白介素-2融合蛋白及其用途

白介素-2融合蛋白及其用途
【专利摘要】本发明一般涉及免疫球蛋白和白介素-2(IL-2)的融合蛋白。另外，本发明涉及编码这类融合蛋白的多核苷酸，和包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明融合蛋白的方法，以及在疾病治疗中使用它们的方法。
【专利说明】白介素-2融合蛋白及其用途 发明领域
[0001] 本发明一般涉及免疫球蛋白和白介素_2(IL-2)的融合蛋白。另外，本发明涉及编 码这类融合蛋白的多核苷酸，以及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉 及用于生成本发明融合蛋白的方法，以及在疾病治疗中使用它们的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 调节性T细胞（Treg)^代表对维持自体耐受至关重要的特定T淋巴细胞子集。这 些具有阻抑剂功能的CD4+CD25?细胞可以通过转录因子F0XP3的胞内表达，以及其它细胞 标志物诸如CD127?、CTLA-4+、LAP、CD39+、PD-1+、GARP、等与效应T细胞区分开。F0XP3对 于Treg分化和功能是至关重要的，而且F0XP3基因缺陷和突变在有皮屑的（scurfy)小鼠 和具有免疫失调多内分泌腺病、肠病、X染色体连锁综合征（IPEX)的患者中均导致自体耐 受故障和自身免疫疾病形成，原因是Treg缺陷或功能缺乏。
[0004]1型糖尿病、系统性红斑狼疮（SLE)、多发性硬化症、和许多其它中的自身免疫应 答与Treg中的缺陷有关。来自动物模型的数据支持下述假设，即自身免疫应答受Treg控 制针对自身的破坏性免疫应答失败推动。1型糖尿病是胰中生成胰岛素的0细胞大多遭 到破坏后发生的一种自身免疫疾病。1型糖尿病在美国人群中的频率为约0. 3%，而且它的 发病率在美国、欧洲、特别是斯堪的纳维亚（几乎1% )继续升高，预期在下面的20年内翻 倍。
[0005] 细胞因子IL-2在Treg以及效应T细胞（Teff)二者的激活和功能中发挥主要作 用。IL-2生成缺陷或响应性缺乏优先导致Treg功能丧失和自身免疫性概率升高。因为 Treg以比Teff高的水平组成性表达高亲和力IL-2受体，所以低剂量的IL-2与Teff细胞 相比优先支持Treg维持。
[0006] 凭借IL-2在体外和在体内优先激活Treg的效果，低剂量、长效IL-2疗法的潜力 似乎会具有在自身免疫疾病中获得成功的较高预期。用lL-2(Proleukin?)进行的一项 200名患者、双盲、安慰剂对照的1型糖尿病临床试验设定为在2013年晚期开始。用每日低 剂量Proleukin?:进行的最近临床试验改善慢性移植物抗宿主病（GVHD)和丙型肝炎病毒 诱导的血管炎的一些体征和症状（Korethetal.，NewEnglJMed365,2055-2066(2011); Saadounetal.，NewEnglJMed365,2067-2077(2011))。在两项研究中，低剂量 Proleukin?均诱导Treg且提高Treg:Teff比。然而，Proleukin?较差的PK特性使之对 于在人中维持低、一致水平的IL-2是亚最佳的。在临床试验中测试的其它方法有Treg离 体个性化扩充，继以再灌注，但是这种办法不够理想且代表有挑战性的一组质量对照问题。
[0007] 如此，再建立天然调节性T细胞（Treg)介导的支配性免疫耐受的新治疗办法会大 大增强治疗具有自身免疫疾病诸如1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、克罗恩氏 病以及其它自身免疫疾病和基于免疫的促炎性疾病诸如慢性移植物抗宿主病、哮喘、肺纤 维化、慢性阻塞性肺病、心血管病诸如动脉粥样硬化、和移植排斥（实体器官和骨髓二者） 的患者的能力。
[0008] 本发明的IL-2融合蛋白优先激活Treg,倾斜平衡朝向更高的Treg:Teff比并降低 自身免疫应答。它们是长效的，容许方便的给药时刻表，而且没有效应器功能，降低潜在副 作用和功效损害。
[0009] 发明概述
[0010] 一方面，本发明提供一种融合蛋白，其包含：
[0011] (i)包含修饰的免疫球蛋白分子，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该 修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力，和
[0012] (ii)两个白介素-2(IL-2)分子。
[0013] 在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白分子，特别是IgGl 亚类免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子为人免疫球蛋白分子。在 一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子能够特异性结合抗原。在一个实施方案中，所述免疫 球蛋白分子为单克隆抗体。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子不能够特异性结合抗 原。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含基于人Vh3-23种系序列的重链可变区序 列。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含SEQIDN0 :9的重链可变区序列。 在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含基于人Vk3-20种系序列的轻链可变区序列。 在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含SEQIDN0 :11的轻链可变区序列。在一 个甚至更加具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含SEQIDN0 :9的重链可变区序列和 SEQIDN0 :11的轻链可变区序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子不能够特异性 结合抗原，且包含基于人Vh3-23种系序列的重链可变区序列和基于人Vk3-20种系序列的 轻链可变区序列。
[0014] 在一个实施方案中，所述Fc受体为Fcy受体，特别是人Fcy受体。在一个实 施方案中，所述Fc受体为激活性Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体选自下组： FcYRIIla(CD16a)，FcYRI(CD64)，FcYRlla(CD32)和FcaRI(CD89)。在一个具体实施方 案中，所述Fc受体为FcyRllla，特别是人FcyRllla。在一个实施方案中，所述修饰降低免 疫球蛋白分子的效应器功能。在一个具体实施方案中，所述效应器功能为抗体依赖性细胞 介导的细胞毒性（ADCC)。在一个实施方案中，所述修饰在所述免疫球蛋白分子的Fc区中， 特别是在CH2区中。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第329位 (EU编号方式）处包含氨基酸替代。在一个具体实施方案中，所述氨基酸替代为P329G。在 一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第234位和第235位（EU编号方 式）处包含氨基酸替代。在一个具体实施方案中，所述氨基酸替代为L234A和L235A(LALA)。 在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第234位、第235位和第329位 (EU编号方式）处包含氨基酸替代。在一个特定实施方案中，所述免疫球蛋白分子在免疫球 蛋白重链中包含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号方式）。
[0015] 在一个实施方案中，所述IL-2分子为野生型IL-2分子。在一个实施方案中，所述 IL-2分子包含与天然存在、天然IL-2相比不改变所述IL-2分子对IL-2受体的结合亲和力 的氨基酸突变。在一个实施方案中，所述IL-2分子在与人IL-2残基125对应的位置处包 含氨基酸突变。在一个更加特定实施方案中，所述氨基酸突变为氨基酸替代C125A。在一个 实施方案中，所述IL-2分子为人IL-2分子。在一个具体实施方案中，所述IL-2分子包含 SEQIDN0:1或SEQIDN0:3的序列，特别是SEQIDN0:3的序列。在一个实施方案中，所 述IL-2分子具有SEQIDN0:1或SEQIDN0:3的序列，特别是SEQIDN0:3的序列。在 一个实施方案中，所述IL-2分子各自在它们的N末端氨基酸融合至所述免疫球蛋白分子的 免疫球蛋白重链之一的C末端氨基酸，任选经由肽接头。
[0016]在一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含SEQIDN0 :17和SEQIDN0 :19的多 肽序列。在一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含SEQIDN0 :19的免疫球蛋白轻链和 SEQIDN0:17的免疫球蛋白重链-IL-2融合多肽。在一个实施方案中，所述融合蛋白基本 上由包含修饰的免疫球蛋白分子、两个白介素-2 (IL-2)分子、和任选的一个或多个肽接头 组成，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体 的结合亲和力。在一个实施方案中，所述融合蛋白基本上由两个SEQIDN0 :19的免疫球蛋 白轻链和两个SEQIDN0 :17的免疫球蛋白重链-IL-2融合多肽组成。
[0017]本发明进一步提供一种多核苷酸，其编码本发明的融合蛋白。进一步提供一种包 含本发明的多核苷酸的载体，特别是表达载体。另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包 含本发明的多核苷酸或载体。本发明还提供一种用于生成本发明的融合蛋白的方法，其包 括以下步骤：（i)在适合于表达该融合蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，并（ii)回收 该融合蛋白。还提供一种融合蛋白，其包含：（i)包含修饰的免疫球蛋白分子，与没有所述 修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力；和 (ii)两个白介素-2 (IL-2)分子，该融合蛋白是通过所述方法生成的。
[0018] 一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白和药学可接受载 齐U。还提供本发明的融合蛋白或药物组合物，其用作药物及用于治疗或预防自身免疫疾病， 具体是1型糖尿病、多发性硬化症（MS)、系统性红斑狼疮（SLE)或克罗恩（Crohn)氏病，最 具体是1型糖尿病，或移植物抗宿主病或移植排斥。进一步提供本发明的融合蛋白在制备 用于治疗有此需要的个体中疾病的药物的用途及治疗个体中疾病的方法，其包括对所述个 体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学可接受形式的本发明的融合蛋白。在一 个实施方案中，所述疾病为自身免疫疾病。在一个更加特定实施方案中，所述自身免疫疾病 为1型糖尿病、多发性硬化症（MS)、系统性红斑狼疮（SLE)或克罗恩氏病。在一个甚至更加 具体实施方案中，所述自身免疫疾病为1型糖尿病。在另一个实施方案中，所述疾病为移植 排斥或移植物抗宿主病。在一个实施方案中，所述个体为哺乳动物，特别是人。
[0019] 进一步提供本发明的融合蛋白，其用于在体外或在体内选择性激活调节性T细 胞。在一个实施方案中，所述激活包含诱导调节性T细胞增殖和/或在调节性T细胞中诱 导IL-2受体信号传导，特别是STAT5磷酸化。在一个实施方案中，所述使用在体外且以约 Ing/mL或更少、特别是约0.Ing/mL或更少的浓度使用所述融合蛋白。在另一个实施方案 中，所述使用在体内且以约20iig/kg体重或更少、特别是约12iig/kg体重或更少、更特别 是约6iig/kg体重或更少的剂量使用所述融合蛋白。
[0020] 本发明还提供一种用于在体外或在体内选择性激活调节性T细胞的方法，其包括 使所述调节性T细胞与本发明的融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述激活包含诱导调 节性T细胞增殖和/或在调节性T细胞中诱导IL-2受体信号传导，特别是STAT5磷酸化。 在一个实施方案中，所述方法在体外且以约Ing/mL或更少、特别是约0.Ing/mL或更少的浓 度使用所述融合蛋白。在另一个实施方案中，所述方法在体内且以约20yg/kg体重或更 少、特别是约12yg/kg体重或更少、更特别是约6iig/kg体重或更少的剂量使用所述融合 蛋白。
[0021] 附图简述
[0022] 图 1。DP47GSIgG-IL-2 融合蛋白（见SEQIDNO13、15、19)的纯化。（A)蛋白A 亲和层析步骤的洗脱图谱。（B)大小排阻层析步骤的洗脱图谱。产率4mg/L。（C)终产物 的分析性毛细管电泳SDS(Caliper)。观察到下述条带：非还原的-7. 5%面积在lllkDa， 92.5%面积在1741^^;还原的-23.6%面积在291^^，23.5%面积在671^^，52.9%面积在 82kDa。产物含有约7.5%"半IgG"。（D)终产物在TSKgelG3000SWXL柱上的分析性大小 排阻层析（91 %单体含量）。
[0023]图 2。DP47GSIgG-(IL-2)^4合蛋白（见SEQIDN0 17、19)的纯化。（A)蛋白A 亲和层析步骤的洗脱图谱。（B)大小排阻层析步骤的洗脱图谱。产率13mg/L。（C)终产物 的分析性毛细管电泳SDS(Caliper)。观察到下述条带：非还原的-2. 3%面积在172. 5kDa， 97. 7%面积在 185kDa;还原的-18. 3%面积在 27. 3kDa，0. 6%面积在 29. 2kDa，81. 1%面积 在78.31^&。（0)终产物在3即6"61 200柱上的分析性大小排阻层析（100%单体含量）。
[0024]图3。CD4+Treg子集、NK细胞子集和NKT细胞上的⑶25 (IL_2RA)和CD122 (IL_2RB) 表达。使用细胞表面标志物来定义⑶4+Treg子集、NKT细胞和NK细胞。为了优化对⑶25 和⑶122的染色，未实施胞内F0XP3染色。（A，B)三种调节性⑶4+T细胞（Treg)群体：幼 稚（CD4SRA+，CD25+;点线），记忆（CD4SRA-，CD25+;实线）和激活的（CD4SRA-，⑶25*;短划 线）。（C，D)NKT(点线）、CD56*NK细胞（短划线）、CD56+#NK细胞（实线）。灰色：同等 型对照。
[0025]图 4。CD4+和CD8+常规T细胞子集上的CD25(IL-2RA)和CD122(IL-2RB)表达。 使用细胞表面标志物来定义幼稚（⑶45RA+;点线）和记忆（⑶45RA_;实线）常规⑶4+T细胞 (A，B)、记忆常规⑶8+T细胞（⑶45RA]实线）和⑶45RA+CD8T细胞（幼稚和TEMRA子集的 组合；TEMRA指恢复成表达⑶45RA的效应记忆细胞；点线）（C，D)。灰色：同等型对照。
[0026] 图5。人外周血细胞子集中响应DP47GSIgG-IL-2的pSTAT5a诱导。在分开的时 间对三名不同人供体（C4至C6)评估多种剂量的DP47GSIgG-IL-2对STAT5a磷酸化诱导 的影响。显示⑶4+Treg子集的结果：激活的、记忆和幼稚Treg;常规⑶4+记忆T效应细胞； ⑶56*NK细胞；⑶8+记忆T效应细胞；⑶4 +幼稚T效应细胞；NK细胞；NKT细胞；和⑶8 +幼 稚T效应+⑶45RA+记忆细胞。
[0027] 图6。人外周血细胞子集中响应DP47GSIgG-(IL-2)^pSTAT5a诱导。在分开的 时间对五名不同人供体（N1、N2、C4-C6)评估多种剂量的DP47GSIgG-(IL-2)2免疫缀合物对 STAT5a磷酸化诱导的影响。显示⑶4+Treg子集的结果：激活的、记忆和幼稚Treg;常规⑶4+ 记忆T效应细胞；⑶56胃NK细胞；⑶8+记忆T效应细胞；⑶4 +幼稚T效应细胞；NK细胞；NKT 细胞；和CD8+幼稚T效应+CD45RA+记忆细胞。
[0028] 图7。人外周血细胞子集中的pSTAT5a诱导：DP47GSIgG-IL-2和 DP47GSIgG-(IL-2) 2的比较。将每一种细胞子集的结果相对于来自每一个子集的最大观察 效果标准化，并将Treg的近似EC5Q呈现于表2。（A)DP47GSIgG-IL-2的标准化结果，（B) DP47GSIgG-(IL-2)j^标准化结果。
[0029] 图8。三名供体中Treg子集敏感性的详细检查，比较DP47GSIgG-IL-2和DP47GS IgG-(IL-2)2。图代表三名供体的pSTAT5aMFI的均值土SD。（A)总CD3+，CD4+，FoxP3+Treg。 (B)激活的Treg。（C)记忆Treg。（D)幼稚Treg。
[0030] 图9。DP47GSIgG_IL2在猕猴中具有提高调节性T细胞的剂量依赖性效果。 以⑷每mm3全血Treg的绝对细胞数和⑶Treg的倍数变化显示处理后第7天全血 ⑶4+CD25+F0XP3+调节性T细胞（Treg)的变化。以均值土SD呈现所有数据。空心柱：DP47GS IgG-IL-2(n= 6);阴影柱：媒介（n= 3)。
[0031] 图10。DP47GSIgG-IL-2对猕猴中Treg的时间和低剂量效果。（A) 2或6iig/kg DP47GSIgG-IL-2 (分别为n= 4和6)剂量给药后Treg倍数升高的时间依赖性变化。（B) 2 或6yg/kgDP47GSIgG-IL-2 (分别为n= 4和6)剂量给药后血液中Treg绝对数的时间 依赖性变化。以均值土SD呈现所有数据。
[0032] 图11。单剂Proleukin?在猕猴中刺激瞬时剂量依赖性Treg响应。（A)3xl04 至3xl05IU/kgProleukin?单剂处理后外周血Treg数目的变化。⑶3xl04至3x10 5IU/ kgProleukin?1 丫1.剂处理后TregpSTAT5a的变化。以均值土SD呈现所有数据。
[0033] 图12。低剂量DP47GSIgG-IL-2在猕猴中的Treg诱导方面比高剂量Proleukin? 更加有效。用低剂量DP47GSIgG-IL-2或高剂量Proleukin?处理正常健康猕猴（各组n =5)，并在第10天测试调节性T细胞的变化。在第0天和第7天，以16, 800IU/kg(12yg/ kg)的剂量SC给予DP47GSIgG-IL-2。每周 3 次SC给予Proleukin?处理（200,000IU/kg) (MWF)，总共5剂。对于（A)总Treg每mm3血液的变化、（B)Treg的倍数升高、和（C)Treg与 常规⑶4+F0XPT细胞的比率的变化，以均值土SD显示结果。空心柱描绘IL-2处理，而阴影 柱描绘媒介对照。
