析方法，所述分析方法包 括：
[0063] (a)提供来自所述受试者的食管（oesophagal)样品
[0064] (b)测定所述样品是否与米曲霉凝集素着色异常；
[0065] (c)测定在所述样品中是否存在DNA含量异常；和
[0066] (d)测定在所述样品中是否存在低度发育异常；
[0067] 其中，如果（b)是异常的且（C)是异常的，并且存在低度发育异常，则选择加强的 监测的治疗方案。
[0068] 加强的监测意味着将额外的监测技术应用于受试者，或者意味着将额外的监测事 件应用于受试者。适当地，加强的监测意味着将额外的监测事件应用于受试者。换言之，适 当地，加强的监测意味着，如果选择了加强的监测的治疗方案，则更频繁地（即更经常地） 监测受试者。"加强的"意味着受试者接受比在进行分析之前所受到的监测事件更高频率 (更频繁）的监测。换言之，适当地，加强的监测意味着减少受试者的监测事件之间的间隔。 清楚地，基于个体受试者的临床史，可以对个体受试者进行个体监测方案。因此，"加强的" 监测或减少监测事件之间的间隔必须依照逐个受试者来判断，而不是一个如对于监测间隔 而言的绝对值。这在实施例2中进行了更详细地解释。
[0069] 监测（surveillance)不被视为治疗人体或动物体的方法，而应视为具有监视 (monitoring)的天然含义。因此，适当地，如果所选择的方案仅涉及监测，则适当地，分析用 于选择监测方案且不涉及人体或动物体的治疗。
[0070] 在另一个方面中，本发明涉及一种装置或系统，其：
[0071] (a)被配置以分析来自受试者的食管样品，其中所述分析包括：
[0072] (b)测定所述样品是否与米曲霉凝集素着色异常；
[0073] (c)测定在所述样品中是否存在DNA含量异常；和
[0074] (d)测定在所述样品中是否存在低度发育异常；
[0075] 所述装置或系统包括一个输出模块，
[0076] 其中，如果（b)是异常的且（C)是异常的，并且存在低度发育异常，则所述输出模 块显示了所述受试者进展至EAC的增加的可能性。
[0077] 适当地，样品包括福尔马林固定的石蜡包埋的材料。
[0078] 米曲霍凝集素
[0079] 适当地，米曲霉凝集素着色可以通过本领域已知的任何合适的方法来测定。适当 地，其由适用于FFPE材料的方法来确定。
[0080] 更适当地，步骤（b)包括通过分级着色强度和在所述强度的着色区域的百分比来 并产生所述着色的H分数来测定所述样品中米曲霉凝集素的着色水平。
[0081] DNA含量异常
[0082] 适当地，测定是否存在DNA含量异常可以通过本领域中已知的任何合适方法来完 成。适当地，其由适用于FFPE材料的方法来测定。
[0083] 更适当地，步骤（c)包括利用图像细胞计数DNA分析来测定DNA含量，并从所述测 定推断所述DNA含量是否异常。使用这一检测技术具有克服了许多与本领域标准的流式细 胞仪检测相关的技术困难的优点。
[0084] 低度发育异常
[0085] 适当地，测定是否存在低度发育异常可以通过本领域中已知的任何合适的方法来 完成。适当地，其由适用于FFPE材料的方法来确定。
[0086] 更适当地，步骤（d)包括样品的组织学检查，并使用Vienna标准（scale)对低度 发育异常的存在或缺失进行评分。
[0087] Vi enna标准是为发育异常评分的一个公知的标准，其在本领域中详细描述 不于，例如 Schlemper RJ, Riddell RH, Kato Y 等人，The Vienna classification of gastrointestinal epithelial neoplasia. Gut. 2000August 1,2000 ;47 (2): 251-5,其特 意地通过引用并入本文，以用于根据Vienna标准对损伤进行评分的技术。
[0088] CA19-9 (Lewis 抗原 SLeii)
[0089] 适当地，测定是否存在对CA19-9的着色异常可以通过本领域中已知的任何合适 的方法来完成。适当地，其由适用于FFPE材料的方法来确定。
[0090] 更适当地，步骤（e)包括样品的CA19-9免疫组织化学着色、着色强度分级和在所 述强度的着色面积的百分比，并产生所述着色的H分数。
[0091] 细朐周期蛋白A
[0092] 适当地，测定是否存在对细胞周期蛋白A的着色异常可以通过本领域中已知的任 何合适的方法来完成。适当地，其由适用于FFI 3E材料的方法来确定。
[0093] 更适当地，步骤（f)包括样品的细胞周期蛋白A免疫组织化学着色、测定细胞周期 蛋白A的阳性上皮表面细胞相对于细胞周期蛋白A的阴性上皮表面细胞的百分比，其中1 % 或更多的细胞周期蛋白A阳性上皮表面细胞的百分比是着色异常。
[0094] p53
[0095] 适当地，测定是否存在对p53的着色异常可以通过本领域中已知的任何合适的方 法来完成。适当地，其由适用于FFPE材料的方法来确定。
[0096] 更适当地，步骤（g)包括样品的p53免疫组织化学着色，和对正常的或异常的着色 进行评分，其中相比于背景着色的强的、暗色的着色或相比于背景着色的着色缺失是异常 着色。
[0097] 小耒杯芽凝集素凝集素
[0098] 适当地，小麦胚芽凝集素凝集素着色可以通过本领域中已知的任何合适的方法来 完成。适当地，其由用于FFPE材料的方法来确定。
[0099] 更适当地，步骤（h)包括通过着色强度的分级和在所述强度的着色面积的百分比 来确定所述样品中小麦胚芽凝集素凝集素的着色水平，并产生所述着色的H分数。
[0100] 在另一个方面中，本发明涉及材料用于涉及高度发育异常或食管腺癌的预后或风 险预测应用的用途，此材料识别、结合选自P53、细胞周期蛋白A或CA19-9或其片段、其变体 或其突变体的多肽，或对此多肽具有亲和性。在另一个方面中，本发明涉及材料组合物的用 途，其各自分别识别、结合所述多肽或其片段、其变体或其突变体中的一种或多种，或者对 其具有亲和性。适当地，所述材料包括一种抗体或其片段，如其抗原结合片段。
[0101] 抗体可以是多克隆的或单克隆的，并且可以是多特异性的（包括双特异性的）、嵌 合的或人源化的抗体。根据本发明的抗体可以以多种方式进行修饰。实际上，术语"抗体" 应理解为包含具有所需特异性的结合域的任何结合物质。因此，本发明包含抗体片段、抗体 的衍生物、功能等效物和抗体类似物，包括合成的分子和形状模仿能结合抗原或表位的抗 体的形状的分子。
