通过分批添加碳源底物和碱来制备有机酸的方法
【专利摘要】本发明提供了一种分批补料培养方法，包括分批添加碳源和碱的步骤，这种方式使得pH值可以保持在适合微生物生长的水平，其中该微生物用于使碳源发酵。本发明还提供了一种使用分批补料培养方法来制备有机酸的方法。本发明在通过微生物发酵制备有机酸时，分批添加中和剂例如碳酸氢铵、碳酸铵或含碱金属的弱碱以及碳源底物。因此，pH值可以保持适合用于碳源发酵的微生物存活的水平，并且注入碳源-碱即源材料的速度可以进行适当调节。本发明可提高产率、得率和有机酸的浓度，并可以根据pH水平的变化自动注入碱和碳源底物，从而提高发酵工艺操作的可靠性和便利性。
【专利说明】通过分批添加碳源底物和碱来制备有机酸的方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及一种通过分批补料培养来生产有机酸的方法。更具体地，本申请涉及 一种通过分批补料的方式添加碳源和碱来生产有机酸的方法。
【背景技术】
[0002] 用于各种食品、食品添加剂、化学原料等中的有机酸长期通过发酵进行生产。近年 来，有机酸被评价为可作为燃料和化学物质的原材料的高可用性资源，其中所述化学物质 可用于研发新型环保可再生能源和化学品。
[0003] 发酵生产有机酸通常以分批方式进行。通过发酵法生产有机酸的方法公开在美 国专利5, 503, 750和5, 766, 439中。根据分批发酵方法，使用于生产目标有机酸的微生物 在生物反应器中生长，其中在该生物反应器中同时添加了供应量有限的用于生长的营养物 质，如糖、氮源、矿物质等。由于糖的供应量有限，因而有机酸的产率也有限，因此在分批培 养中初始采用高浓度的糖以获得更大量的有机酸。然而，高浓度的糖作为抑制微生物生长 的一个因素，会降低发酵速率。补料分批培养被建议作为解决这一问题的替代方案。
[0004] 分批补料培养是生物技术工艺中的操作技术，其中分批培养初始以适当的糖浓度 进行，然后接着提供高浓度的糖来保持培养基中糖的低浓度。关于此技术，依据添加糖的时 间、方法和量，存在多种分批补料培养方法。根据每种方法的不同会影响微生物的生长率和 产率。
[0005] 迄今已知的糖控技术包括以根据微生物的生长模式分析而确定的恒定速率人工 添加糖，以及响应于DO(溶解氧）或pH(氢指数）的信息从而自动添加糖。当应用前项技 术时，分批补料培养与分批培养相比可以提高产率和产量，但也可能因为糖的添加不能与 微生物的生长以及糖的消耗准确地保持一致而效率较低。此外，操作者应持续地观测糖的 添加量。
[0006] 至于后一技术，pH-stat或OD-stat分批补料发酵广泛应用于培养需氧微生物，如 大肠杆菌，因为此方法使培养物中的糖浓度的波动小，并且符合微生物生长曲线。具体地， pH-stat分批补料培养是针对需氧微生物诸如大肠杆菌代谢糖时的pH值下降现象而开发 的，其目的是以最小的浓度来添加糖而不降低微生物的活性。在pH-stat分批补料模式中， 设定所需PH值，并且，当培养物的pH值超过设定值的许可时则添加少量的糖。当少量的糖 被代谢时，PH值略微降低。如果糖被完全消耗，则培养物的pH再次增加，因此添加糖。持 续进行此循环，直到获得满意量的产品。然而，在发酵生产有机酸时，培养物没有发生由糖 消耗引起的PH值的轻微增加，却随着有机酸的生成pH值不断降低。因此，传统的分批补料 培养，如pH-stat法，不能适用于发酵生产有机酸。
【发明内容】
[0007] 技术问题
[0008] 本发明的发明人牢记此问题，即随着有机酸的生成，培养物PH值持续降低，因此 传统的分批补料培养不适合应用于发酵生产有机酸，从而构思了一种生产有机酸的方法， 其中以分批补料的模式添加碳源底物（糖）和碱，由此为生产有机酸的厌氧微生物的生长 创造了最适条件。
[0009] 本发明一方面涉及一种生产有机酸的方法，其通过以分批补料方式简单且可靠地 添加碳源，从而能够以高产率和产量获得高浓度有机酸。
[0010] 技术方案