[0034] 图13。离体全血磷酸化STAT5作为DP47GSIgG-IL-2Treg体内激活的灵敏生物标 志物。在给健康猕猴（n= 5)体内施用单次低剂量DP47GSIgG-IL-2(12iig/kg)后1和3 天，收集全血并在没有刺激磷酸化STAT5(pSTAT5a)的情况下立即测试。在第0天在处理前 对每一只猴采血，测量pSTAT5a的量（阴影柱），并个别地用于评估处理后倍数变化（空心 柱）。显示（A)第1天和第3天TregpSTAT5a的倍数变化，⑶常规CD4+CD45-记忆T细胞 中pSTAT5a的倍数变化，和（C)幼稚T细胞pSTAT5a的倍数变化。以均值土SD显示数据。
[0035] 图14。离体全血pSTAT5a作为低剂量DP47GSIgG-IL-2Treg体内激活的灵敏生物 标志物。在给健康猕猴体内施用单次低剂量DP47GSIgG-IL-2后1至7天，收集全血并在 没有刺激pSTAT5a的情况下立即测试。在第0天在处理前对每一只猴采血用于测量未刺激 pSTAT5a水平，并与处理后的pSTAT5a变化比较。（A)用2iig/kgDP47GSIgG-IL-2处理之 前和之后的TregpSTAT5a(n= 4)。（B)用g/kgDP47GSIgG-IL-2处理之前和之后的 TregpSTAT5a(n= 6)。以均值土SD显示数据。
[0036] 图15。离体猕猴全血Ki-67充当DP47GSIgG-IL-2在体内诱导的T细胞增殖的 标志物。还对如图14所述用2和6iig/kgDP47GSIgG-IL-2处理的猕猴离体监测胞内标 志物Ki-67的变化以评估体内增殖的程度。在第0天在处理前量化处于细胞周期中的细 胞（Ki-67+)的正常稳态百分比，然后下面的7至11天每天监测。显示（A)用于Treg的％ 灯乂了^⑶用于常规⑶^^^-记忆/效应了细胞的^灯乂了^和⑵用于幼稚⑶^^^狀+丁 细胞的％Ki-67+。以均值土SD显示数据。
[0037] 图16。DP47GSIgG-(IL_2)2对幼稚健康猕猴中的Treg的时间和低剂量效果。 (A)6iig/kg0?47186-(11-2)2后1'代8绝对数的时间依赖性变化，（B)处理后TregpSTAT5a 的时间依赖性变化，（C)Treg的倍数升高的时间依赖性变化，和（D)来自DP47GsIgG-IL-2 处理的猴（空心柱，2至36iig/kg)与DP47GSIgG-(IL-2)2&理的猴（阴影柱，g/kg)的Treg的倍数变化的比较。以均值土SD显示所有数据（n= 4至6)。
[0038] 图17。很低剂量DP47GSIgG-(IL_2)2对幼稚健康猕猴中的Treg的时间和剂量依 赖性效果。（A)施用0? 7和2yg/kgDP47GS1§6-(11-2)2后Treg倍数升高的时间依赖性 变化，（B)在第0天在治疗之前和第1-4天在治疗之后测量的TregpSTAT5a的依赖性变化， (C)T效应/记忆细胞pSTAT5a的时间依赖性变化。以均值土SD显示所有数据（0. 7yg/kg 时n= 3, 2ug/kg时n= 8)。
[0039] 图18。DP47GSIgG-IL-2与DP47GSIgG-(IL-2)J9剂量依赖性比较及其提高全 血猕猴Treg的能力。以均值土SD呈现所有数据（n= 3至6)。
[0040] 图19。高剂量IL-2在猕猴中诱导嗜曙红细胞增多。在用Proleukin?.或TL-2的 免疫缀合物进行的所有测试中监测血液嗜曙红细胞计数的变化。在用高剂f.:Proleukin? (2xl05IU/kg，每周3次，持续2周）或更高剂量DP47GSIgG-IL-2处理后7至14天检测到 嗜曙红细胞增多。基线嗜曙红细胞计数为左边的阴影柱，而6iig/kgDP47GSIgG-(IL-2)2 后的嗜曙红细胞计数为右边的阴影柱。（A)来自每一个剂量组的每一种动物的嗜曙红细胞 计数和（B)仅来自在处理后嗜曙红细胞升高的动物的嗜曙红细胞计数。以均值土SD显示 数据。
[0041] 图20。DP47GSIgG-IL-2具有与Proleukin?:相比增强的PK特性。给N0D小鼠 腹膜内（IP)(左边小图）或皮下（SC)(右边小图）注射所示剂量的DP47GSIgG-IL-2或 Proleukin?。在所示时间通过基于单抗的捕捉测定法在血清样品中评估人IL-2,并以穿过 每一幅图的水平线显示每一项测定法的检测限。
[0042] 图 21。用Proleukin?、DP47GSIgG-IL-2、和DP47GSIgG-(IL-2)2#理后鼠Treg 中CD25 和F0XP3 均升高。用Proleukin? (20, 000 和 100, 000IU/ 小鼠，n= 3)、DP47GS 186-11-2、或0卩4765 186-(11-2)2(60、300、或1，500几/小鼠，11 = 3)处理8六1^/(3小鼠， 包括用媒介处理的小鼠作为未刺激对照（n= 4)。处理后24小时，对脾Treg评估⑶25和 F0XP3水平。对三种IL2分子均观察到（A)细胞表面CD25的剂量依赖性变化和（B)胞内 F0XP3的剂量依赖性变化。对于⑶25和F0XP3,媒介小鼠的均值MFI分别为4, 900和1，566。 以均值土SD呈现数据（n= 3)。
[0043] 图22。体内DP47GSIgG-IL-2处理阻抑鼠绵羊红血球迟发型超敏感性 (DTH)。显示用媒介（100%响应）、IgG-IL-2(4,000IU/小鼠）、或作为阳性对照的小鼠 CTLA-4-Ig(200iig/小鼠）处理的小鼠个体的所有数据。来自（A)N0D小鼠和（B)C57BL/6 小鼠的结果。以爪重量与未免疫小鼠相比的变化（A爪重量）显示第4天DTH响应的程度。 以均值土SD呈现数据。
[0044] 图23。体内DP47GSIgG-IL-2 (4, 000IU/小鼠）处理阻抑针对KLH的鼠IgG抗体 应答，（A)C57BL/6小鼠，免疫后21天和⑶N0D小鼠，免疫后7天。以均值土SD显示数据。
[0045] 发明详述
[0046] 定义
[0047] 除非在下文另外定义，术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。
[0048] 如本文中使用的，术语"融合蛋白"指包含免疫球蛋白分子和IL-2分子的融合多 肽分子，其中融合蛋白的组件通过肽键彼此连接，或是直接地或是经由肽接头。为清楚起 见，融合蛋白的免疫球蛋白构件的各个肽链可以是非共价连接的，例如通过二硫键。
[0049] "融合"意指各组分直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。
[0050] "特异性结合"意指结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相 互作用区别开来。免疫球蛋白结合特定抗原的能力能经由酶联免疫吸附测定法（ELISA) 或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振技术（在BIAcore仪上分析） (Liljebladetal.，GlycoJ17, 323-329 (2000))，以及传统的结合测定法（Heeley，Endocr Res28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中，免疫球蛋白对无关蛋白的结合程 度是该免疫球蛋白对抗原结合的小于约10%，如例如通过SPR测量的。在某些实施方案 中，结合抗原的免疫球蛋白具有彡luM、彡100nM、彡10nM、彡InM、彡0.InM、彡0.OlnM、或 彡0?OOlnM(例如1(T8M以下，例如1(T8M至1(T13M，例如1(T9M至1(T13M)的解离常数（KD)。
[0051] "亲和力"或"结合亲和力"指分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶（例 如抗原）之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，"结合亲和力" 指反映结合对的成员（例如抗体和抗原）之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对 其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数（KD)来表述，其为解离与结合速率常数（分别为 和的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率 保持相同。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中描述的那些方法。用 于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振（SPR)。
[0052] "降低的结合"，例如降低的对Fc受体的结合，指相应相互作用的亲和力降低，如例 如通过SPR测量的。为了清楚，该术语还包括亲和力降低至0 (或低于分析方法的检测限）， 即完全消除相互作用。相反，"升高的结合"指相应相互作用的结合亲和力升高。
[0053] 如本文中使用的，术语"抗原性决定簇"与"抗原"同义，并且指多肽大分子上与抗 体结合，从而形成抗体-抗原复合物的位点（例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的 不同区构成的构象性构造）。可用的抗原性决定簇可以例如在细胞表面上、游离在血液血清 中和/或在胞外基质（ECM)中找到。
[0054] 如本文中使用的，术语"单链"指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。
[0055] 术语"抗体"在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗 体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、和抗体片段，只要它们展现出期望的 抗原结合活性。
[0056] "抗体片段"指完整抗体外的分子，其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原 的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab' -SH、F(ab'）2、双抗体、线性 抗体、单链抗体分子（例如scFv)、和单域抗体。
[0057] 术语"免疫球蛋白分子"指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免 疫球蛋白是约150, 000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链 构成。从N端至C端，每条免疫球蛋白重链具有可变区（VH)，也称为可变重域或重链可变域， 接着是3个恒定域（CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条免疫 球蛋白轻链具有可变区（VL)，也称为可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻（CL)域（也称 为轻链恒定区）。免疫球蛋白的重链可以归入称为a(IgA)、5 (IgD)、e(IgE)、Y(IgG)或 y(igM)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如bagGihhaghhhagGj、 hagG^aJIgAi)和a2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归 入称为卡帕（k)和拉姆达（A)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连 接的两个Fab分子和Fc域组成。
[0058] 如本文中使用的，"Fab片段"指包含轻链的VL域和恒定域（CL)及重链的VH域和 第一恒定域（CH1)的免疫球蛋白片段。
[0059] 抗体或免疫球蛋白的"类"指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种 主要的类：184、18〇、1 §￡、1§6和1§]?，并且这些中数种可以进一步分成亚类（同种型），例如 IgGpIgG2、IgG3、IgG4、IgA#IgA2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为a、 S、e、y和]i。
[0060] 术语"可变区"或"可变域"指免疫球蛋白或抗体重或轻链中一般牵涉免疫球蛋白 或抗体结合抗原的域。然而，本发明的融合蛋白中包含的免疫球蛋白可包含不赋予抗原结 合特异性的可变区。免疫球蛋白或抗体的重链和轻链的可变域（分别为VH和VL) -般具 有类似的结构，每个域包含4个保守的框架区（FR)和3个高变区（HVR)。参见例如Kindt etal.，KubyImmunology, 6thed.，W.H.FreemanandCo.，page91(2007)。单个VH或VL 域可能足以赋予抗原结合特异性。
[0061] 如本文中所使用的，术语"高变区"或"HVR"指免疫球蛋白或抗体可变域中在序列 上高变的和/或形成结构上限定的环（"高变环"）的每个区域。一般地，天然的4链抗体包 含6个爪^;三个在￥11中〇11、112、113)，且三个在￥1中仏1、12、13)。爪^一般包含来自高变 环和/或来自"互补决定区"(CDR)的氣基酸残基，后一种是最商序列变异性的和/或牵涉抗 原识别。例示性的高变环存在于氨基酸残基26-32 (LI)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、 53-55 (H2)、和 96-101 (H3)(ChothiaandLesk，J.Mol.Biol. 196,901-917(1987))。例示 性的⑶R(⑶R-L1、⑶R-L2、⑶R-L3、⑶R-H1、⑶R-H2、和⑶R-H3)存在于L1的氨基酸残 基 24-34、L2 的 50-56、L3 的 89-97、H1 的 31-35B、H2 的 50-65、和H3 的 95-102(Kabat etal. ,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest, 5thEd.PublicHealth Service,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1 外，CDR 一般包含形成高变环的氨基酸残基。⑶R还包含"特异性决定残基"，或"SDR"，其是接触抗 原的残基。SDR包含在称作缩短的-⑶R，或a-⑶R的⑶R区域内。例示性的a-⑶R(a-⑶R-L1、 a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-Hl、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1 的氨基酸残基 31-34、 L2 的 50-55、L3 的 89-96、HI的 31-35B、H2 的 50-58、和H3 的 95-102 (参见Almagroand Fransson,Front.Biosci. 13, 1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其 它残基（例如，FR残基）在本文中依照Kabat等，见上文编号（称作"Kabat编号"）。
[0062] "框架"或"FR"指除高变区（HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR-般由4个 FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因而，HVR和FR序列一般以下列顺序出现在VH(或VL) 中：FR1-H1(LI)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
[0063] "人免疫球蛋白"指拥有与由人或人细胞生成的或利用人免疫球蛋白全集或其它 人免疫球蛋白编码序列自非人来源衍生的免疫球蛋白的氨基酸序列对应的氨基酸序列的 免疫球蛋白。人免疫球蛋白的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化免疫球蛋 白。
[0064] 如本文中所使用的，术语"单克隆抗体"指从一群基本上同质的抗体获得的抗体， 即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在 单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与 通常包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备 物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语"单克隆"指示抗体自一群基 本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以 通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA 方法、噬菌体展示方法、和利用含有整个或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法， 本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
[0065] 本文中术语"Fc域"或"Fc区"用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一 部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgGFc区包含IgGCH2和IgG CH3域。人IgGFc区的"CH2域"通常自大约位置231处的氨基酸残基延伸至大约位置340 处的氨基酸残基。在一个实施方案中，碳水化合物链附着至CH2域。本文中的CH2域可以 是天然序列CH2域或变体CH2域。"CH3域"包含Fc区中CH2域C端的一段残基（即IgG 中自大约位置341处的氨基酸残基至大约位置447处的氨基酸残基）。本文中的CH3区可 以是天然序列CH3域或变体CH3域（例如具有在其一条链中引入的"隆起""节"）和在 其另一条链中相应引入的"空腔""穴"）的CH3域；参见美国专利No. 5, 821，333,通过述 及明确收入本文）。此类变体CH3域可以用于促进两条不相同免疫球蛋白重链的异二聚化， 如本文中描述的。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226或Pro230延伸至重链 的羧基端。然而，可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸（Lys447)。除非本文中另外指定， Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称为EU索引，如记载于Kabat etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealth Service,NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD，1991〇