[0102] 能够结合抗原或其它结合配偶体的抗体片段的实例是由VL、VH、CL和CHl结构域 组成的Fab片段；由VH和CHl结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成 的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段；分离的CDR区域和F (ab'）2片段，包括在铰链区 通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段。还包括单链Fv片段。
[0103] 识别特定表位的抗体片段可通过已知技术来产生。例如，这样的片段包括但不 限于可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab'）2片段，和可通过还原F(ab'）2片 段的二硫桥产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库（Huse等人，1989, Science 246:1275-1281)以允许快速且容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。
[0104] 在另一个方面中，本发明涉及米曲霉凝集素或小麦胚芽凝集素凝集素用于涉及高 度发育异常或食管腺癌的预后或风险预测应用的用途。
[0105] 在另一个方面中，本发明涉及图像细胞计数DNA分析用于涉及高度发育异常或食 管腺癌的预后或风险预测应用的用途。
[0106] 在另一个方面中，本发明涉及一种包括材料的分析装置，所述材料结合多肽或对 其具有亲和性并进一步包括米曲霉凝集素和/或小麦胚芽凝集素凝集素，所述多肽选自 P53、细胞周期蛋白A或CA19-9。
[0107] 适当地，所述凝集素包括可检测的标签。
[0108] 在所有情况中，如果（b)是正常的和/或（C)是正常的和/或缺少低度发育异常， 则不能测定进展至EAC的增加的可能性。在这些实施方式中，将不表明加强的监测且不表 明微创治疗。
[0109] 在所有情况中，⑶15不具有预测价值。适当地，在本发明中不分析⑶15。包括涉 及CD15的数据是用于比较的目的，来证明本发明所提供的预测标记物的好处。
[0110] 本发明可以用于高度发育异常或食管腺癌。适当地，本发明与高度发育异常相关。 这具有允许早期干预的优点。更适当地，本发明与食管腺癌相关。这具有治疗更具威胁的 病症的优点。
[0111] 定义
[0112] 术语"包括"（包含、含有）应被理解为具有本领域中的常规含义，即包括规定的特 征或一组特征，但此术语不排除还存在任何其它的规定的特征或一组特征。
[0113] 异常与lH常
[0114] 可以相信，有技术的读者能够使用上面所给的指导来测定标记物是否是正常的或 异常的。然而，在进一步的解释是有帮助的情况下，这一分类可以按如下进行：
[0115] 每个生物标记物的分数被二等分成异常或正常。
[0116] 对于p53和细胞周期蛋白A的DNA拷贝数而言，这是基于先验的知识（例如，对于 DNA拷贝数，二倍体是正常的，四倍体或非整倍体是异常的）。
[0117] 对于CA19-9、WGA、AOL和⑶-15,将着色分数的每个组分（最适当地，如下所述的 四个组分的每一个）依据对照之中的最频繁的中值分布二等分为正常/异常，然后总结给 出各个生物标记物的0-4的整体异常分数。
[0118] 术语生物标记物如本发明的多肽生物标记物的"突变体"应当具有本领域通常的 含义。有时，突变体被称作"变体"或"等位基因"。关键是要检测在本发明中所列的生物标 记物。生物标记物可以在被研宄的个体之间具有突变或等位基因变体形式的个体差异。因 此，可以与本发明所提供的示例性SEQ ID NO具有一定程度的差异。本发明所提供的SEQ ID NO用于辅助有技术的读者来识别并使用本发明的多肽/生物标记物，并且不意图作为 被分析的单个多肽的限制的且死板的定义。因此，所提供的SEQ ID NO与被检测的多肽生 物标记物的实际序列之间的微小的序列差异将预期处于受试者的正常变异的界限之内。这 应当不影响本发明的工作。
[0119] 片段/肽
[0120] 本领域技术人员理解，本发明所讨论的生物标记物和特别为其展示的序列用于便 利化它们的检测。所收集的重要信息是在所研宄的样品中存在或不存在（或存在特定水平 的）生物标记物。对全长多肽进行评分没有特别的要求。因此，本发明包括多肽/凝集素 生物标记物的片段的检测。此外，本发明的试剂盒和肽可包含多肽的片段且不需要包括本 发明举例说明的全长序列。
[0121] 因此，适当地，片段是至少6个氨基酸的长度，适当地，是至少7个氨基酸的长度， 适当地，是至少8个氨基酸的长度，适当地，是至少9个氨基酸的长度，适当地，是至少10个 氨基酸的长度，适当地，是至少15个氨基酸，适当地，是至少25个氨基酸，适当地，是至少50 个氨基酸，适当地，是至少100个氨基酸，或适当地，是目标生物标记物多肽的大部分。
[0122] 样品
[0123] 样品可以来自受试者。适当地，受试者是哺乳动物，最适当地，是人类。
[0124] 适当地，方法不涉及样品的实际收集。适当地，样品是体外样品。
[0125] 适当地，本发明的方法在从被研宄的受试者中所分离的样品中进行。因此，适当 地，方法是可在实验室设置中进行而不需要存在受试者的方法。适当地，方法是在体外进行 的，即适当地，方法是体外方法。
[0126] 适当地，样品来自患有巴雷特食管的受试者。
[0127] 适当地，样品包括取自巴雷特食管的区域的材料。适当地，样品包括取自巴雷特食 管段自身的材料。
[0128] 适当地，样品是生检。
[0129] 适当地，样品包括福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE)材料。本发明的一个优点在 于，可以在FFPE材料上进行本方法。临床得到的样品通常被加工成FFPE材料。因此，可以 很广泛地实施本发明。
[0130] 适当地，每个本文所述的标志物可以在FFPE材料中进行检测。虽然存在一系列技 术用于分析所述标记物，最适当地，使用那些可以在FFPE材料上实施的技术。这就提供了 一个优点，即仅需要一个样本来评估如本文所述的多个标志物。
[0131] 参考标准
[0132] 通常，参考标准是指来自健康个体即没有患有EAC的个体的样品。参考标准可以 来自患有BE但不患有HGD/EAC的健康个体，最适当地，不患有EAC。
[0133] 而且，依据所考虑的标志物，可以更高精度地选择对照。例如，如果考虑AOL，则选 择患有BE而不患有发育异常或EAC的对照是有利的。例如，如果考虑倍数性，则选择任何 正常组织的对照（如正常的鳞状食管）是有利的。