[0011] 根据其一个方面，本发明提供了一种生产有机酸的方法，其通过分批补料方式将 i)碳源底物和ii)至少一种选自碳酸氢铵或含碱金属的弱碱（例如，碳酸氢钠、碳酸氢钾、 碳酸钠、碳酸钾）的碱组成的混合物添加至包含产有机酸的微生物菌株的生物反应器中， 由此可以同时对培养物的PH值和碳源底物浓度进行适当调节，从而抵抗发酵进行过程中 PH值和碳源底物（例如，糖）浓度的变化。
[0012] 在其另一个方面，本发明提供了一种通过本发明的分批补料培养方法生产丁酸的 方法。
[0013] 有益效果
[0014] 本发明的方法被设置为以一定速率添加碳源，该速率取决于碱的添加速率，其中 碱是依据PH值的变化而添加的。在生产有机酸的发酵体系中，根据本发明，将碳源与碱以 分批补料方式一同添加，以保持碳源在培养基中的恒定浓度。相比于常规的方法中操作者 在直接测量碳源浓度或培养基的pH值或以小时计分析微生物生长情况后确定糖的添加速 率，本发明的方法除了更简单和更具可重复性外，还具有更优异的产率和产量。
[0015] 根据本发明的方法，发酵可以进一步地持续直到碳源完全耗尽，这样能够获得最 大产率，并且伴随产生的副产物如乙酸的产生程度更小。此外，消除或减少了对用于菌种培 养的昂贵培养基的需求。因此，本发明的方法提供了一种减少发酵过程成本的经济策略。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为根据本发明的一个实施方案通过分批补料培养生产有机酸的示意图。
[0017] 图2显示了产品丁酸和副产物乙酸的生成曲线。
【具体实施方式】
[0018] 本发明是基于这样的事实，即通过微生物消耗的碳源和生成的有机酸的量（例 如，降低的pH值）之间存在直接的关联。随着有机酸的生成，用于生产有机酸的培养物中 碳源含量和PH值变低。在本发明中，以分批补料的形式提供由碳源和至少一种选自碳酸氢 铵和含碱金属的弱碱的碱组成的底物-碱混合物，以此补充含量降低的碳源以及由于有机 酸的生成而降低的PH值，因此提高了有机酸的产率。
[0019] 强碱如NaOH、KOH和Ca (OH) 2可用来中和在培养物中产生的有机酸，但这些强碱， 尤其含钙（Ca)的碱，非常容易使蛋白质变性并沉淀。如此强碱进入培养基，会使氮源变性， 从而抑制氮源被微生物利用，导致发酵效率降低。因此，弱碱，尤其是碳酸氢铵、或含碱金属 的弱碱（如碳酸氢钠、碳酸氢钾等）、或这两者被用于中和本发明中的有机酸。碳酸氢铵是 有利的，这是因为它也可以充当微生物生长必需的铵离子营养源。
[0020] 以下是本发明的详述。
[0021] 本发明一个方面涉及通过碳源底物发酵生产有机酸的方法，包括以分批补料方式 添加底物-碱混合物至包含碳源底物和产有机酸的菌株的生物反应器中，以维持适合于发 酵碳源底物的微生物生长的PH值，所述混合物包含：i)碳源底物；和ii)至少一种选自碳 酸氢铵、碳酸铵、和含碱金属的碱中的碱。
[0022] 根据其中的一个实施方案，本发明提供了一种通过分批补料培养生产有机酸的方 法，包括：
[0023] 制备包含有碳源底物、产有机酸的菌株、以及菌株生长的必要成分（菌株生长成 分）的培养基；
[0024] 通过以分批补料方式将底物-碱混合物添加至培养基来创建最适条件，并在该最 适条件下发酵碳源底物，从而使培养基具有最适合产有机酸的菌株生长的PH值，其中所述 底物-碱混合物由碳源底物和至少一种选自碳酸氢铵、碳酸铵、和含碱金属的弱碱中的碱 组成；和
[0025] 从培养基中回收有机酸，该有机酸是通过碳源底物的发酵而生成的。
[0026] 术语"弱碱"是指含有元素周期表的1族中的碱金属的碱，例如碳酸氢钠和碳酸氢 钾。
[0027] 在本发明的一个实施方案中，碳源底物可以是糖，其可以为单糖、二糖、多糖及其 组合的形式。实例包括但不限于：葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、甘 蔗、糖蜜以及淀粉水合物。