[0066] 术语"效应器功能"指那些可归于免疫球蛋白Fc区且随免疫球蛋白同种型而变 化的生物学活性。免疫球蛋白效应器功能的例子包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性 (CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用 (ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体（例如 B细胞受体）下调和B细胞活化。
[0067] "激活性Fc受体"是一种在免疫球蛋白的Fc区衔接后，引发刺激携带该受体的细 胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。激活性Fc受体包括FcyRllla(⑶16a)、FcYRI(CD64)、FcYRlla(CD32)和FcaRI(CD89)。一种具体的激活性Fc受体为人 FcyRIIla(参见UniProt登录号P08637 (版本 141))。
[0068] 如本文中使用的，术语"白介素_2 "或"IL-2 "指来自任何脊椎动物来源的任何天 然IL-2,包括哺乳动物，诸如灵长类动物（例如人）和啮齿类动物（例如小鼠和大鼠），除 非另有说明。该术语涵盖未加工的IL-2以及源自细胞中加工的任何形式的IL-2。该术语 还涵盖IL-2的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人IL-2的氨基酸序 列显示于SEQIDN0 :1。未加工的人IL-2另外包含N末端20个氨基酸的信号肽，其在成 熟IL-2分子中缺失。
[0069] "天然IL-2"，也称作"野生型IL-2"，意指天然存在IL-2。天然人IL-2分子的序 列显示于SEQIDN0 :1。为了本发明的目的，术语野生型还涵盖下述形式的IL-2,其包含 一处或多处与天然存在、天然IL-2相比不改变IL-2受体结合的氨基酸突变，诸如例如与人IL-2残基125对应的位置处半胱氨酸变成丙氨酸的替代。在一些实施方案中，本发明目的 的野生型IL-2包含氨基酸替代C125A(参见SEQIDNO:3)。
[0070] 如本文中使用的，术语"CD25"或"IL-2受体a"指来自任何脊椎动物来源的任何 天然CD25,包括哺乳动物，诸如灵长类动物（例如人）和啮齿类动物（例如小鼠和大鼠），除 非另有说明。该术语涵盖"全长"、未加工的⑶25以及源自细胞中加工的任何形式的⑶25。 该术语还涵盖CD25的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。在某些实施方案中，CD25 为人⑶25。一种例示性人⑶25的氨基酸序列（带信号序列、Avi标签和His标签）显示于 SEQIDNO：25〇
[0071] 如本文中使用的，术语"高亲和力IL-2受体"指由受体Y亚基（也称作共同细胞 因子受体Y亚基、Yc、或⑶132)、受体0亚基（也称作⑶122或p70)和受体a亚基（也 称作⑶25或p55)组成的IL-2受体异三聚体形式。比较而言，术语"中等亲和力L-2受体" 或"IL-2受体0Y"指只包括Y亚基和P亚基，没有a亚基的IL-2受体（综述参见例 如OlejniczakandKasprzak，MedSciMonit14，RA179-189(2008))。例示性人CD122 和 ⑶132的氨基酸序列（融合至Fc区，带His标签）分别显示于SEQIDNO21和23。
[0072] "调节性T细胞"或"Treg细胞"意指专门化类型的⑶4+T细胞，其能阻抑其它T细 胞的应答。Treg细胞特征在于表达CD4、IL_2受体的a亚基（CD25)、和转录因子forkhead boxP3(F0XP3)(Sakaguchi，AnnuRevImmunol22,531-62(2004))且在诱导和维持针对包 括由肿瘤表达的抗原在内的抗原的外周自体耐受中发挥至关重要作用。
[0073] "选择性激活Treg细胞"意指在基本上没有伴随激活其它T细胞子集（诸如⑶4+T 辅助细胞、CD8+细胞毒性T细胞、NKT细胞）或天然杀伤（NK)细胞的情况下激活Treg细 胞。实施例中描述了用于鉴定和区分这些细胞类型的方法。激活可包括诱导IL-2受体信号 传导（以例如通过检测磷酸化STAT5a测量）、诱导增殖（以例如通过检测Ki-67来测量） 和/或上调激活标志物（诸如例如⑶25)表达。
[0074] 术语"肽接头"为包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸的肽。肽接头是 本领域中已知的或本文中记载的。合适的、非免疫原性的接头肽包括例如（G4S)n、（SG4)n或 G4(SG4)n肽接头。"n"一般是介于1和10之间的数字，通常介于2和4之间。
[0075] 术语"修饰"指对肽主链（例如氨基酸序列）的任何操作或对多肽的翻译后修饰 (例如糖基化）。
[0076] "节入穴修饰"指CH3域中两条免疫球蛋白重链之间的界面内的修饰，其中i)在一 条重链的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一条 重链的CH3域中的界面内生成隆起（"节")，其可放置在另一条重链的CH3域中的界面内的 空腔("穴"）中，和ii)在另一条重链的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨 基酸残基替换，由此在第二CH3域的界面内生成空腔("穴")，其中可放置第一CH3域中的界 面内的隆起（"节")。在一个实施方案中，"节入穴修饰"包含抗体重链之一中的氨基酸替代 T366W和任选的氨基酸替代S354C，及抗体重链另一中的氨基酸替代T366S、L368A、Y407V和 任选的Y349C。节入穴技术记载于例如US5,731，168;US7,695,936;Ridgwayetal.，Prot Eng9, 617-621 (1996)及Carter,JImmunolMeth248,7-15(2001)。一般地，该方法牵涉 引入第一多肽的界面处的隆起（"节"）和第二多肽的界面中的相应空腔（"穴"），使得隆 起可位于空腔中，从而促进异二聚化和阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小 氨基酸侧链用更大侧链（例如酪氨酸或色氨酸）来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用更小 侧链（例如丙氨酸或苏氨酸）替换在第二多肽的界面中创建与隆起大小相同或相似的互补 空腔。分别在位置S354和Y349处引入两个半胱氨酸残基导致在Fc区中的两条抗体重链 之间形成二硫桥，进一步使二聚体稳定化（Carter,JImmunolMethods248, 7-15 (2001))。
[0077] 氨基酸"替代"指多肽中一个氨基酸用另一种氨基酸替换。在一个实施方案中，氨 基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。"保守" 氨基酸替代可以在所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性性质的 相似性基础上进行。例如，非极性（疏水性）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱 氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；带正电荷（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨 酸；而带负电荷（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。非保守替代会需要用这些类别之 一的成员交换另一个类别的成员。例如，氨基酸替代还可导致将一个氨基酸用具有不同结 构和/或化学特性的另一种氨基酸替换，例如将来自一个组（例如极性）的氨基酸用来自 一个不同组（例如碱性）的另一种氨基酸替换。可以使用本领域公知的遗传或化学方法来 生成氨基酸替代。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等等。涵盖的是，通过除遗传工 程以外的方法（诸如化学修饰）改变氨基酸侧链基团的方法也可能是有用的。本文中可能 使用了多种命名来指示同一氨基酸替代。例如，免疫球蛋白重链第329位自脯氨酸变成甘 氨酸的替代可以以329G、G329、G329、P329G、或Pro329Gly来指示。
[0078] 关于参照多肽序列的"百分比（％ )氨基酸序列同一性"定义为在比对序列并在必 要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守性取代视为序列同一性的 一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测 定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用 公众可得到的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技 术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任 何算法。然而，就本文中目的而言，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成％氨基酸序列 同一'I"生值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已与用户文 档一起提交到美国版权局（U.S.CopyrightOffice),WashingtonD.C. ,20559,其在美国版 权注册No.TXU510087 下注册。ALIGN-2 程序可从Genentech，Inc.，SouthSanFrancisco， Ca1ifornia公开获得,或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编用于UNIX操作系统，包 括数字UNIXV4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不改变。在采用ALIGN-2 进行氨基酸序列比较的情况下，给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的％ 氨基酸序列同一性（或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列B具有或包含 特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
[0079] 分数X/Y的100倍
[0080] 其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评为相同匹配的 氨基酸残基数，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是，当氨基酸序列A的长度不 等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序 列同一性。除非另外明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值如在上一段中描 述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
[0081]"多核苷酸"或"核酸"在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，而且包 括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/ 或它们的类似物，或能由DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何物质。多核 苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。核苷酸序列可以被非核苷 酸构件中断。多核苷酸可包含合成后进行的修饰，诸如缀合至标记物。
[0082]与本发明的参照核苷酸序列具有至少例如95% "相同的"核苷酸序列的核酸或 多核苷酸意指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只不过按照参照核苷酸序列的每 100个核苷酸，该多核苷酸序列可以包含多达5处点突变。换言之，为了获得与参照核苷酸 序列具有至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以删除或用另一种核苷酸取代参照序 列中高达5%的核苷酸，或者可以将参照序列中占总核苷酸的高达5%的数目的核苷酸插 入到参照序列中。参照序列的这些变更可以发生在参照核苷酸序列的5'或3'端位置或那 些末端位置之间的任意地方，个别分散在参照序列中的残基中或分散在参照序列内的一或 多个连续组中。作为一个实际问题，可以使用已知的计算机程序，如上文针对多肽论述的程 序（例如ALIGN-2)来常规确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列为至 少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
[0083]如本文中所使用的，术语"载体"指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。 该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中 的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为"表达 载体"。
[0084]术语"宿主细胞"、"宿主细胞系"和"宿主细胞培养物"可交换使用并指已引入外源 核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括"转化体"和"经转化的细胞"，其包括初始 转化的细胞和自其衍生的后代（不考虑传代数）。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不 完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能 或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成本发明的融合蛋白的任意类型的细胞 系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞如CH0细胞、BHK细胞、NS0细胞、 SP2/0细胞、Y0骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、 酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或 动物组织中包含的细胞。
[0085]药剂的"有效量"指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。 [0086] 药剂例如药物组合物的"治疗有效量"指有效实现期望的治疗或预防结果的量 (以必要的剂量且持续必要的时间）。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预 防疾病的不良作用。
[0087]"个体"或"受试者"是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物（例如牛、 绵羊、猫、犬和马）、灵长类（例如人和非人灵长类如猴）、家兔和啮齿动物（例如小鼠和大 鼠）。特别地，所述个体或受试者是人。
[0088] 术语"药物组合物"指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效，且 不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
[0089] "药学可接受载体"指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接 受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0090] 如本文中使用的，"治疗/处理"（及其语法变体）指试图改变治疗个体中疾病的 自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望 效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学 后果、预防转移、减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、及消退或改善的预后。在一些实 施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。
[0091] "自身免疫疾病"指源自或针对个体自身组织的非恶性疾病或病症。自身免疫疾 病或病症的例子包括但不限于炎症应答诸如炎性皮肤病，包括银屑病和皮炎（例如特应性 皮炎）；与炎性肠病有关的应答（诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎）；皮炎；变应性疾患，诸 如湿疹和哮喘；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮（SLE)(包括但不限于狼疮肾炎、皮肤狼 疮）；糖尿病（例如1型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病）；多发性硬化症和青少年型糖尿病。 [0092] 本发明的融合蛋白