[0134] 参考标准可以是平行分析的实际样品。或者，参考标准可以是先前来自比较样品 如来自健康受试者的样品的一个或多个值。在这样的实施方式中，可以通过比较所测定的 受试者的样品的值与之前所分析的参考样品的数值，来进行仅仅是数值的比较。这样做的 好处是，每次分析受试者的样品时，不必通过确定平行的个体参考样品的浓度而进行重复 分析。
[0135] 适当地，参考标准与被分析的受试者相匹配，如按性别，如按年龄，如按种族背景 或其它本领域公知的此类标准。参考标准可以是数字，如由一个或多个之前的研宄所制定 的绝对浓度。
[0136] 适当地，参考标准可与特定的患者亚组如老年受试者或那些之前患有相关病史如 反酸或BE的患者相匹配。
[0137] 适当地，参考标准与被分析的样品类型相匹配。例如，依据样品的类型或性质，所 分析的生物标记物多肽的浓度可能不同。对本领域技术人员而言显而易见的是，参考标准 的浓度值应是用于与本发明的方法中所测试的样品相同或可比较的样品。例如，如果所分 析的样品是来自巴雷特段，则参考标准值也应该是巴雷特段以确保有意义的交叉对比。适 当地，参考标准的样品类型和目标受试者的样品类型是相同的。
[0138] 其中测定用于样品着色的H分数，适当地，通过比较所测定的H分数与参考标准的 H分数（如来自对照受试者的样品之间的最频繁的中值分布）并从所述比较中推断是否所 述着色是异常的，来确定是否着色是正常的或异常的。
[0139] 风险评分
[0140] 依据在本发明的组中各种标记物的特定分数，可以量化个体受试者的风险。
[0141] 讲展的风险-单独的牛物标记物
[0142] 表2示出了每个单独的生物标记物从BE到HGD/癌症的进展风险。与由双盲胃肠 病理学专家评分的发育异常相比，BE患者中进展的（病例（cases))发育异常更频繁地在临 床上被诊断，虽然后者的分数具有优秀的特异性。发育异常、DNA拷贝数、CA19-9和AOL异常 情况所有均显著地与进展风险直接相关，而细胞周期蛋白A、p53和WGA异常情况对进展的 增加的风险显示出非显著的倾向。在这一患者组中，⑶-15异常情况与进展风险无关。然而， 应当注意的是，如以真和假预测率（TPR和FPR)所反映的，单独的生物标记物的灵敏度和特 异性是低的。仅限于癌症结果的分析获得与HGD和EAC的组合分析很相似的结果，例外是 P53,其变得与从BE到癌症的进展的增加的风险显著相关（OR 1. 95 ;95% Cl :1. 04-3. 67)。
[0143] 7个牛物标记物组樽塑的组合
[0144] 表3示出了将所有7个生物标记物（以及通过研宄设计调整的发育异常和BE的 年数、年龄和性别）组合到风险评分后逻辑回归模型所得的效果估计值，并示出了这一风 险评分的表现的估计值。7个生物标记物模型获得的c统计数值是相对高的（c统计数 值=0.78)并在使用自举采样技术进行内部验证之后保持不变（乐观校正的（optimism corrected) c 统计数值=0· 71)。
[0145] 重要的是请注意，与基本临床模型相比（仅包含发育异常、年龄、性别和BE的年 数），此7个生物标记物模型能够更好地区别病例和对照，反映为0. 15的c统计数值的提 高（图1)。表3还阐明了包含7个生物标记物的模型（0. 22)和基本模型（0. 07)在区别斜 率（discrimination slopes)上的相似提高（即来自病例和对照模型的成为病例的平均预 测可能性的差异）。在限于非发育异常的BE个体的相似分析（76%的病例和74%的对照） 中，7个生物标记物模型的c统计数值比所有BE患者中所观察到的低（乐观校正的c统计 数值=0. 63)，但仍比基本模型有一定的提高（乐观校正的c统计数值=0. 43)。同样，0. 13 的IDI表明，与基本模型相比，7个生物标记物模型提高了区别能力。
[0146] 简化的牛物标记物组樽塑
[0147] 应注意，在全模型中的一些生物标记物并不显著有助于整个模型。此外，生物标记 物组越小就越容易将其应用至常规临床实践中。因此，发明人通过应用向后选择过程来构 建一个简化的模型。表4示出了此简化模型（A0L和DNA拷贝数）与基本模型（年龄、性别 和BE的年数）和7个生物标记物模型（图1)相比的性能。可以看出，此模型在区别病例 和对照中与7个生物标记物模型等效。然而，应注意，考虑到小的患者数，此分析存在大的 置信区间。
[0148] 然后，为一个、两个或所有这些标志物存在异常的个体创建风险评分，如表5所 示。对每一个标志物，风险评分每增加1点，发育异常的BE患者几乎存在四倍的进展至EAC 的增加的风险（0R 3. 75 ;95% Cl :2. 42-5. 79)，而NDBE患者有三倍的增加的进展风险（0R 2. 99 ；95% Cl ：1, 72-5. 20) 〇
[0149] 因此，在一些实施方式中，本发明涉及一种如本文所述的方法，其进一步包括确定 受试者的风险评分的步骤。适当地，风险评分确定自如本文所解释的单独的标记物/组结 果。
[0150] 适当地，方法可以进一步包括归因于进展至发展EAC的风险。适当地，使用测得自 如上的单独的标志物/组结果的风险评分获得这种风险。
[0151] 其它实施方式
[0152] 在另一个方面中，本发明涉及一种选择治疗方案的方法，所述方法包括：
[0153] (a)提供来自所述受试者的食管样品
[0154] (b)测定所述样品是否与米曲霉凝集素着色异常；
[0155] (c)测定在所述样品中是否存在DNA含量异常；和
[0156] (d)测定在所述样品中是否存在低度发育异常；
[0157] 其中，如果（b)是异常的且（C)是异常的，并且存在低度发育异常，则选择加强的 监测的治疗方案。
[0158] 适当地，所述方法进一步包括以下步骤：
[0159] (e)测定所述样品是否对CA19-9着色异常；
[0160] 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（e) 是异常的，则选择强化的监测的治疗方案。更适当地，推荐微创治疗的治疗方案。
[0161] 适当地，所述方法进一步包括以下步骤：
[0162] (f)测定所述样品是否对细胞周期蛋白A着色异常；
[0163] 其中，如果（b)是异常的且（C)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（e) 是异常的，则选择强化的监测的治疗方案。更适当地，推荐微创治疗的治疗方案。
[0164] 适当地，所述方法进一步包括以下步骤：