[0028] 可根据发酵特性来调整在发酵期间提供的底物-碱混合物中碳源底物和碱的含 量比例，其中发酵特性与碱的溶解度和有机酸的产率有关。假定碳源底物和碱保持为无菌， 碳源底物和碱之间的含量比例甚至可以在发酵过程进行时进行调整。
[0029] 以分批补料方式添加的碳源底物可以与最初包含在生物反应器的培养基中的碳 源底物相同或不同。
[0030] 除了碳源底物外，氮源、维生素、无机盐和/或碳源分解酶（如转化酶）都可能落 在微生物菌株生长的必要成分的范围内。本领域技术人员可以根据菌株从而容易地确定生 长所需成分。
[0031] 在能以本发明的分批补料培养方法生产的有机酸范围内的有：丁酸，乳酸，乙酸， 甲酸，柠檬酸，己二酸，琥珀酸，富马酸，苹果酸，3-羟基丙酸，谷氨酸，戊二酸，葡糖二酸，衣 康酸，丙烯酸，和己二烯二酸，这些均已知可应用于生物燃料和生物化学。
[0032] 任何微生物均可作为本发明中的产有机酸的菌株，只要其可以生产有机酸 即可。产有机酸的菌株可以选自梭状芽孢杆菌属（Clostridium spp.)、假单胞菌属 (Pseudomonas spp.)、根霉属（Rhizopus spp.)、曲霉属（Aspergillus spp.)、棒状杆菌属 (Corynebacterium spp·)、放线菌属（Actinobacillus spp·)、酵母、假丝酵母属（Candida spp.)、毕赤酵母属（Pichia spp.)、大肠杆菌、和乳酸菌。产有机酸的菌株的具体实例包 括酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum)、丁酸梭菌（C.butyricum)、乙酰丁酸梭菌 (C. acetobutyricum)、绿胺杆菌（Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌（P. putida)、焚 光假单胞菌（P.fluorescens)、少根根霉（Rhizopus arrhizus)、米根霉（R.oryzae)、米曲 霉（Aspergillus oryzae)、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)、和嗜酸乳杆 菌（Lactobacillus acidophilus)〇
[0033] 适于单一菌株的发酵条件是本领域公知的。
[0034] 本文中所使用的涉及菌株生长的术语"最适条件"是指包括厌氧条件、温度范围和 pH范围的环境，在此环境下微生物菌株生长，并且伴随着有机酸实现最大生产量。最适条件 可依据所使用的菌株而调节。本领域技术人员可依据微生物菌株的生长阶段调节生物反应 器的环境至最适条件。例如，生物反应器可以被设置为加热或冷却到20°C至50°C的温度， 同时培养基具有4至7的pH值。
[0035] 此外，本发明的一个实施方案预期是一种在梭状芽胞杆菌菌株的存在下，以分批 补料方式提供糖类以及至少一种选自碳酸氢钠和碳酸氢钾的碱，从而通过使糖发酵来生产 丁酸的方法。作为发酵所需，碳源底物、氮源、维生素和矿物质和/或酶例如转化酶可加入 到培养基中。
[0036] 更具体地说，本发明提供了一种通过分批补料培养生产丁酸的方法，包括：
[0037] 制备包含碳源底物、产丁酸的微生物菌株、以及菌株生长的必要成分（生长必要 成分）的培养基；
[0038] 通过以分批补料方式添加底物-碱混合物至培养基，以使培养基具有4. 5至7的 PH值，从而建立最适条件，在该最适条件下发酵碳源底物，其中所述底物-碱混合物由碳源 底物和至少一种选自碳酸氢铵、碳酸氢钠和碳酸氢钾中的碱构成；和
[0039] 从培养基中回收丁酸，该丁酸是随着碳源底物的发酵而生成的。
[0040] 产丁酸的微生物菌株可以是梭状芽孢杆菌属，并且可以选自酪丁酸梭菌、丁酸梭 菌和乙酰丁酸梭菌组成的组。
[0041] 参考图1，解释本发明的一个实施方式。
[0042] 本发明设置为以分批补料方式将进料罐中的含有碳源底物和碱（例如，碳酸氢 铵）的中和溶液加入至发酵罐，在该发酵罐中，碳源底物在微生物存在下发酵生产有机酸。