[0093] 本发明提供新颖的免疫球蛋白-IL-2融合蛋白，其具有特别有利的特性可用于本 文所述治疗方法。
[0094] 在第一个方面，本发明提供一种融合蛋白，其包含：
[0095] (i)包含修饰的免疫球蛋白分子，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该 修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力，和
[0096] (ii)两个白介素-2 (IL-2)分子。
[0097] 在一个实施方案中，所述融合蛋白基本上由包含修饰的免疫球蛋白分子、两个白 介素-2(IL_2)分子、和任选的一个或多个肽接头组成，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白 分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力。
[0098] 如实施例中显示的，包含两个IL-2分子的融合蛋白令人惊讶地提供与包含单个IL-2分子的相应融合蛋白相比大大改善的功效和激活调节性T细胞方面的选择性。
[0099] 在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白分子，特别是IgGl 亚类免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子为人免疫球蛋白分子，即它 包含完全人的可变和恒定区。一种例示性人IgGl恒定区的序列显示于SEQIDNOAoIgG类 免疫球蛋白分子包含（i)两条免疫球蛋白轻链，每一条自N至C末端包含轻链可变域（VL) 和轻链恒定域（CL)，和（ii)两条免疫球蛋白重链，每一条自N末端至C末端包含重链可变 域（VH)、重链恒定域（CH) 1、免疫球蛋白铰链区、CH2域和CH3域。后两个域形成免疫球蛋 白分子的Fc区的一部分。两条重链在Fc区中二聚化。
[0100] 在依照本发明的融合蛋白的一个实施方案中，所述两个IL-2分子各自在它们的N 末端氨基酸融合至所述免疫球蛋白分子的免疫球蛋白重链之一的C末端氨基酸，任选经由 肽接头。两个（相同的）IL_2分子与免疫球蛋白重链的融合容许简单生成融合蛋白，避免 形成不想要的副产物及规避对促进不相同重链异二聚化的修饰，诸如节入穴修饰的需要。
[0101] IL-2分子与免疫球蛋白分子的融合提供与游离（未融合）IL-2相比有利的药动 学特性，包括长血清半衰期（由于经由结合FcRn的再循环、和分子大小充分超出肾过滤的 阈）。而且，免疫球蛋白分子的存在还能够通过例如蛋白A亲和层析来简单纯化融合蛋白。 然而，免疫球蛋白分子（具体是免疫球蛋白分子的Fc区）的存在同时可引起不想要的将融 合蛋白靶向表达Fc受体的细胞，而非优选的携带IL-2受体的细胞。此外，Fc受体的参与 可引起（促炎症）细胞因子的释放和除调节性T细胞以外的多种免疫细胞不想要的激活。 因此，本发明的融合蛋白中包含的所述免疫球蛋白分子包含修饰，与没有所述修饰的相应 免疫球蛋白分子相比，该修饰降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力。在一个具体实 施方案中，所述Fc受体为Fcy受体，特别是人Fcy受体。对Fc受体的结合亲和力可容易 地测定，例如通过ELISA或通过表面等离振子共振（SPR)，使用标准仪器设备，诸如BIAcore 设备（GEHealthcare)和Fc受体，诸如可通过重组表达获得。下面描述了一种用于测量 结合亲和力的具体的示例性和例示性实施方案。依照一个实施方案，于25°C用在CM5芯片 上固定化的配体（Fc受体）使用BIACORE?T100仪器（GEHealthcare)通过表面等离 振子共振测量对Fc受体的结合亲和力。简言之，用盐酸N-乙基-N' -(3-二甲基氨基丙 基）_碳二亚胺（EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)依照供应商的用法说明书活化羧甲基化 右旋糖苷生物传感器芯片（CM5，GEHealthcare)。用10mM乙酸钠pH5. 5将重组配体稀释 至0? 5-30iig/ml，之后以10iil/min流速注射以实现大约100-5000个响应单位（RU)的偶 联蛋白质。注射配体后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，于25°C以 大约 30-50ii1/min的流速注射抗体在HBS-EP+(GEHealthcare，10mMHEPES，150mMNaCl， 3!111^0了4,0.05%表面活性剂？204117.4)中的3至5倍连续稀释液（范围介于约0.011^ 至300nM之间）。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单一对一朗格缪尔（Langmuir)结 合模型（BIACORE?TIOOEvaluationSoftwareversion1. 1. 1)计算结合速率（kon) 和解离速率（koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数（KD)。参见例如Chenetal.，J MolBiol293,865-881(1999)。或者，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系，诸如表达 FcyIlia受体的NK细胞来评估抗体对Fc受体的结合亲和力。
[0102] 在一个实施方案中，修饰包含一处或多处降低免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和 力的氨基酸突变。在一个实施方案中，氨基酸突变为氨基酸替代。典型的，两条免疫球蛋白 重链每一条中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将 免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍、或至少10倍。在存在多于一 处降低免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变 的组合可将免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍、或甚至至少50 倍。在一个实施方案中，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，所述免疫球蛋白分子 展现少于20%、特别是少于10%、更特别是少于5%的对Fc受体的结合亲和力。
[0103] 在一个实施方案中，所述Fc受体为激活性Fc受体。在一个具体实施方案中，所述 Fc受体选自下组：FcYRIIIa(CD16a)，FcyRI(CD64)，FcyRIIa(CD32)和FcaRI(CD89)。 在一个具体实施方案中，Fc受体为FcY受体，更具体是FcyRIIIa、FcyRI或FcyRlla受 体。优选地，对这些受体每一种的结合亲和力是降低的。在一个甚至更加具体实施方案中， 所述Fc受体为FcYIlia，特别是人FcYIlia。在一些实施方案中，对补体构件的结合亲和 力，具体是对Clq的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿Fc受体（FcRn) 的结合亲和力没有降低。当免疫球蛋白分子展现未修饰形式的免疫球蛋白分子对FcRn的 结合亲和力的大于约70%时，实现实质性相似的对FcRn的结合，即保留免疫球蛋白分子对 所述受体的结合亲和力。本发明的融合蛋白中包含的免疫球蛋白分子可展现大于约80%和 甚至大于约90 %的此类亲和力。
[0104] 在一个实施方案中，所述降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力的修饰在 免疫球蛋白分子的Fc区中，特别是CH2区。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子在免 疫球蛋白重链第329位（EU编号方式）包含氨基酸替代。在一个更加特定实施方案中，所 述氨基酸替代为P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子 在免疫球蛋白重链第234位和第235位（EU编号方式）包含氨基酸替代。在一个具体实 施方案中，所述氨基酸替代为L234A和L235A(LALA)。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白 分子包含抗体重链第329位（EU编号方式）处的氨基酸替代和选自免疫球蛋白重链位置 228, 233, 234, 235, 297和331的位置处的别的氨基酸替代。在一个更加特定实施方案中， 别的氨基酸替代为S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在一个特 定实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含免疫球蛋白重链第P329位、第L234位和第L235 位（EU编号方式）处的氨基酸替代。在一个更加特定实施方案中，所述免疫球蛋白分子包 含免疫球蛋白重链中的氨基酸替代L234A、L235A和P329G(LALAP329G)。这种氨基酸替代 组合特别有效地消除人IgG类免疫球蛋白的FcY受体结合，如记载于PCT公开文本No.TO 2012/130831，通过述及完整收入本文。PCT公开文本No.WO2012/130831还记载了制备此 类经修饰免疫球蛋白的方法和用于测定其特性（诸如Fc受体结合或效应器功能）的方法。
[0105] 在免疫球蛋白重链中包含修饰的免疫球蛋白可以使用本领域公知的遗传或化学 方法通过氨基酸删除、替代、插入或修饰来制备。遗传方法可包括编码DNA序列的定点诱 变、PCR、基因合成、等等。可通过例如测序来验证正确核苷酸变化。
[0106] 包含降低Fc受体结合的修饰的免疫球蛋白或抗体一般具有与相应未修饰免疫 球蛋白或抗体相比降低的效应器功能，特别是降低的ADCC。因而，在一个实施方案中，所 述降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力的修饰降低免疫球蛋白分子的效应器功 能。在一个具体实施方案中，所述效应器功能为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)。 在一个实施方案中，ADCC降低至由没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子诱导的ADCC的 少于20%。免疫球蛋白或抗体的效应器功能可通过本领域已知方法来测量。评估感兴 趣分子的ADCC活性的体外测定法的例子记载于美国专利No. 5, 500, 362 ;HellStr〇met al.ProcNatlAcadSciUSA83,7059-7063(1986)和Hellstrometal.，ProcNatl AcadSciUSA82, 1499-1502(1985);美国专利No. 5, 821，337;Bruggemannetal.，J ExpMed166,1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定法方法（参见例如用于流 式细胞术的ACTI?非放射性细胞毒性测定法（CellTechnology，Inc.，MountainView， CA);和CytoTox96?非放射性细胞毒性测定法（Promega，Madison,WI))。对于此类测 定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞（PBMC)和天然杀伤（NK)细胞。或者/另 夕卜，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clyneset al.，ProcNatlAcadSciUSA95,652-656(1998)。在一些实施方案中，免疫球蛋白分子 对补体构件（具体是Clq)的结合也是降低的。因而，补体依赖性细胞毒性（CDC)也可以 是降低的。可进行Clq结合测定法以测定免疫球蛋白是否能够结合Clq并因而具有CDC 活性。参见例如W0 2006/029879和W0 2005/100402中的Clq和C3c结合ELISA。为 了评估补体激活，可实施⑶C测定法（参见例如Gazzano-Santoroetal.，JImmunol Methods202,163(1996);Craggetal.，Blood101,1045-1052(2003);和Craggand Glennie,Blood103, 2738-2743 (2004))。
[0107]在本文上文和PCT公开文本No.W0 2012/130831所述免疫球蛋白分子之外，Fc受 体结合和/或效应器功能降低的免疫球蛋白还包括那些替代Fc区残基238、265、269、270、 297、327和329中一个或多个的（美国专利No. 6, 737, 056)。此类Fc突变体包括在氨基酸 第265位、第269位、第270位、第297位和第327位中两个或更多个处具有替代的Fc突 变体，包括具有残基265和297变成丙氨酸的替代的所谓的"DANA"Fc突变体（美国专利 No. 7, 332, 581)。
[0108] 1§64亚类免疫球蛋白展现与IgG:免疫球蛋白相比降低的对Fc受体的结合亲和力 和降低的效应器功能。因而，在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中包含的所述免疫球蛋 白分子为IgG4M类免疫球蛋白，特别是人IgG4M类免疫球蛋白。在一个实施方案中，所述 IgG4亚类免疫球蛋白在Fc区中在位置S228处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P。 为了进一步降低它对Fc受体的结合亲和力和/或它的效应器功能，在一个实施方案中，所 述以匕亚类免疫球蛋白在位置L235处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替代L235E。在另一 个实施方案中，所述以64亚类免疫球蛋白在位置P329处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替 代P329G。在一个特定实施方案中，所述IgG4亚类免疫球蛋白在第S228位、第L235位和第 P329位处包含氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P、L235E和P329G。此类经修饰1864亚 类免疫球蛋白及其Fcy受体结合特性记载于PCT公开文本No.W0 2012/130831，通过述及 完整收入本文。
[0109] 在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子能够特异性结合抗原。在一个实施方案 中，所述免疫球蛋白分子是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子不能够特 异性结合抗原，特别是不能够特异性结合人抗原。此类免疫球蛋白分子对抗原的特异性结 合的缺失（即能与非特异性相互作用区分开的任何结合的缺失）可例如通过ELISA或表面 等离振子共振来测定，如本文中描述的。此类免疫球蛋白分子例如对于延长融合蛋白的血 清半衰期是特别有用的，其中不想要靶向特定组织。
[0110] 在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含基于人Vh3-23种系序列的重链可 变区序列。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含与SEQIDN0 :9的序列至少 95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列。在一个实施方案中，所述免疫 球蛋白分子包含基于人Vk3-20种系序列的轻链可变区序列。在一个具体实施方案中，所述 免疫球蛋白分子包含与SEQIDN0:11的序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相 同的轻链可变区序列。在一个甚至更加具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含重链可 变区序列SEQIDN0 :9和轻链可变区序列SEQIDN0 :11。包含这些可变区序列的免疫球 蛋白分子不能够特异性结合抗原，特别是人抗原。它们缺乏对正常组织以及PBMC的结合， 没有多反应性且通过成像不显示非特异性体内积累（数据未显示）。可变区序列完全基于 人种系序列，重链CDR3除外，其中引入GSG序列以生成非结合性免疫球蛋白。
[0111] 在一个实施方案中，所述IL-2分子为野生型IL-2分子。在一个实施方案中，所述 IL-2分子为人IL-2分子。在一个具体实施方案中，所述IL-2分子包含序列SEQIDN0: 1 (天然人IL-2)。
[0112] 在一个实施方案中，所述IL-2分子在与人IL-2残基125对应的位置处包含氨基 酸替代。在一个实施方案中，所述氨基酸替代为C125A。在一个具体实施方案中，所述IL-2 分子包含序列SEQIDN0 :3(具有氨基酸替代C125A的人IL-2)。或者，位置125处的半胱 氨酸可以用另一种中性氨基酸替换，诸如丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，分别生成C125SIL-2、 C125TIL-2或C125VIL-2,如记载于美国专利No. 4,518,584。如其中记载的，还可以删除IL-2的N末端丙氨酸残基，生成诸如des-AlC125S或des-AlC125A等突变体。或者/另外， IL-2分子可包括野生型人IL-2位置104处正常存在的甲硫氨酸用中性氨基酸诸如丙氨酸 替换的突变（参见美国专利No. 5, 206, 344)。人IL-2中的此类修饰可提供别的优点，诸如 表达或稳定性升高。
[0113] 本发明的融合蛋白中包含的IL-2分子也可以是未糖基化的IL-2分子。例如，在 哺乳动物细胞诸如CH0或HEK细胞中表达融合蛋白时，消除IL-2分子的0糖基化位点导致 更加均质的产物。如此，在某些实施方案中，IL-2分子包含消除IL-2中在与人IL-2残基 3对应的位置处的0糖基化位点的修饰。在一个实施方案中，所述消除IL-2中在与人IL-2 残基3对应的位置处的0糖基化位点的修饰为氨基酸替代。例示性氨基酸替代包括T3A、 T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K、和T3P。在一个具体实施方案中，所述修饰为氨基酸替代 T3A。