[0165] (g)测定所述样品是否对p53着色异常；
[0166] 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（e) 是异常的，则选择强化的监测的治疗方案。更适当地，推荐微创治疗的治疗方案。
[0167] 适当地，所述方法进一步包括以下步骤：
[0168] (h)测定所述样品是否与小麦胚芽凝集素凝集素着色异常；
[0169] 其中，如果（b)是异常的且（C)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（e) 是异常的，则选择强化的监测的治疗方案。更适当地，推荐微创治疗的治疗方案。
[0170] 在所有情况中，如果（b)是正常的和/或（C)是正常的和/或不存在低度发育异 常，则选择正常的监测的治疗方案。正常监测可依据受试者而不同；适当地，正常监测指已 归因于所述受试者的监测和间隔。
[0171] 在另一个方面中，本发明涉及一种收集在测定发展EAC的预后中有用的信息的方 法，方法包括：
[0172] (a)提供来自所述受试者的食管样品
[0173] (b)测定所述样品是否与米曲霉凝集素着色异常；
[0174] (c)测定在所述样品中是否存在DNA含量异常；和
[0175] (d)测定在所述样品中是否存在低度发育异常。
[0176] 在另一个方面中，本发明涉及一种装置或系统，其：
[0177] (a)被配置以分析来自受试者的样品，其中所述分析包括：
[0178] (b)测定所述样品是否与米曲霉凝集素着色异常；
[0179] (c)测定在所述样品中是否存在DNA含量异常；和
[0180] (d)测定在所述样品中是否存在低度发育异常；
[0181] 所述装置或系统包括一个输出模块，
[0182] 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，则所述输出模 块指示所述受试者进展至EAC的增加的可能性。
[0183] 所述装置或系统可以进一步被配置，使得分析进一步包括：
[0184] (e)测定所述样品是否对CA19-9着色异常；
[0185] 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（e) 是异常的，则所述输出模块指示测定了进展的进一步增加的可能性。
[0186] 所述装置或系统可以进一步被配置，使得分析进一步包括：
[0187] (f)测定所述样品是否对细胞周期蛋白A着色异常；
[0188] 其中，如果（b)是异常的且（C)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（f) 是异常的，则所述输出模块指示测定了进展的进一步增加的可能性。
[0189] 所述装置或系统可以进一步被配置，使得分析进一步包括：
[0190] (g)测定所述样品是否对p53着色异常；
[0191] 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（g) 是异常的，则所述输出模块指示测定了进展的进一步增加的可能性。
[0192] 所述装置或系统可以进一步被配置，使得分析进一步包括：
[0193] (h)测定所述样品是否与小麦胚芽凝集素凝集素着色异常；
[0194] 其中，如果（b)是异常的且（C)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（h) 是异常的，则所述输出模块指示测定了进展的进一步增加的可能性。
[0195] 本发明还涉及包括AOL和/或WGA以及用于ICM DNA检测的试剂的试剂盒。本发 明还涉及进一步包括能够与细胞周期蛋白A、p53和CA19-9中的一种或多种结合的材料的 所述试剂盒。

【专利附图】

【附图说明】
[0196] 图1示出了将7个生物标记物模型（画面A)和3个生物标记物模型（画面B)与 基本临床模型（年龄、性别、发育异常的存在、BE诊断的年数）比较的ROC曲线。
[0197] 图2示出了用于将本发明的生物标记物组应用到临床实践中的临床算法。LGD = 低度发育异常；HGD =高度发育异常;AOL =米曲霉凝集素。

【具体实施方式】
[0198] 本发明现通过举例的方式进行说明。这些实施例旨在是说明性的，并不旨在限制 所附的权利要求。
[0199] 实施例
[0200] 实施例概述：
[0201] 方法：基于人群的北爱尔兰BE登记内的巢式病例对照研宄，（1993-2005)。将在BE 诊断后多6个月进展至EAC或H⑶的病例（η = 89)与年龄/性别和BE诊断的年数的非进 展者对照（η = 291)进行匹配。在来自第一 BE诊断的石蜡包埋组织中评估已建立的（DNA 含量异常、P53和细胞周期蛋白A表达）和新的生物标记物（唾液酸化Lewis A和⑶-15表 达、米曲霉凝集素（AOL)结合和小麦胚芽凝集素（WGA)凝集素结合）。将条件的逻辑回归分 析应用于进展风险的研宄。
[0202] 结果：在平均6. 7 (±3. 2)年的随访之后，发育异常和7个生物标记物在多变量分 析中有助于EAC/HGD的风险。通过使用向后选择技术，包括低度发育异常和2个生物标记 物（异常的DNA倍体和AOL)的组能最佳地区分进展者和非进展者。当组合进发育异常的 (0-3)或非发育异常的BE(0-2)的风险分数时，进展的校正的OR对于每个点增加分别是 3. 74(95% CI2. 43-5. 79)和 2. 99(95% Cl 1. 72-5. 20)。
[0203] 结论：3个生物标记物的组（有时，讨论为2个分子标记物（DNA/A0L)加上发育异 常）可以区分处于更高的进一步发展EAC和HGD的风险的发育异常和非发育异常BE患者。
[0204] 实施例1 :生物标记物组的鉴定
[0205] 通过使用基于人群的北爱尔兰巴雷特食管登记（NIBR)，发明人构建了巢式病例对 照研宄以在常规收集的石蜡包埋样品中研宄已建立的和新的生物标记物的组。这一研宄 的目的之一是测定发育异常、DNA拷贝数、p53、细胞周期蛋白A和最近期所描述的聚糖靶 (CA19-9、⑶-15、WGA、A0L)能否预测从BE至EAC的未来进展。另一个目的是创制一个生物 标记物组，其可以用作定量风险分级工具。
[0206] 这项研宄中所产生的方法将用于以后的阶段4的研宄中。
[0207] 研宄设计