[0043] 发酵罐可以安装有pH控制传感器和/或气量计。
[0044] pH控制传感器旨在在发酵罐的培养基中建立对产有机酸的微生物生长的最适pH 值。在发酵罐内，对于微生物生长所必需的的典型成分，例如氮源，可以与碳源底物一同存 在。当培养基的PH值随着发酵的进行而偏离预定范围时，系统设定自动添加碳源底物和碱 (例如，碳酸氢铵）的混合物。适合单一产有机酸微生物生长的pH值是本领域已知的。例 如，当生产丁酸时，对于产丁酸的微生物生长的最适pH值在4. 5-7的范围内。
[0045] 气量计可以与pH控制传感器一起或单独安装在发酵罐中，来测定气体在发酵罐 中的生成量和生成速率。气体的生成速率提供了关于底物-碱混合物的添加速率或终止添 加时机的信息。
[0046] 如上所述，本领域技术人员根据气体的生成速率和混合物的添加量，可以容易地 确定底物-碱混合物添加终止的时机。
[0047] 一个规则是，发酵会被它的终产物抑制（产物抑制）。随着发酵的进行，有机酸产 物使得微生物菌株的活性降低。通常情况下，甚至当碳源底物没有完全消耗完发酵就停止。 这种情况下，碳源底物被浪费。在本发明中，弱碱如碳酸氢铵被使用作为中和剂，避免了微 生物菌株受到高PH值影响。伴随二氧化碳（CO 2)和氢气（H2)的产生，所述碱中和了有机 酸，如丁酸。气体的生成速率可用于监测微生物菌株的活性，其提供了关于碳源底物适当添 加时机的信息。因此在本发明中，发酵可以进行至碳源底物完全消耗。因此，由于碳源底物 的供给可以在适当的时间点停止，以避免剩余碳源底物的损失，因此发酵过程可以保持微 生物的最佳活性而有效进行。碳源底物和碱添加完成后，发酵罐的pH值可以以本领域公知 的方法进行调节，例如，通过以恒定速率添加 pH调节剂，如氨水、碱金属氢氧化物溶液、碱 土金属氢氧化物溶液、它们的混合物，例如氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾等。
[0048] 此外，当将根据本发明的分批补料培养方法应用于发酵生产有机酸时，可使用记 载于本发明中的培养基取代用于细菌发酵的菌种培养的昂贵培养基，并将其用在菌种培养 的最后培养阶段，因此极大提高了发酵的经济性。常规丁酸发酵采用RCM(强化梭菌培养 基）或类似的用于菌种培养的富含营养的培养基以提高主培养物的效率。然而，这种昂贵 的菌种培养基增加了生产成本，降低了发酵的经济性。与此相反，根据本发明的补料分批培 养允许在主培养物中采用这种用于菌种培养的最后阶段的培养基，而不会降低微生物的活 性。
[0049] 通过下述实施例的说明可以更好的理解本发明，但其不视为对本发明的限制。
[0050] 实施例
[0051] 比较例1 :分批培养
[0052] 甘鹿液和矿物质（糖浓度150?200g/L，30L)置于被氮气置换的50L厌氧发酵罐 中。在此厌氧条件下，酪丁酸梭菌接种于培养液中，其中酪丁酸梭菌为培养液体积的1%? 20%，然后向培养液中加入氨水以将pH值调节至6.0。随着发酵在37°C下进行，二氧化碳 (CO 2)和氢气（H2)产生，保持此厌氧条件。
[0053] 实施例1 :分批补料培养
[0054] 在50L的厌氧发酵罐中，与比较例1相同的微生物接种到甘蔗液和矿物质中（糖 浓度20?40g/L，10?15L)，然后在37°C培养，同时添加碳酸氢铵和甘蔗液的混合物（碳 酸氢铵80?120g/L，糖浓度200?300g/L，15?20L)，使培养液保持在pH为6. 0。与分批 培养相比，补料分批培养从较小体积的培养基开始，但培养基的最终体积相同。可选地，这 一最终体积可以进行调整。随着发酵的进行，产生COjPH 2气体。当气体的生成速度经监 测达到1. 5?2. 5L/L(发酵罐）/小时的时候，终止添加碳酸氢铵和甘蔗液的混合物，以便 发酵进行直至将此前所添加的糖完全耗尽。