[0114] 在一个实施方案中，于25°C通过SPR测量时，融合蛋白能够以小于10nM、特别是 小于3nM的亲和常数（KD)结合IL-20Y受体。在一个具体实施方案中，所述IL-20Y受 体为人IL-2 0Y受体。在一个实施方案中，于25°C通过SPR测量时，融合蛋白能够以小于 100nM、特别是小于20nM的亲和常数（KD)结合IL-2a受体。在一个具体实施方案中，所 述IL_2a受体为人IL_2a受体。本文中描述了一种通过SPR测量对IL-20Y或IL_2a 受体的结合亲和力的方法。依照一个实施方案，于25°C用在CM5芯片上固定化的IL-2受 体使用BIACORE?T100仪器（GEHealthcare)通过表面等离振子共振测量结合亲和 力（KD)。简言之，用盐酸N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺（EDC)和N-羟基 琥珀酰亚胺（NHS)依照供应商的用法说明书活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片（CM5， GEHealthcare)。用10mM乙酸钠pH5. 5将重组IL-2受体稀释至0.5-30iig/ml，之后以 10iil/min流速注射以实现大约200-1000 (对于IL-2Ra)或500-3000 (对于IL-2R3Y 异二聚体）个响应单位（RU)的偶联蛋白质。注射IL-2受体后，注射1M乙醇胺以封闭未反 应的基团。为了动力学测量，于25°C以大约30iU/min的流速注射融合蛋白在HBS-EP+(GE Healthcare，10mMHEPES，150mMNaCl，3mMEDTA，0.05%表面活性剂P20，pH7.4)中的 3 倍 连续稀释液（范围介于约3nM至300nM之间）。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单一 对一朗格缪尔（Langmuir)结合模型（BIACORE?TIOOEvaluationSoftwareversion 1. 1. 1)计算结合速率（km)和解离速率（kj。以比率计算平衡解离常数（KD)。参 见例如Chenetal.，JMolBiol293,865-881(1999)。
[0115] 在一个特定方面，本发明提供一种融合蛋白，其包含（i)在免疫球蛋白重链中包 含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号方式）的IgGi亚类免疫球蛋白分子，和（ii) 两个白介素-2 (IL-2)分子，每一个在它的N末端氨基酸处经由肽接头融合至免疫球蛋白重 链之一的C末端氨基酸。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子和所述IL-2分子是人 的。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含重链可变区序列SEQIDN0 :9和轻 链可变区序列SEQIDN0 :11。在又一个特定实施方案中，所述IL-2分子每一个包含氨基 酸序列SEQIDN0 :3。在一个甚至更加具体实施方案中，所述融合蛋白包含与序列SEQID 吣：17至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列，和与 序列SEQIDN0:19 至少约 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多 肽序列。
[0116] 如实施例中显示的，本发明的融合蛋白可以用于选择性激活调节性T细胞（即基 本上没有伴随的其它T细胞子集和/或NK细胞激活）。如此，本发明特别提供融合蛋白，其 用于在体外或在体内选择性激活调节性T细胞。在一个实施方案中，所述使用包括在体外 或在体内将调节性T细胞与所述融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述使用进一步包括 将其它（非调节性）T细胞与所述融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述使用在体外且所 述融合蛋白以约Ing/mL或更少、特别是约0.Ing/mL或更少的浓度使用。在另一个实施方 案中，所述使用在体内且所述融合蛋白以约20iig/kg体重或更少、特别是约12iig/kg体重 或更少、更特别是约6yg/kg体重或更少的剂量使用（其中"体重"指接受融合蛋白施用的 个体的体重）。
[0117] 本发明还提供一种用于在体外或在体内选择性激活调节性T细胞的方法，其包括 使所述调节性T细胞与本发明的融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述方法进一步包括 使其它（非调节性）T细胞与所述融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述激活包含诱导增 殖和/或诱导IL-2受体信号传导。在一个实施方案中，所述方法在体外且所述融合蛋白以 约Ing/mL或更少、特别是约0.Ing/mL或更少的浓度使用。在另一个实施方案中，所述方法 在体内且所述融合蛋白以约20yg/kg体重或更少、特别是约12yg/kg体重或更少、更特别 是约6yg/kg体重或更少的剂量使用（其中"体重"指接受融合蛋白施用的个体的体重）。
[0118] 依照在先段落中描述的用途或方法的某些实施方案，所述激活包含诱导调节性T细胞增殖和/或在调节性T细胞中诱导IL-2受体信号传导。诱导增殖可通过例如检测胞 内增殖标志物Ki-67来测量，如实施例中描述的。在一个实施方案中，由本发明的融合蛋白 激活的调节性T细胞增殖与非激活的调节性T细胞的增殖相比升高至少约1. 5倍、至少约2 倍、或至少约3倍。在一个实施方案中，与本发明的融合蛋白接触的其它（非调节性）T细胞 和/或NK细胞的增殖与未与所述融合蛋白接触的相应细胞的增殖相比升高少于约1. 5倍、 少于约1. 2倍、或少于约1. 1倍。诱导IL-2受体信号传导可通过例如检测磷酸化STAT5来 测量，如实施例中描述的。在一个实施方案中，由本发明的融合蛋白激活的调节性T细胞中 IL-2受体信号传导与非激活的调节性T细胞中的IL-2受体信号传导相比升高至少约1. 5 倍、至少约2倍、至少约3倍、或至少约5倍。在一个实施方案中，与本发明的融合蛋白接触 的其它（非调节性）T细胞和/或NK细胞中的IL-2受体信号传导与未与所述融合蛋白接 触的相应细胞中的IL-2受体信号传导相比升高少于约1. 5倍、或少于约1. 2倍、或少于约 1. 1 倍。
[0119] 多核苷酸
[0120] 本发明还提供多核苷酸，其编码如本文中描述的融合物或其片段。
[0121] 本发明的多核苷酸包括那些与以下所列序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%或 100%相同的多核苷酸：SEQIDN0 2、4、5、6、7、10、12、18 和 20,包括其 功能性片段或变体。
[0122] 可以将编码本发明的融合蛋白的多核苷酸以编码完整融合蛋白的单一多核苷酸 表达，或以共表达的多个（例如两个或更多个）多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码 的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性融合蛋白。例如，免疫球蛋白的 轻链部分可与免疫球蛋白的重链部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与 轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。
[0123] 在一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋 白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQIDN0 9或11所示的可变区序 列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白和两个IL-2分子的融合蛋白 或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQIDN0 17或19所示的多肽序列 的序列。在另一个实施方案中，本发明进一步涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子 的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQIDN0 2、4、5、6、7、10、12、 18或20所示的核酸序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序 列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或 其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDN0 2、4、5、6、7、10、12、18或20所示的 核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合 蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQIDN0 9或11的氨基酸序列 至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的可变区序列的序列。在另一 个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核 苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQIDN0 17或19的氨基酸序列至少约80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多肽序列的序列。本发明涵盖编码免疫球蛋白和 两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQIDN0 9 或11的可变区序列及保守氨基酸替代的序列。本发明还涵盖编码免疫球蛋白和两个IL-2 分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQIDNO17或19的 多肽序列及保守氨基酸替代的序列。
[0124] 在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中，本发明的多 核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
[0125] 重组方法
[0126] 可以例如通过固相肽合成（例如Merrifield固相合成）或重组生成来获得本 发明的融合蛋白。对于重组生成，分离一种或多种编码所述融合蛋白（片段）的多核苷 酸（例如如上文描述的），并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆 和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序这类多核苷酸。在一个实施方案中，提供 包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体（优选为表达载体）。可以使用本领域技术人 员公知的方法来构建含有融合蛋白（片段）的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号 的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见 例如记载于Maniatisetal.，MOLECULARCL0NING:ALABORATORYMANUAL,ColdSpring HarborLaboratory,N.Y. (1989);及Ausubeletal.，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULAR BIOLOGY,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，N.Y(1989)的技术。 表达载体可以是质粒、病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中在与启 动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中克隆编码融合蛋白（片段）的多核 苷酸（即编码区）。如本文中使用的，"编码区"是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的 一部分。尽管"终止密码子"（TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一 部分（若存在的话），但任何侧翼序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、 5'和3'非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷 酸构建体中（例如单一载体上），或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的（不同 的）载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发 明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋 白质。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的融合 蛋白（片段）或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊 化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多 种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下 时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且如果 两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物表达的能力或不干 扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段（如多肽编码区和与其联合的启动子）为"可操 作联合的"。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该 核酸可操作联合。所述启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导DNA 的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子、操纵基因、阻遏物和转录终 止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和 其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动 物细胞中发挥功能的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段（例 如立即早期启动子，与内含子-A联合）、猿病毒40(例如早期启动子）和逆转录病毒（如 例如劳斯（Rous)肉瘤病毒）。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休 克蛋白、牛生长激素和家兔0球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序 列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子（例如四 环素诱导型启动子）。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括 但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件（具体地， 内部核糖体进入位点或IRES，亦称为CITE序列）。表达盒还可以包含其它特征，如复制起 点和/或染色体整合元件，如逆转录病毒长末端重复（LTR)或腺伴随病毒（AAV)反向末端 重复（ITR)。
[0127] 本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合， 所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌所述 融合物，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明融合蛋白或其片段的核酸上游。 依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生 长的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。 本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号 肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌性或"成熟"形式的多肽。在某些实施方案中，使用 天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合 的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生 物。例如，可以将野生型前导序列用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（TPA)或小鼠葡 糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。例示性分泌性信号肽的氨基酸和核苷酸序列在SEQIDN0 39_47显不。
[0128] 可以将编码能用于促进后期纯化（例如组氨酸标签）或辅助标记融合蛋白的短蛋 白序列的DNA纳入融合蛋白（片段）编码多核苷酸内或其末端。