[0208] 用北爱尔兰巴雷特食管登记（NIBR)构建巢式病例对照研宄，（20-22)。NIBR 是在1993年至2005年之间，整个北爱尔兰确诊为柱状上皮化食管（columnar-lined oesophagus)的所有9, 329个成人的基于人群的登记。在NIBR中，在生检中4, 306例患者 具有专业的肠上皮化生（SIM)所显示的可见的柱状上皮化段（columnar lined segment)， 为了此研宄目的，将此定义用于BE的诊断。病例是在首次BE诊断之后至少6个月进展至 EAC、胃贲门恶性肿瘤或H⑶的NIBR的BE患者。癌症结果通过将NIBR匹配到食管和胃部恶 性肿瘤的北爱尔兰癌症登记数据库（诊断至2005年12月31日）来鉴定。认为在BE患者 中所产生的胃贲门癌症是病例，因为根据πΜ7,这些患者可能被归类为EAC病例。HGD结果 被鉴定为12个月内2个独立的临床诊断或不限时段的3个独立的H⑶诊断。将每个病例 匹配达5个对照，所述对照是截至2005年12月31日的研宄审查日期，基于年龄（±5年）、 性别和BE诊断的年数没有进展至EAC或H⑶的BE患者。经北爱尔兰的地区伦理委员会授 予伦理许可（REC No 07/NIR02/109)。
[0209] 组织病理学检查
[0210] 所有指数和结果生检均由两个独立的胃肠病理学专家（MN&DM)进行盲审，并用 Vienna标准进行评分（23)。在84%的所评分的样品中获得了完全的一致，差异通过讨论解 决（必要时将切片进行重新评估）。如果病例和对照在H⑶或癌症诊断之前多6个月没有 可用于检查的指数BE生检时，将病例和对照排除在外。在研宄初始，任何由病理学家评分 为没有SM的证据或H⑶和EAC的证据（4-5的Vienna评分）的指数BE样品被排除在研 宄之外。结果生检的组织学诊断在88 %的EAC、100 %的胃贲门和83 %的HO)结果生检中均 由两位病理学家予以确定。结果生检不被组织学所证实的原因包括没有生检可用或在结果 生检中切下的组织片段中不存在HGD或EAC。
[0211] 图像细胞计数DNA分析
[0212] 如之前所述，自FFPE组织切下一片40 μπι的组织切片（section)且制备核单 层（24)。然后将单层酸水解化并用标准化方法用Feulgen-Schiff试剂进行着色（13)。 将所有切片（slide)赋予唯一编码标识符并用自动图像细胞计数分析仪（Room 4, East Sussex, UK)进行研宄，该分析仪由显微镜（Axioplan 2, Zeiss, Jena,德国）、546_nm绿色滤 镜和黑白高分辨率数码相机（AxioCam MRm，Zeiss，Jena，德国）组成。如前所述，测量光密 度和核面积并计算每个核的积分光密度（25)。生成代表DNA含量的直方图并根据欧洲分析 细胞病理学学会（ESACP)指南进行分析（26)。也标注DNA倍体相关参数如DNA指数（DI) 和超过5c (5c ER)和9c (9c ER)的细胞的百分比。所有的直方图由三个独立的观察员（JD、 DO和MN)中的两个进行盲审。在所有病例中达成共识。
[0213] 免疫组织化学
[0214] 按制造商说明，使用BOND自动着色仪（Leica, Milton Keynes, UK)在4 μm组 织切片上对p53 (1/50稀释，恢复H130min，D07, Leica, Milton Keynes)、细胞周期蛋白 A(l/50 稀释，恢复 H110min，Leica)、唾液酸化 Lewis a (BOND 现成的，恢复 H120min, Leica) 和⑶15 (BOND现成的，恢复H220min，Leica)进行免疫组织化学。然后用光苏木精着色剂 (light haematoxylin stain)复染所着色的组织切片。
[0215] 组织化学
[0216] 根据标准方法将切片（slide)脱石蜡，置于湿润的孵育室并应用5 μ g/mL的凝集 素（WGA或A0L)，随后于37°C温育15分钟。WGA获得自来自Vector labs Catalog号V0428 的生物素化小麦胚芽。使用购自Tokyo Chemical Industry UK Ltd L0169的AOL制备A0L， 将其用ProtOn标记试剂盒PLK-1202用生物素进行标记。通过浸没于流动的水中洗掉未结 合的凝集素（2X 30min)，并用含DAPI 的Prolong Gold抗衰试剂（Invitrogen, Paisley, UK) 包埋。使用 Applied Imaging Ariol? (Genetex Ltd, Hampshire, UK)扫描凝集素着色的 切片。
[0217] 用 Leica Novocastra 抗体克隆 D07 着色 p53〇
[0218] 用 Leica Novocastra 抗体 Carb_lPA0039 着色 CD15〇
[0219] 用 Leica Novocastra 抗体 241:5:1:4PA0424 着色?△19-9 61/或 sLea) 〇
[0220] 用Leica Novocastra抗体克隆6E6着色细胞周期蛋白A。
[0221] 组织化学和免疫组织化学的评分
[0222] p53被评分为显著或非显著的。邻近正常背景着色的强、暗色着色或着色完全缺失 是显著的。计算细胞周期蛋白A阳性与阴性上皮表面细胞的百分比。显著性使用1%的取 舍点（cut off)。
[0223] ⑶15、Sla、A0L和WGA着色的切片按强度（0-3)进行分级并在此强度（0-4)按着色 面积的百分比进行分级。计算通过强度乘以面积分数获得的H分数（0-12) (0-12) (27)并提 供与单独的强度或面积分数相比更准确的分数。将四个上皮间隔进行评估：顶点（apical) 上皮膜（暴露于食道管腔的上皮细胞膜的顶点部分）、泛膜（pan membranous)、上皮粘膜球 (细胞质内着色的球状集合）和上皮细胞质。
[0224] 统计分析
[0225] 使用用于连续变量的独立t检验和用于分类变量的卡方检验比较病例和对照之 间的基线特征。进行条件的逻辑回归以评估肿瘤进展的比值比和所研宄的每个生物标记物 的相应的95%置信区间。在分析中，当病例未能被指定生物标记物分数时，病例和其相应的 对照被排除在该分析之外。多变量分析按年龄、性别、BE诊断的年数和发育异常的存在进 行校正（如由两个病理学专家所评分的）。
[0226] 通过用评分为异常的病例和对照的数量除以此生物标记物评分的病例和对照的 总数计算真阳性率（TPR)或灵敏度和假阳性率（FPR)或生物标记物的1-特异性。根据巢 式病例对照设计评估患有BE的个体的整个队列的阳性预测值（PPV)和阴性预测值（NPV)， 其是根据来自基于1993-2005年的整个人群的NIBR队列的由指数巴雷特食管诊断的SM 阳性患者中癌症的患病率（prevalence)和HGD结果（28)。