[0055] 对比例1和实施例1的两种培养方法生产的丁酸浓度均为6%或更高。为了进行 比较，当获得相同丁酸浓度时，检测了两种方法在此时间点的效率。比较例1(分批培养） 和实施例1(分批补料培养）的细胞浓度（〇D__ mx)、丁酸产率（Pba)、丁酸的得率（Yba)以及 乙酸的得率（Y aa)的测定结果列于如下的表1中。
[0056] 表 1
[0057]
【权利要求】
1. 一种通过分批补料培养发酵碳源底物以生产有机酸的方法，包括以分批补料方式将 底物-碱混合物添加至包含碳源底物和产有机酸的菌株的反应器中，其中所述底物-碱混 合物包含碳源底物和至少一种选自碳酸氢按、碳酸按和包含碱金属的弱碱中的碱。
2. -种通过分批补料培养生产有机酸的方法，包括： 制备包含碳源底物、产有机酸的菌株和菌株生长成分的培养基； 发酵所述碳源底物，同时以分批补料方式添加底物-碱混合物至所述培养基中，以使 所述培养基具有所述产有机酸的菌株生长的最适pH值，其中所述底物-碱混合物由碳源底 物和至少一种选自碳酸氢铵、碳酸铵和包含碱金属的弱碱中的碱组成；和 从所述培养基中回收所述有机酸，所述有机酸是通过发酵所述碳源底物生产的。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述包含碱金属的弱碱是碳酸氢钠、碳酸钠、碳 酸氢钾、碳酸钾或它们的组合。
4. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述碳源底物是一种或多种选自葡萄糖、果糖、 蔗糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘蔗、糖蜜和淀粉水解物组成的组中的糖。
5. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述有机酸是至少一种选自由丁酸、乳酸、乙酸、 甲酸、柠檬酸、己二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、3-羟基丙酸、谷氨酸、戊二酸、葡糖二酸、衣 康酸、丙烯酸、和己二烯二酸组成的组中的有机酸。
6. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述产有机酸的菌株选自梭状芽孢杆菌属、假单 胞菌属、根霉属、曲霉属、棒状杆菌属、放线菌属、酵母、假丝酵母属、毕赤酵母属、大肠杆菌、 和乳酸菌。
7. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述发酵是在安装有pH控制传感器或气量计、 或者同时安装有这两者的发酵罐中进行的。
8. 如权利要求2所述的方法，其中，所述底物-碱混合物添加完成后，氨水、碱金属氢氧 化物溶液、碱土金属氢氧化物溶液、或它们的组合被添加到发酵罐，以使上述培养基具有所 述产有机酸的菌株生长的最适pH值，直至所述碳源底物发酵完全。
9. 如权利要求2所述的方法，其中所述生长成分为选自由氮源、维生素、矿物质和碳源 分解酶组成的组中的至少一者。
10. -种通过分批补料培养生产丁酸的方法，包括： 制备含有碳源底物、产丁酸的菌株、和所述菌株的生长成分的培养基； 发酵所述碳源底物，同时以分批补料方式添加底物-碱混合物至所述培养基中，以使 所述培养基具有4. 5-7的pH值，其中所述底物-碱混合物由碳源底物和至少一种选自碳酸 氢铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸铵、碳酸钠、碳酸钾及其混合物组成的组中的碱组成；和 从所述培养基中回收丁酸，所述丁酸是通过所述碳源底物的发酵产生的。
11. 如权利要求10所述方法，其中所述产丁酸的菌株是梭状芽孢杆菌属微生物。
【文档编号】C12P7/40GK104487582SQ201380039027
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2012年5月23日
【发明者】朴宰演, 姜信荣, 朴佑赞, 具玟秀, 赵仁镐, 朴重玟, 李承烨, 金佟炫 申请人:Sk新技术株式会社, Sk能源株式会社