[0129] 在一个别的实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在 某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以 单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个这类实 施方案中，宿主细胞包含载体（例如已用该载体转化或转染），所述载体包含编码本发明 融合蛋白（的部分）的多核苷酸。如本文中使用的，术语"宿主细胞"指任何能工程化以 生成本发明的融合蛋白或其片段的细胞系统种类。适用于复制并支持融合蛋白表达的宿 主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导这类细胞，并且可 以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的融合蛋白用于临 床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢 细胞（CH0)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，尤其在不需要糖基化时。在表 达后，可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物 夕卜，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码多肽的载体的克隆或表达宿主，包括其糖 基化途径已被"人源化"，导致生成具有部分或完全人的糖基化模式的多肽的真菌和酵母 菌株。参见Gerngross,NatBiotech22, 1409-1414 (2004)，和Lietal.，NatBiotech 24,210-215(2006)。适用于表达（糖基化）多肽的宿主细胞还自多细胞生物体（无脊椎动 物和脊椎动物）衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细 胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda)细 胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No. 5, 959, 177, 6, 040, 498, 6, 4 20, 548, 7, 125, 978和6, 417, 429 (描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIB0DIES?技 术）。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以 是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系（C0S-7); 人胚肾系（293 或 293T细胞，如例如记载于Grahametal.，JGenVirol36,59(1977))、 幼仓鼠肾细胞（BHK)、小鼠塞托利（sertoli)细胞（TM4细胞，如例如记载于Mather,Biol R印rod23,243-251(1980)的）、猴肾细胞（CV1)、非洲绿猴肾细胞（VER0-76)、人宫颈癌 细胞（HELA)、猕猴肾细胞（MDCK)，牛鼠肝细胞（BRL3A)、人肺细胞（W138)、人肝细胞〇fep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞（MMT060562)、TRI细胞（如例如记载于Matheretal.，Annals N.Y.AcadSci383,44-68(1982)的）、MRC5细胞和FS4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细 胞系包括中国仓鼠卵巢（CH0)细胞，包括dhfrTHO细胞（Urlaubetal.，ProcNatlAcad SciUSA77,4216(1980));和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋 白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如YazakiandWu,MethodsinMolecular Biology,Vol. 248 (B.K.C.Lo,ed.，HumanaPress,Totowa,NJ)，pp. 255-268 (2003)。宿主细 胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等， 但还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施 方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢（CH0)细胞、人胚肾 (HEK)细胞或淋巴样细胞（例如Y0、NS0、Sp20细胞）。
[0130] 本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含免疫球蛋 白的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一免疫球蛋白链，从而使得表达 的产物是具有重链和轻链两者的免疫球蛋白。
[0131] 在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的融合蛋白的方法，其中所述方法包 括在适合于所述融合蛋白表达的条件下培养包含编码融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞 (如本文中提供的），并从宿主细胞（或宿主细胞培养基）回收所述融合蛋白。
[0132] 在本发明的融合蛋白中，各组分（免疫球蛋白分子和IL-2分子）彼此遗传融合。 融合蛋白可设计为使其组分直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知 的方法测定接头的组成和长度，并可以测试功效。还包含另外的序列以纳入切割位点来分 开融合蛋白的各个组分（若期望的话），例如内肽酶识别序列。
[0133] 在某些实施方案中，本发明的融合蛋白至少包含能结合抗原的免疫球蛋白可变 区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分和自其衍生。生成多克隆 抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的（参见例如HarlowandLane, "Antibodies,a laboratorymanual",ColdSpringHarborLaboratory, 1988)。非天然存在的抗体可以使 用固相肽合成构建生成，可以重组生成（例如如记载于美国专利No. 4, 186, 567的）或可 通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得（参见例如McCafferty的美国专利 No. 5, 969, 108)。
[0134] 可以将任何动物物种的免疫球蛋白用于本发明。可用于本发明的非限制性免疫 球蛋白可以是鼠、灵长类或人起源的。如果融合蛋白意图供人使用，那么可以使用嵌合形 式的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制 备人源化或全人形式的免疫球蛋白（参见例如Winter的美国专利No. 5, 565, 332)。人源 化可以通过各种方法实现，包括但不限于（a)将非人（例如供体抗体）CDR嫁接到人（例 如受体抗体）框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基（例如那些对于保留较好 的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基），（b)仅将非人特异性决定区（SDR或a-CDR; 对于抗体-抗原相互作用关键的残基）嫁接到人框架和恒定区上，或（c)移植完整的非 人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来"掩饰（cloak)"它们。人源化的抗体及其 制备方法综述于例如AlmagroandFransson,FrontBiosci13, 1619-1633 (2008)，并且 还记载于例如Riechmannetal.，Nature332,323-329(1988);Queenetal.，ProcNatl AcadSciUSA86,10029-10033(1989);美国专利No. 5, 821，337, 7, 527, 791，6, 982, 321 和 7, 087, 409 ；Jonesetal.,Nature321,522-525(1986)；Morrisonetal.,ProcNatlAcad Sci81,6851-6855(1984)；Morrisonand0i,AdvImmunol44,65-92(1988)；Verhoeyen etal.，Science239，1534-1536 (1988) ;Padlan,MolecImmun31(3)，169-217(1994); Kashmirietal.，Methods36, 25-34 (2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接）；Padlan,Mol Immunol28, 489-498 (1991)(描述"表面重建"）；Dall'Acquaetal. ,Methods 36, 43-60(2005)(描述"FR改组"）；及Osbournetal.,Methods36, 61-68(2005)及Klimka etal.，BrJCancer83, 252-260 (2000)(描述了FR改组的"引导选择"办法）。依照本 发明的特定免疫球蛋白为人免疫球蛋白。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗 体和人可变区。人抗体一般记载于vanDijkandvandeWinkel,CurrOpinPharmacol 5, 368-74 (2001)及Lonberg，CurrOpinImmunol20,450-459(2008)。人可变区能形成通 过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分和自其衍生（参见例如MonoclonalAntibody ProductionTechniquesandApplications,pp. 51-63(MarcelDekker,Inc.,New York, 1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转 基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体 (参见例如Lonberg，NatBiotech23,1117-1125(2005)。还可以通过分离选自人衍生 的噬菌体展示库的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区（参见例如Hoogenboom etal.inMethodsinMolecularBiology178, 1-37 (O'Brienetal. ,ed. ,Human Press，Totowa，NJ, 2001);及McCaffertyetal.，Nature348,552_554;Clacksonet al.，Nature352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或 作为Fab片段。
[0135] 在某些实施方案中，将本发明的融合蛋白中包含的免疫球蛋白改造为具有增强 的结合亲和力，其依照例如公开于PCT公开文本W0 2012/020006 (参见涉及亲和力成熟 的实施例）或美国专利申请公开文本No. 2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提 述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法（ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技 术来测量本发明的融合蛋白结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离 振子共振技术（Liljeblad，etal.，GlycoJ17,323-329(2000))和传统的结合测定法 (Heeley，End〇CrRes28,217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞 争对特定抗原的结合的抗体。在某些实施方案中，这类竞争性抗体结合由参照抗体结合 的相同表位（例如线性或构象性表位）。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法 在Morris(1996)"EpitopeMappingProtocols，'，inMethodsinMolecularBiology vol. 66(HumanaPress,Totowa，NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗 原在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一标记抗体和测试其与第一抗体竞争对抗 原的结合的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化 的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一 抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标 记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降 低，那么这指示第二抗体在与第一抗体竞争对抗原的结合。参见HarlowandLane(1988) Antibodies:ALaboratoryManualch. 14(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpring Harbor,NY)〇
[0136] 可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的融合蛋白，所述技 术如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。用于纯化具体蛋 白质的实际条件将部分取决于因素，如净电荷、疏水性、亲水性等，而且对于本领域中的技 术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，能使用融合蛋白结合的抗体、配体、受体或抗原。 例如，对于本发明的融合蛋白的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以 使用连续的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离融合蛋白，基本如实施例中描述的。 可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定融合蛋白的纯度，包括凝胶电泳、高压液 相层析等。例如，如实施例中所描述的那样表达的融合蛋白显示为完整且正确装配的，如通 过还原性和非还原性SDS-PAGE证明的（见例如图2)。
[0137] 组合物、配制剂和施用路径
[0138] 在一个别的方面，本发明提供包含本文中提供的任何融合蛋白的药物组合物，例 如用于下述任何治疗方法。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任何融合蛋 白以及药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任何融合蛋 白及至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。
[0139]还提供以适于体内施用的形式生成本发明的融合蛋白的方法，所述方法包括（a) 获得依照本发明的融合蛋白，并（b)将所述融合蛋白与至少一种药学可接受载体配制在一 起，由此配制成用于体内施用的融合蛋白制剂。
[0140]本发明的药物组合物包含治疗有效量的在药学可接受载体中溶解或分散的一种 或多种融合蛋白。短语"药学或药理学可接受的"指在所采用的剂量和浓度一般对接受者 无毒性，即在适当时对动物如例如人施用时不产生不利、变应性或其它不当反应的分子实 体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种融合蛋白以及任选地另外的活性成分的药物 组合物将是本领域技术人员已知的，如由Remington'sPharmaceuticalSciences, 18th Ed.MackPrintingCompany, 1990例示的，其通过提述并入本文。此外，对于动物（例如人） 施用，会理解制剂应当满足FDA生物标准部门（FDAOfficeofBiologicalStandards) 或其它国家的相应机构要求的无菌性、热原性（pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。 优选的组合物是冻干配制剂或水性溶液。如本文中使用的，"药学可接受载体"包括任何 和所有的溶剂、缓冲剂、分散介质、涂料材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂（例如抗细菌 齐U、抗真菌剂）、等张剂、吸收延缓剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚 合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂（disintegrationagent)、润滑剂、甜味剂、芳香剂、染 料、这类类似的材料及其组合，如本领域普通技术人员将已知的（参见例如Remington's PharmaceuticalSciences，18thEd.MackPrintingCompany, 1990,pp. 1289-1329,通过提 述并入本文）。除非任何常规载体与活性成分不相容，涵盖其在治疗或药物组合物中的使 用。