[0227] 用逻辑回归将七个生物标记物与发育异常、BE的年数、年龄和性别组合成风险评 分。将每个生物标记物评分二分成异常或正常。对于P53和细胞周期蛋白A的DNA拷贝 数，这是在先验知识的基础上（例如对于DNA拷贝数而言，二倍体正常，四倍体或非整倍体 异常）。对于CA19-9、WGA、AOL和⑶-15而言，基于对照之中最频繁的中间值分布，将着色 分数的四个组分中的每一个都二分成正常/异常，然后相加以得到每个生物标记物的总异 常分数。
[0228] 为了评估模型的性能，预测的概率用于计算在受者作用特征（ROC)曲线（c统计） 下的面积并计算区别斜率（与对照相比，病例中的平均的预测的概率的差异）（29)。使用c 统计和集成歧视改善（integrated discrimination improvement, IDI)将临床模型（仅包 含发育异常、BE的年数、年龄和性别）的性能与包含所有七个生物标记物（以及发育异常、 BE的年份、年龄和性别）的生物标记物模型的性能相比较（30)。与没有生物标记物的临床 模型相比较，IDI测量了对于病例，生物标记物模型以多少程度导致癌症（或HGD)增加的 评估的风险，以及对于对照，降低的评估的风险。使用自举法在c统计上进行内部验证。具 体地，在自举样品中评估模型并在自举样品和原始样品中计算c统计。将这一过程重复200 次，并计算自举样品和原始样品中性能的平均差异（乐观）并从表观性能中减去以评估内 部验证的性能（31)。
[0229] 使用逐步向后选择程序（stepwise backward selection procedure)(使用 0· 5 的取舍点）选择简化模型，在模型中保留年龄、BE的年数和性别。如前所述但在对每个自 举样品应用了逐步选择过程之后计算此模型的内部验证的c统计。简明起见，使用逻辑回 归而不是条件的逻辑回归进行模型的验证，但逻辑和条件的逻辑模型的评估是相似的（结 果未显示）。另外的分层分析重复地去除了在指数生检中没有发育异常的个体。
[0230] 患者的人口统计资料
[0231] 在6. 7(3. 3)年的平均（SD)随访期间之后，在研宄队列中诊断了 56例EAC、13例胃 贲门癌和25例HGD病例。在由两个病理学专家评审之后，发现了 5个病例（2例EACU例 胃贲门癌和2例H⑶病例）在其初始BE诊断具有HGD或EAC的证据，因此被排除在分析之 夕卜，剩余89例病例。表1示出了这89例病例和其291个匹配的对照的特征。病例和对照 在匹配标准（年龄、性别和BE诊断的年数）上没有差异，也在BE段的起源或长度的实验室 上没有差异，虽然对于大约一半的参与者而言，后者是未知的。与对照相比，显著更多的病 例在其第一次BE诊断时被诊断为具有不确定或低度发育异常，（分别是20. 2%比2. 4% )， (P<0. 001) 〇
[0232] 结论
[0233] 此基于人群的3期生物标记物研宄揭示了一个新的用于评估从发育异常和非发 育异常BE进展到EAC的风险的组合组（combination panel)。7个生物标记物的组合组代 表了个体化患者风险的显著进步并且由于使用了可以在福尔马林固定的组织中进行的相 对简单的技术而是有利的。此外，简化的3个生物标记物组的模型的分析显示了 AOUDNA 含量异常和LGD存在的显著的逐步增加的进展风险。
[0234] 通过研宄设计并采用良好描述的长期随访的队列，其中全部生物标记物分析采用 盲测结果而进行，加强了这一工作。NIBR是宝贵的基于人群的资源，在北爱尔兰（人口 180 万），有超过4000名成人被确诊为可见的柱状上皮化食管和SM。89例从BE进展至HGD/EAC 代表了比先前的来自其它中心的BE中生物标记物的纵向研宄实质上更大量的端点（32、 33)。这些患者中的大多数是高加索中年男性，这与之前的BE的流行病学研宄一致。重要 的是，样品被收集作为常规临床护理的一部分，因此适用于日常实践。此研宄的一个弱点为 仅有有限的生检可用于分析，因而不可能在每个患者中都获得所有生物标记物的数据。
[0235] 在经验证的生物标记物中，通过图像细胞计数所测量的DNA含量异常最能预测 HGD/癌进展（0R = 3. 22 ;95% Cl 1. 73-6. 00 ;P〈0. 001)。在BE患者的前瞻性试验中已评 估了 DNA倍体异常，代表4期生物标记物进展（10、11、34)。Reid小组的具有里程碑意义 的研宄证明，患有H⑶且具有非整倍体或四倍体的患者具有66%的5年癌症风险，相比之 下，仅患有HGD具有42 %的5年癌症风险，仅患有DNA倍体异常具有28 %的5年癌症风险。 没有细胞计数异常（DNA二倍体）且没有H⑶的患者具有0的5年癌症风险[Reid等人， 2000b]。该小组继续评估与9pL0H、17pL0H和DNA倍体异常组合的染色体不稳定组的作用
[30]。所有三种的组合与单独的任何一个生物标记物相比，是更好的进展到EAC的预测物 (RR = 38. 7 ;95% Cl = 10. 8-138. 5 ;P〈0. 001)。然而，这些标记没有用于大多数的中心，这 是因为其需要平台的组合，而这将很难在专业研宄中心之外进行。特别地，DNA含量流式细 胞术与实验室间的差异、质量控制问题和有效设置和运行成本相关（35)。因此，在本研宄中 使用图像细胞计数而不是流式细胞术代表了一种进步，因为图像细胞计数更便宜、更易于 设置并具有自动化的潜力。虽然正在开发新的测量染色体不稳定的单一平台技术，如SNP 和基因芯片阵列（36)，其可提供FFPE材料的快速通量，但监视计划的准确性和成本影响尚 不清楚。
[0236] 在聚糖表达中涉及的新的生物标记物中，CA19-9和凝集素 AOL是癌症发展的显 著预测物，尽管仅有AOL作为显著独立的肿瘤进展的生物标记物被包含于最终的简化模型 中。先前已经显示，在2期研宄中，CA19-9和AOL都在从化生通过发育异常至癌症的进展 中被上调（19、37)。AOL可以很容易地通过凝集素组织化学来评估，其比免疫组织化学和倍 性技术更便宜且更易于操作。然而，在几乎四分之一的没有进展的BE对照中，AOL也过度 表达，从而限制了其特异性。然而，也存在有趣的可能性，其可通过内窥镜评估AOL阳性区 域，如之前WGA凝集素所证实的（19)。
[0237] 癌症进展的最强预测物是由2个专业的GI病理学专家确定的L⑶的存在（0R = 11. 33 ;95% Cl 3. 97-32. 36 ;P〈0. 01)，尽管在进展之前> 5年评估时其在队列中整体存在 很小（2.8%)。以病理学家之间的一致程度的方式，在第一评审中，由两个GI病理学专家 对84% (21/25例）的LGD进行评分，通过讨论/重审，对所有25个样品达成一致。这与 荷兰一致性研宄（Dutch consensus study) (38)具有可比性，且比Wani等人的研宄更有利 (39) 〇
[0238] 这些患者中在分级LGD上的困难和癌症风险的不确定性（38、39)导致了关于治疗 LGD的优点和缺点的大讨论，特别是随着内窥镜微创治疗的出现（40、41)。此问题的复杂性 得到了最近的两项研宄的有差异的结论的证明。在一项荷兰的研宄中，147例地方医院病理 学家确诊患有L⑶的患者的生检由两位GI病理学专家进行审查。仅15%的由社区病理学 家初次诊断为L⑶的患者被GI病理学专家之一证实（22/147)，在此一致性组中HGD或EAC 的发病率高为每年13. 4% (95% CI 3. 5-23. 2)。相比之下，美国进行的一项研宄得出的结 论是，进展至HGD和EAC的风险与非发育异常BE无差异，即使达成一致时。有可能存在方 法学上的差异，其影响了这些数据，但总体而言，其突出了 LGD诊断的临床挑战。因此，利用 DNA倍体和AOL分析以更客观地测定处于进展最高风险需要加强监测或干预的LGD患者是 有吸引力的。
[0239] 通过IHC所测量的异常的细胞周期蛋白A和p53表达在多因分析中并没有给出显 著增加的HGD/EAC进展风险。但在单独EAC中，TP53的存在显示了显著的风险（OR = 1. 95 ; 95% Cl 1. 04-3. 67)。先前的NIBR的进展至EAC的29例患者和进展至H⑶的6例患者的 较小病例对照研宄表明了 TP53表达与更高的加强的进展风险相关（0R = 11. 7,95% CI， 1. 93-71. 4) [41]。在最近的54例BE患者的病例对照研宄中，其中27例进展至HGD/EAC， 27例是非进展者，中等的P53过表达也与具有6. 5HR的显著加强的进展风险相关（95% CI， 2. 5-17. 1) (42)。这些结果的解释受TP53IHC的实验室之间的差异性所限制（43)。测量p53 突变的黄金标准是基因测序，其比TP53IHC更特异，虽然这不是常规可用的，且如果存在内 窥镜生检固有的小尺寸和异质性则存在技术困难。通过IHC测量p53表达是相对简单的技 术，其广泛应用于病理学实验室中，并且在本发明人的3期研宄中，发明人能够证明存在一 个小却显著的到癌症的进展风险，但与HGD组合时，其丢失。因此，当与本发明的组中的其 它生物标记物相比时，P53的效用可能受限。先前已被假定为进展低风险的标记物的细胞周 期蛋白A阴性具有临界显著性，其退出多因分析。然而有趣的是，与细胞周期蛋白A的相关 在"仅EAC"结果中更强，这表明其在鉴定从HGD进展到癌症的后期阶段的患者中更有用。
[0240] 发明人已证明，多种生物标记物的组合比任何一个单独的生物标记物赋予更高的 进展风险。通过使用组合组，67%的病例在指数生检中具有2-4个异常标记物。换言之，在 本研宄中，虽然阳性生物标记物组的存在赋予了进展至HGD/EAC的更大风险，三分之一的 没有这些异常的患者仍可能有进展。这可以由抽样误差来解释，无论是从内窥镜的生检还 是从归档的FFPE组织块上切下额外的组织切片时。如果基线的生检在癌症发病前过早被 取出，也可能存在时间效应（temporal effect)。当发明人评估在3. 6年的进展的中间时间 内或后确诊的HGD/EAC的进展风险时，趋势是AOL相比于DNA拷贝数或LGD，是一个更好的 后期进展的标记物。重要的是，在校正后的分析中，标记物和随访时间之间的相互作用的测 试不显著，这是因为所涉及的数对于有意义的分析而言太小。因此必须谨慎地进行阴性生 物标记物组的解释，且不推荐在本发明的组的基础上降低内窥镜监测的频率，直至在未来 的4/5期研宄中研宄这些标记物。
[0241] 随着引入内窥镜微创治疗用于消融BE，更需要精确地对患者进行风险分级，因为 可能在早期阶段提供治疗。因此，本发明所描述的生物标记物组具有实际临床应用意义，并 进一步提供了一个有用的风险分级算法-
[0242] i.无发育异常和阴性组
[0243] 风险未知。继续当前的监测间隔。
[0244] ii.无发育异常和阳性组
[0245] 根据组，中-高度风险。加大监测，如果大于2个阳性，考虑微创治疗。
[0246] iii. LGD/IND -致+任何一种生物标记物是阳性的
[0247] 高度风险。考虑微创治疗。
[0248] 发育异常评分、DNA倍体状态和AOL的组合可以提供显著地经济上的节约，因为 LGD组（其目前等同于根据AGA准则的每年的监测间隔）可以更准确地通过生物标记物分 级成标准监测的中度风险组和用于去除的更高风险组。在进入常规临床实践之前，在V期 生物标记物研宄中评估这一策略是有益的。
[0249] 总之，这项研宄已证明，7个生物标记物组是用于BE风险分级的临床上适用的且 有用的工具。本发明的结果进一步证明，3个生物标记物的简化组优于仅使用病理学发育异 常诊断、年龄和性别来鉴定BE患者进展至HGD/EAC的风险的临床模型。本发明的结果与先 前的单生物标记物的纵向研宄一致，其包括TP53异常和DNA含量异常。本发明的组可用于 石蜡包埋组织并用于临床而不是研宄样品，这使其应用更广。这一组可以应用于诊断时BE 的生检，具有指导出于预期的公共健康和经济利益的监测和治疗干预的潜能。
[0250] 实施例2
[0251] 图2示出了本发明的方法（算法）。
[0252] 在一个实施方式中，（无发育异常，但AOL OR非整倍体阳性）的发现可能导致推 荐稍微更加频繁的监测，如每年而不是每2-3年。然而，必须注意的是，通常在大多数现存 指南中，对于低风险而言，监测间隔被延长至3-5年。
[0253] 表1.病例和匹配的对照的特征
[0254]
[0255]

【权利要求】
1. 一种辅助预测受试者中从巴雷特食管进展至高度发育异常或食道腺癌的可能性的 方法，此方法包括： (a) 提供来自所述受试者的食管样品 (b) 测定所述样品是否与米曲霉凝集素着色异常； (c) 测定在所述样品中是否存在DNA含量异常；和 (d) 测定在所述样品中是否存在低度发育异常； 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，则测定进展有增加 的可能性。