[0141] 所述组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其要以固体、液体还是气雾剂形 式施用，以及其对于这类施用路径如注射是否需要是无菌的。可以静脉内、皮内、动脉内、 腹膜内、损伤内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道 内、直肠内、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊泡内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、表 面（topically)、局部（locally)、通过吸入（例如气雾剂吸入）、注射、输注、连续输注、直 接浸洗靶细胞的局部灌注、经由导管、经由灌洗、以乳剂、以液体组合物（例如脂质体）、或 通过其它方法或前述项的任意组合施用本发明的融合蛋白（以及任何另外的治疗剂），如 本领域中普通技术人员会知晓的（参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences, 18th Ed.MackPrintingCompany, 1990,通过提述并入本文）。胃肠外施用，特别是静脉内注射， 最常用于施用多肽分子如本发明的融合蛋白。
[0142] 胃肠外组合物包括那些设计用于通过注射施用，例如皮下、皮内、损伤内、静脉内、 动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的组合物。对于注射，可以将本发明的融合蛋白在水 性溶液，优选地在生理学相容的缓冲液中配制，所述生理学相容的缓冲液如汉克（Hanks) 氏溶液、林格（Ringer)氏溶液或生理学盐水缓冲液。溶液可以含有配制剂如悬浮剂、稳定 剂和/或分散剂。或者，融合蛋白可以为粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无 菌无热原水构成。根据需要，通过将本发明的融合蛋白以需要的量掺入到具有下文列举的 各种其它成分的合适溶剂中来制备无菌可注射溶液。可以容易地实现无菌，例如通过过滤 流过无菌过滤膜进行。一般地，通过将各种无菌活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散 齐U，所述无菌媒介物含有基础分散介质和/或其它成分。在制备无菌可注射溶液、悬液或 乳剂的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥或冻冻干燥技术，其将活性成分以 及任何另外的期望成分的粉末从其先前无菌过滤的液体介质产生。液体介质在必要时应 当是适当缓冲的，并且在用充足的盐水或葡萄糖注射前首先使液体稀释液等张。组合物在 制备和贮存条件下必须是稳定的，并且针对微生物如细菌和真菌的污染作用提供保护。会 领会的是，应当将内毒素污染最少保持于安全水平，例如低于〇.5ng/mg蛋白质。合适的药 学可接受载体包括但不限于：缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血 酸和甲硫氨酸；防腐剂（如十八烧基二甲基节基氯化铵；氯化六甲双铵（hexamethonium chloride);氯化苯甲煙铵(benzalkoniumchloride);氯化节乙铵(benzethonium chloride);酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸 丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（低于约10个残基）多 肽；蛋白质，如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸 如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物， 包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA;糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐 的反荷离子如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白复合物）；和/或非离子型表面活性剂如聚乙 二醇（PEG)。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的化合物，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、 葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓 缩的溶液的试剂。另外，可以将活性化合物的悬液制备为合适的油性注射悬液。合适的亲 脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯，如乙基cleats或甘油三酯或脂 质体。
[0143] 可以将活性成分在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微囊剂，例 如羟甲基纤维素或明胶微囊剂和聚_(甲基丙烯酸酯）微囊剂中，在胶体药物投递系统（例 如脂质体、清蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）或在粗乳液（macroemulsion)中包 载° 这类技术披露于Remington'sPharmaceuticalSciences(18thEd.MackPrinting Company，1990)。可以制备持续释放的制剂。合适的持续释放制剂的例子包括含多肽的固 体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品例如膜或微囊剂的形式。在具体的实施 方案中，可以通过在组合物中使用吸收延迟剂如例如单硬脂酸铝、明胶或其组合，来产生可 注射组合物的延长吸收。
[0144] 在先前描述的组合物外，融合蛋白还可以配制为贮存（cbpot)制剂。可以通过植 入（例如皮下或肌内）或通过肌内注射来施用这类长效配制剂。如此，例如所述融合蛋白 可以用合适的聚合或疏水性材料（例如作为可接受油中的乳剂）或离子交换树脂配制，或 配制为微溶性衍生物，例如微溶性盐。
[0145] 可以通过常规的混合、溶解、乳化、包囊、包载或冻干过程来制备包含本发明的融 合蛋白的药物组合物。可以以常规方式配制药物组合物，其使用一种或多种有助于将蛋白 质加工成可药学使用的制剂的生理学可接受载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂。合适的配制剂 依赖于选择的施用路径。
[0146] 可以将融合蛋白以游离酸或碱、中性或盐形式配制成组合物。药学可接受盐是基 本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐（acidadditionsalt)，例如与 蛋白质性组合物的游离氨基基团形成的那些，或与无机酸（如例如氢氯酸或磷酸）或与有 机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱如例 如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁；或有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因（procaine)衍 生。药用盐倾向于比相应的游离碱形式更可溶于水性溶剂和其它质子溶剂中。
[0147] 治疗方法和组合物
[0148] 可以将本文中提供的任一种融合蛋白用在治疗方法中。
[0149] 对于在治疗方法中的使用，将以与优良医学实践一致的方式配制、给药和施用本 发明的融合蛋白。在此背景中考虑的因素包括治疗的特定病症、治疗的特定哺乳动物、个体 患者的临床状况、病症的起因、药剂的投递部位、施用方法、施用时间安排以及医学从业人 员已知的其它因素。
[0150] 在一个方面，提供用作药物的本发明的融合蛋白。在别的方面，提供用于治疗疾病 的本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的本发明的融合蛋白。在一 个实施方案中，本发明提供如本文中描述的融合蛋白，用于治疗有此需要的个体中的疾病。 在某些实施方案中，本发明提供融合蛋白，用于治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括 对所述个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些实施方案中，待治疗的疾病是自身免疫疾 病。例示性自身免疫疾病包括1型糖尿病、银屑病、哮喘、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、系 统性红斑狼疮（SLE)和多发性硬化症。在一个实施方案中，该疾病为移植排斥或移植物抗 宿主病。在一个特定实施方案中，该疾病选自下组：1型糖尿病，克罗恩氏病，SLE，和多发性 硬化症。在一个更加特定实施方案中，该疾病为1型糖尿病。在另一个特定实施方案中，该 疾病为多发性硬化症。在又一些实施方案中，该疾病为哮喘、肺纤维化或阻塞性肺病。在还 有又一些实施方案中，该疾病为心血管病，特别是动脉粥样硬化。在某些实施方案中，所述 方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如免疫抑制剂（如果 待治疗的疾病是自身免疫疾病的话）。依照上文任意实施方案的"个体"是哺乳动物，优选 是人。
[0151] 在一个别的方面，本发明提供本发明的融合蛋白在制造或制备药物中的用途，所 述药物用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病的 方法，该方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾 病是自身免疫疾病。在一个实施方案中，该疾病为移植排斥或移植物抗宿主病。在一个特 定实施方案中，该疾病选自下组：1型糖尿病，克罗恩氏病，SLE，和多发性硬化症。在一个更 加特定实施方案中，该疾病为1型糖尿病。在另一个特定实施方案中，该疾病为多发性硬化 症。在又一些实施方案中，该疾病为哮喘、肺纤维化或阻塞性肺病。在还有又一些实施方案 中，该疾病为心血管病，特别是动脉粥样硬化。在一个实施方案中，所述方法进一步包括对 个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如免疫抑制剂（如果待治疗的疾病是自 身免疫疾病的话）。依照上文任意实施方案的"个体"是哺乳动物，优选是人。
[0152] 在一个别的方面，本发明提供用于在个体中治疗疾病的方法，包括对所述个体施 用治疗有效量的本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，对所述个体施用组合物，其包含药 学可接受的形式的本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，待治疗的疾病是自身免疫疾病。 在一个实施方案中，该疾病为移植排斥或移植物抗宿主病。在一个特定实施方案中，该疾病 选自下组：1型糖尿病，克罗恩氏病，SLE，和多发性硬化症。在一个更加特定实施方案中，该 疾病为1型糖尿病。在另一个特定实施方案中，该疾病为多发性硬化症。在又一些实施方 案中，该疾病为哮喘、肺纤维化或阻塞性肺病。在还有又一些实施方案中，该疾病为心血管 病，特别是动脉粥样硬化。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量 的至少一种另外的治疗剂，例如免疫抑制剂（如果待治疗的疾病是自身免疫疾病的话）。依 照上文任意实施方案的"个体"是哺乳动物，优选是人。
[0153] 在一些实施方案中，对细胞施用有效量的本发明的融合蛋白。在其它实施方案中， 对个体施用治疗有效量的本发明的融合蛋白以治疗疾病。
[0154] 为了预防或治疗疾病，本发明的融合蛋白的合适剂量（当单独或与一种或多种其 它另外的治疗剂组合使用时）将取决于待治疗疾病的类型、施用路径、患者的体重、融合蛋 白的类型、疾病的严重程度和进程、施用融合蛋白是为了预防还是治疗目的、先前或同时的 治疗干预、患者的临床史和对融合蛋白的响应、以及主治医师的判断。负责施用的从业人员 将在任何事件中确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。本文中涵盖 各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用、推注施用、和脉冲输注。
[0155] 所述融合蛋白适宜地在一次或一系列治疗里对患者施用。根据疾病的类型和严重 程度，约1Ug/kg至15mg/kg(例如0?lmg/kg-10mg/kg)的融合蛋白可以是用于对患者施用 的起始候选剂量，不管是例如通过一次或多次分开的施用，还是通过连续输注进行。根据上 文提及的因素，一种典型的每日剂量的范围可以从约lug/kg至100mg/kg或更多。对于在 数天或更长里的重复施用，根据状况，治疗一般将持续直至发生对疾病症状的期望的抑制。 融合蛋白的一种例示性剂量将在约〇. 〇〇5mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它非限制性 例子中，剂量还可包括每次施用从约1Ug/kg体重、约5iig/kg体重、约10iig/kg体重、约 50yg/kg体重、约100yg/kg体重、约200yg/kg体重、约350yg/kg体重、约500yg/kg体 重、约lmg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约 200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及其中 可导出的任何范围。在从本文列出的数量可导出的范围的非限制性例子中，基于上文描述 的数目，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围，约5微克/kg体重至约500毫 克/kg体重的范围等。如此，可以对患者施用一剂或多剂的约0. 5mg/kg、2. 0mg/kg、5.Omg/ kg或10mg/kg(或其任意组合）。可以间歇地施用这类剂量，例如每周或每3周（例如使得 患者接受约2至约20、或例如约6剂的融合蛋白）。可以施用起始较高的加载剂量，继之以 一剂或多剂较低剂量。然而，可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法容易监测该 疗法的进行。
[0156] 本发明的融合蛋白一般将以对于实现意图的目的有效的量使用。对于治疗或预防 疾病状况的用途，以治疗有效量施用或应用本发明的融合蛋白、或其药物组合物。治疗有效 量的确定完全在本领域技术人员的能力以内，尤其根据本文中提供的详细公开内容。
[0157] 对于系统性施用，能从体外测定法如细胞培养测定法初步估算出治疗有效剂量。 然后可以在动物模型中配制剂量以达到包含如在细胞培养中测定的IC5(I的循环浓度范围。 可以将此类信息用于更准确地确定人中的可用剂量。
[0158] 使用本领域中公知的技术，还能从体外数据例如动物模型估算出初始剂量。本领 域中的普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。
[0159] 可以分别调整剂量量和时间间隔以提供足以维持治疗效果的融合蛋白的血浆水 平。通过注射施用的通常患者剂量的范围为从约0. 1至50mg/kg/天，通常约0. 5至lmg/ kg/天。可以通过每日施用多剂实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中 的水平。
[0160] 在局部施用或选择性摄取的情况中，融合蛋白的有效局部浓度可能与血浆浓度无 关。本领域技术人员会能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
[0161] 本文中描述的融合蛋白的治疗有效剂量一般将提供治疗益处，而不导致实质性 毒性。可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来测定融合蛋白的毒性和治 疗功效。可以使用细胞培养测定法和动物研究来测定LD5(I(对50%的群体致命的剂量） 和ED5Q (在50%的群体中治疗有效的剂量）。毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指 数，其可以表达为LD5(I/ED5(I比。优选展现出较大治疗指数的融合蛋白。在一个实施方案 中，依照本发明的融合蛋白展现出高治疗指数。可以将从细胞培养测定法和动物研究获 得的数据用来制定适用于人的剂量范围。优选地，剂量处于具有很小或无毒性的循环浓 度（包含ED5(I)的范围内。剂量在此范围内可以随多种因素，例如采用的剂量形式、利用的 施用路径、受试者的状况等而变化。鉴于患者的状况，各个内科医生可以选择确切的配制 齐II、施用路径和剂量（参见例如Fingletal.，1975,in:ThePharmacologicalBasisof Therapeutics,Ch. 1，p. 1，通过提述完整并入本文）。
[0162] 用本发明的融合蛋白治疗的患者的主治内科医生将知晓如何及何时终止、中断或 调整施用（由于毒性、器官功能障碍等）。相反，如果临床应答不适当（排除毒性），主治内 科医生还将知晓如何将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中的施用剂量的量级 将随待治疗状况的严重程度、施用路径等而变化。可以例如部分地通过标准的预后评估方 法来评估状况的严重程度。另外，剂量以及可能的给药频率也将随个体患者的年龄、体重和 应答而变化。
[0163] 其它药剂和治疗
[0164] 本发明的融合蛋白可以与一种或多种其它药剂在疗法中组合施用。例如，本发明 的融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共施用。术语"治疗剂"涵盖施用以治疗需要此 类治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。这类另外的治疗剂可以包含任何适用于所治 疗的特定适应征的任何活性成分，优选地具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性成 分。在某些实施方案中，另外的治疗剂是免疫抑制剂。
[0165] 这类其它药剂以对意图目的有效的量适宜地组合存在。这类其它药剂的有效量取 决于使用的融合蛋白的量、病症或治疗的类型以及上文所述其它因素。所述融合蛋白一般 以与本文中描述的相同的剂量和施用路径、或以本文中描述的剂量的约1至99%、或通过 凭经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何路径使用。