2. 如权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤： (e) 测定所述样品是否对CA19-9着色异常； 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（e)是异 常的，则测定进展有进一步增加的可能性。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括以下步骤： (f) 测定所述样品是否对细胞周期蛋白A着色异常； 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（f)是异 常的，则测定进展有进一步增加的可能性。
4. 如权利要求1至3任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤： (g) 测定所述样品是否对P53着色异常； 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（g)是异 常的，则测定进展有进一步增加的可能性。
5. 如权利要求1至4任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤： (h) 测定所述样品是否对小麦胚芽凝集素凝集素着色异常； 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（h)是异 常的，则测定进展有进一步增加的可能性。
6. 如权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤： (f) 测定所述样品是否对细胞周期蛋白A着色异常； (g) 测定所述样品是否对P53着色异常； (h) 测定所述样品是否对小麦胚芽凝集素凝集素着色异常； 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（f)是异 常的且（g)是异常的且（h)是异常的，则测定进展有进一步增加的可能性。
7. 如权利要求2所述的方法，其进一步包括以下步骤： (f) 测定所述样品是否对细胞周期蛋白A着色异常； (g) 测定所述样品是否对P53着色异常； (h) 测定所述样品是否对小麦胚芽凝集素凝集素着色异常； 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，以及如果（e)是异 常的且（f)是异常的且（g)是异常的且（h)是异常的，则测定进展有进一步增加的可能性。
8. -种选择治疗方案的分析方法，所述分析方法包括： (a) 提供来自所述受试者的食管样品 (b) 测定所述样品是否与米曲霉凝集素着色异常； (C)测定在所述样品中是否存在DNA含量异常；和 (d)测定在所述样品中是否存在低度发育异常； 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，则选择加强的监测 的治疗方案。
9. 一种装置或系统，其： (a) 被配置以分析来自受试者的食管样品，其中所述分析包括： (b) 测定所述样品是否与米曲霉凝集素着色异常； (c) 测定在所述样品中是否存在DNA含量异常；和 (d) 测定在所述样品中是否存在低度发育异常； 所述装置或系统包括一个输出模块， 其中，如果（b)是异常的且（c)是异常的，并且存在低度发育异常，则所述输出模块指 示了所述受试者进展至EAC的增加的可能性。
10. 如前述权利要求任一项所述的方法、分析方法、装置或系统，其中所述样品包含福 尔马林固定的石蜡包埋的材料。
11. 如前述权利要求任一项所述的方法、分析方法、装置或系统，其中步骤（b)包括通 过等级着色强度和在所述强度的着色区域的百分比并产生所述着色的H分数来确定所述 样品中米曲霉凝集素的着色水平。
12. 如前述权利要求任一项所述的方法、分析方法、装置或系统，其中步骤（c)包括通 过图像细胞计数DNA分析来测定DNA含量，并从所述测定推断所述DNA含量是否异常。
13. 如前述权利要求任一项所述的方法、分析方法、装置或系统，其中步骤（d)包括样 品的组织学检查，和使用Vienna标准对低度发育异常的存在或缺失进行评分。
14. 如前述权利要求任一项所述的方法、分析方法、装置或系统，其中步骤（e)包括样 品的CA19-9的免疫组织化学着色、着色强度分级和在所述强度的着色面积的百分比，并产 生所述着色的H分数。
15. 如前述权利要求任一项所述的方法、分析方法、装置或系统，其中步骤（f)包括样 品的细胞周期蛋白A的免疫组织化学着色、测定细胞周期蛋白A阳性的上皮表面细胞与细 胞周期蛋白A阴性的上皮表面细胞的百分比，其中1 %或更多的细胞周期蛋白A阳性的上皮 表面细胞的百分比是着色异常。
16. 如前述权利要求任一项所述的方法、分析方法、装置或系统，其中步骤（g)包括样 品的P53的免疫组织化学着色，和对正常的或异常的着色进行评分，其中相比于背景着色 的强的、暗的着色或相比于背景着色的着色缺失是异常着色。
17. 如前述权利要求任一项所述的方法、分析方法、装置或系统，其中步骤（h)包括通 过着色强度的分级和在所述强度的着色面积的百分比来确定所述样品中小麦胚芽凝集素 凝集素的着色水平，并产生所述着色的H分数。
18. -种材料用于涉及高度发育异常或食管腺癌的预后或风险预测应用的用途，所述 材料识别、结合选自P53、细胞周期蛋白A或CA19-9或其片段、其变体或其突变体的多肽或 对此多肽具有亲和性。
19. 材料组合的如权利要求18所述的用途，其中各个材料分别识别、结合所述多肽或 其片段、其变体或其突变体中的一种或多种，或者对其具有亲和性。
20. 米曲霉凝集素或小麦胚芽凝集素凝集素用于涉及高度发育异常或食管腺癌的预后 或风险预测应用的用途。
21. 图像细胞计数DNA分析用于涉及高度发育异常或食管腺癌的预后或风险预测应用 的用途。
22. -种包括材料的分析装置，所述材料结合选自p53、细胞周期蛋白A或CA19-9的多 肽或对所述多肽具有亲和性并进一步包括米曲霉凝集素和/或小麦胚芽凝集素凝集素。
23. 如权利要求20所述的用途或如权利要求22所述的装置，其中所述凝集素包括可检 测的标记。
24. 如权利要求18或19所述的用途或如权利要求22所述的装置，其中所述材料包括 抗体或其片段。
25. -种实质上如上所述的方法、分析方法、装置或系统。
【文档编号】C12Q1/68GK104487595SQ201380038453
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年5月16日 优先权日:2012年5月17日
【发明者】丽贝卡·菲茨杰拉德, 伊丽莎白·伯德-利伯曼 申请人:医药研究委员会