[0166] 上文记载的这类组合疗法涵盖组合施用（其中在同一组合物或分别的组合物中 包含两种或更多种治疗剂）和分开施用，在该情况中，本发明的融合蛋白的施用可以在施 用另外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后发生。
[0167] 制品
[0168] 在本发明的另一个方面，提供含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症 的材料的制品。所述制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器 包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。所 述容器容纳组合物，其自身或与其它组合物组合对于治疗、预防和/或诊断状况是有效的， 并且可以具有无菌的存取口（例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的静脉内 溶液袋或管形瓶）。组合物中至少一种活性成分是本发明的融合蛋白。标签或包装插页指 示该组合物用于治疗选择的状况。此外，所述制品可以包含（a)其中含有组合物的第一容 器，其中所述组合物包含本发明的融合蛋白；和（b)其中含有组合物的第二容器，其中所述 组合物包含另外的治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品还可以包含包装插页，其指示 该组合物可用于治疗特定状况。或者/另外，所述制品还可以包含第二（或第三）容器，其 包含药学可接受缓冲液，如抑菌性注射用水（BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格（Ringer)氏溶 液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲 液、稀释剂、滤器、针、和注射器。 实施例
[0169] 以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解鉴于上文提供的一般性描述，可 以实践各种其他实施方案。
[0170] 重组DNA技术
[0171]使用标准方法操作DNA，如Sambrooketal.，Molecularcloning:Alaboratory manual;CoIdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989 中描述的。依照制造商的用法说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白的轻链和 重链核苷酸序列的一般信息参见：Kabat,E.A.etal.，（1991)SequencesofProteinsof ImmunologicalInterest,FifthEd. ,NIHPublicationNo91-3242。
[0172]DNA测序
[0173] 通过双链测序来测定DNA序列。
[0174] 基因合成
[0175] 在需要的情况下，期望的基因片段通过使用合适的模板进行PCR来生成或由 GeneartAG(Regensburg，Germany)通过自动化基因合成从合成的寡核苷酸和PCR产物合 成。在确切基因序列不可得的情况下，基于来自最近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并 通过RT-PCR从源自合适组织的RNA分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点 的基因区段克隆到标准的克隆/测序载体中。从经转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV分 光术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。基因片段设计为具有合 适的限制性位点以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计为具有编码前导肽 的5'端DNA序列，该前导肽在真核细胞中将蛋白质靶向分泌。SEQIDN0 39-47给出了例 示性前导肽和其编码多核苷酸序列。
[0176]IL-2RPY亚基-Fc融合物和IL-2Ra亚基Fc融合物的制备
[0177] 为了研究IL-2受体结合亲和力，生成了一种容许表达异二聚体IL-2受体 的工具。将IL-2受体的0亚基融合至使用"节入穴"技术（Merchantetal.，Nat Biotech. 16, 677-681 (1998))工程化改造成异二聚化的Fc分子（Fc(穴））（见SEQIDNO 21和22 (人），SEQIDNO27和28 (小鼠）和SEQIDNO33和34 (猕猴））。然后将IL-2受 体的Y亚基融合至与Fc(穴）异二聚化的Fc(节）变体（参见SEQIDN0 23和24 (人）， SEQIDN0 29和30 (小鼠）和SEQIDN0 35和36 (猕猴））。然后使用此异二聚体Fc-融合 蛋白作为底物来分析IL-2/IL-2受体相互作用。与AcTev切割位点和AviHis标签一起作 为单体链表达IL-2Ra亚基（SEQIDN0 25和26 (人），SEQIDN0 31和32 (小鼠）和SEQ IDN0 37和38(猕猴））。在HEKEBNA293细胞中瞬时表达各IL-2R亚基，IL-2RPY亚 基构建体有血清，而a亚基构建体没有血清。在蛋白A(GE Healthcare)上纯化IL-2R3Y亚基构建体，接着是大小排阻层析（GE Healthcare, Superdex200)。在NiNTA柱上经His 标签纯化IL-2Ra亚基（Qiagen)，接着是大小排阻层析（GE Healthcare, Superdex75)。 各种受体构建体的氨基酸和相应核苷酸序列显示于SEQIDNO21-38。
[0178] 融合蛋白的制备
[0179] 通过基因合成和/或经典分子生物学技术生成DNA序列，并亚克隆入哺乳动物表 达载体，在MPSV启动子控制下且在合成polyA位点上游，每一种载体均携带EBVOriP序 列。使用磷酸钙转染用哺乳动物表达载体共转染指数式生长中的J1EK293-EBNA细胞来生成 下文实施例中应用的融合蛋白。或者，通过聚乙烯亚胺（PEI)用各表达载体转染悬浮生长 中的HEK293细胞。或者，在无血清培养基中使用稳定转染的CH0细胞集合或CH0细胞克隆 进行生成。随后，自上清液纯化融合蛋白。简言之，用在20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7. 5 中平衡的蛋白A(HiTrapProtA，GEHealthcare)通过一个亲和步骤纯化融合蛋白。加载上 清液后，首先用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7. 5清洗柱，随后用13. 3mM磷酸钠、20mM柠 檬酸钠、5001111氯化钠？115.45清洗。用201111柠檬酸钠、1001111氯化钠、1001111甘氨酸口113 洗脱融合蛋白。中和并合并级分，并在最终配制缓冲液：20mM组氨酸、140mMNaClpH6.0 中通过大小排阻层析（HiLoad16/60Superdex200，GEHealthcare)纯化。使用基于氨基 酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度（0D)来测定经过纯化的蛋白质样 品的蛋白质浓度。通过在还原剂（5mM1，4-二硫苏糖醇）存在和缺失下的SDS-PAGE并用 考马斯蓝（SimpleBlue?SafeStain，Invitrogen)染色，分析融合蛋白的纯度和分子量。依 照制造商的用法说明书（4-20%Tris-甘氨酸凝胶或3-12%Bis-Tris)使用NuPAGE? 预制凝胶系统（Invitrogen)。或者，依照制造商的用法说明书使用CaliperLabChipGXII 系统（CaliperLifescience)，在还原剂存在和缺失下通过CE-SDS分析分子的纯度和分 子量。于 25°C在 2mMM0PS、150mMNaCl、0. 02%NaN3pH7. 3 运行缓冲液中使用Superdex 20010/300GL分析性大小排阻柱（GEHealthcare)分析融合蛋白样品的聚集体含量。或者， 于 25°C在 25mMK2HP04、125mMNaCl、200mML-精氨酸单氢氯化物、0. 02% (w/v)NaN3pH6. 7 运行缓冲液中使用TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱（Tosoh)分析抗体样品的聚集体 含量。
[0180] DP47GS IgG-IL-2和DP47GS IgG-(IL-2)2构建体的纯化和表征结果显示于图1和 2〇
[0181] 对IL-2受体的亲和力
[0182] 在下述条件下通过表面等离振子共振（SPR)使用重组IL-2RP Y异二聚体测定 融合蛋白对人、鼠和猕猴IL-2RPY异二聚体的亲和力：配体：在CM5芯片上固定化的人、 鼠和猕猴IL-2RP节Y穴异二聚体，分析物：DP47GSIgG-IL-2(见SEQ IDN013、15和 19)或DP47GS IgG-(IL-2)2(见SEQ IDN017和19)，温度：25°C，缓冲液：HBS-EP，分析 物浓度：300nM降至3. 7nM(l:3稀释），流：30iil/min，结合：180s，解离：300s，再生：60s 3M MgCl2，拟合：1:1结合，RI尹0, R最大=全局。还在下述条件下通过表面等离振子共振 (SPR)使用重组单体IL-2Ra亚基测定融合蛋白对人、鼠和猕猴IL-2Ra亚基的亲和力：配 体：在CM5芯片上固定化的人、鼠和猕猴IL-2Ra亚基，分析物：DP47GS IgG-IL-2或DP47GS IgG-(IL-2)2，温度：25°C，缓冲液：HBS-EP，分析物浓度：100nM降至3. lnM(l:3稀释），流： 30ii1/min，结合：60s，解离：180s，再生：无，拟合：1:1结合，RI= 0,R最大=全局。
[0183] 用IL-2RPY异二聚体或IL-2Ra亚基进行的动力学分析的结果显示于表1。
[0184] 表1。融合蛋白对IL-2R3Y和IL-2Ra的结合。
【权利要求】
1. 一种融合蛋白，其包含： (i) 包含修饰的免疫球蛋白分子，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰 降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力，和 (ii) 两个白介素-2(IL-2)分子。
2. 权利要求1的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白分子，特别是 IgGl亚类免疫球蛋白分子。
3. 权利要求1或2的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子为人免疫球蛋白分子。
4. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子不能够特异性结合抗 原。
5. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子包含基于人Vh3-23种 系序列的重链可变区序列。
6. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO :9的重 链可变区序列。
7. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子包含基于人Vk3-20种 系序列的轻链可变区序列。
8. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO :11的 轻链可变区序列。
9. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述Fc受体为Fcy受体，特别是人Fcy受 体。
10. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述Fc受体为激活性Fc受体。
11. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述Fc受体选自下组：Fc y RIII a (⑶16a)， Fc Y RI (CD64)，Fc Y Rlla(CD32)和 Fc a RI (CD89)。
12. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述F c受体为F c y RIII a，特别是人 Fc Y RIIIa〇
13. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第 329位（EU编号方式）处包含氨基酸替代
14. 权利要求13的融合蛋白，其中所述氨基酸替代为P329G。
15. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链第 234位和第235位（EU编号方式）处包含氨基酸替代。
16. 权利要求15的融合蛋白，其中所述氨基酸替代为L234A和L235A(LALA)。
17. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子在免疫球蛋白重链中 包含氨基酸替代L234A、L235A和P329G(EU编号方式）。
18. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IL-2分子为野生型IL-2分子。
19. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IL-2分子为人IL-2分子。
20. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IL-2分子包含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :3的序列，特别是SEQ ID NO :3的序列。
21. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中所述IL-2分子各自在它们的N末端氨基酸 融合至所述免疫球蛋白分子的免疫球蛋白重链之一的C末端氨基酸，任选经由肽接头。
22. 前述权利要求任一项的融合蛋白，其中该融合蛋白包含SEQ ID NO :17和SEQ ID NO :19的多肽序列。
23. -种多核苷酸，其编码前述权利要求任一项的融合蛋白。
24. -种包含权利要求23的多核苷酸的载体，特别是表达载体。
25. -种宿主细胞，其包含权利要求23的多核苷酸或权利要求24的载体。
26. -种生成权利要求1至22中任一项的融合蛋白的方法，其包括以下步骤： (i) 在适合于表达所述融合蛋白的条件下培养权利要求25的宿主细胞，并 (ii) 回收所述融合蛋白。
27. -种融合蛋白，其包含： (i) 包含修饰的免疫球蛋白分子，与没有所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，该修饰 降低免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力；和 (ii) 两个白介素-2(IL-2)分子， 该融合蛋白是通过权利要求38的方法生成的。
28. -种药物组合物，其包含权利要求1至22或27中任一项的融合蛋白和药学可接受 载剂。
29. 权利要求1至22或27中任一项的融合蛋白或权利要求28的药物组合物，其用作 药物。
30. 权利要求1至22或27中任一项的融合蛋白或权利要求28的药物组合物，其用于 治疗或预防自身免疫疾病。
31. 权利要求30的融合蛋白或药物组合物，其中所述自身免疫疾病选自下组：1型糖尿 病，系统性红斑狼疮，克罗恩氏（Crohn)病和多发性硬化症。
32. 权利要求1-22或27任一项的融合蛋白或权利要求28的药物组合物，其用于治疗 或预防移植排斥或移植物抗宿主病。
33. 权利要求1-22或27中任一项的融合蛋白在制备用于治疗有此需要的个体中疾病 的药物的用途。
34. 权利要求33的用途，其中所述疾病为自身免疫疾病。
35. 权利要求34的用途，其中所述自身免疫疾病选自下组：1型糖尿病，系统性红斑狼 疮，克罗恩氏病和多发性硬化症。
36. 权利要求33的用途，其中所述疾病为移植排斥或移植物抗宿主病。
37. 权利要求33-36任一项的用途，其中所述个体为哺乳动物，特别是人。
38. -种治疗个体中疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组 合物包含药学可接受形式的权利要求1至22或27中任一项的融合蛋白。
39. 权利要求38的方法，其中所述疾病为自身免疫疾病。
40. 权利要求39的方法，其中所述自身免疫疾病选自下组：1型糖尿病，系统性红斑狼 疮，克罗恩氏病和多发性硬化症。
41. 权利要求38的方法，其中所述疾病为移植排斥或移植物抗宿主病。
42. 权利要求38-41任一项的方法，其中所述个体为哺乳动物，特别是人。
43. 权利要求1-22或27任一项的融合蛋白，其用于在体外或在体内选择性激活调节性 T细胞。
44. 权利要求43的融合蛋白，其中所述激活包括诱导调节性T细胞增殖和/或在调节 性T细胞中诱导IL-2受体信号传导。
45. 权利要求43或44的融合蛋白，其中在体外使用且以约Ing/mL或更少，特别是约 0. Ing/mL或更少的浓度使用所述融合蛋白。
46. 权利要求43或44的融合蛋白，其中在体内使用且以约20 ii g/kg体重或更少，特别 是约12 ii g/kg体重或更少，更特别是约6 ii g/kg体重或更少的剂量使用所述融合蛋白。
47. -种在体外或在体内选择性激活调节性T细胞的方法，其包括使所述调节性T细胞 与权利要求1-22或27任一项的融合蛋白接触。
48. 权利要求47的方法，其中所述激活包括诱导调节性T细胞增殖和/或在调节性T 细胞中诱导IL-2受体信号传导。
49. 权利要求47或48的方法，其中所述方法在体外且以约Ing/mL或更少，特别是约 0. Ing/mL或更少的浓度使用所述融合蛋白。
50. 权利要求47或48的方法，其中所述方法在体内且以约20 ii g/kg体重或更少，特别 是约12 ii g/kg体重或更少，更特别是约6 ii g/kg体重或更少的剂量使用所述融合蛋白。
51. 如说明书所述的发明。
【文档编号】C12N15/62GK104507504SQ201380041053
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2012年8月10日
【发明者】R·奥斯, C·克莱因, E·莫斯纳, L·B·彼得森, P·乌玛纳, L·威克 申请人:罗切格利卡特公司