用于评价哺乳动物精子的结合的方法和试剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于测定哺乳动物精子的受精能力的新的装置/系统，其基于模拟精子与卵子结合的特异性精子结合测试。本发明的装置/系统包括具有化合物或缀合物的表面修饰的珠，所述化合物或缀合物含有与哺乳动物透明带(ZP)糖蛋白相关的碳水化合物序列。
【专利说明】用于评价哺乳动物精子的结合的方法和试剂
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2012年7月3日提交的美国临时专利申请第61/690, 729号的权 益，通过引用的方式将其全部内容并入本文。
[0003] 关于政府资助研宄的声明
[0004] 本发明是在USDA给予的第USDA-NR1 2007-131G号基金的政府支持下完成的。政 府享有本申请的一定权利。 发明领域
[0005] 本发明涉及通过评价精子的结合能力来检测哺乳动物的生育能力的方法、试剂、 装置、试剂盒以及其他方面。本发明提供了用于确定来自个体哺乳动物（例如公猪）的精 子是否能结合和经历顶体胞吐作用的简便的、实用的、快速的且可重复的测试。
[0006] 发明背景
[0007] 选择具有高质量精子的诸如公猪的动物对于牲畜养殖/工业是非常重要的。例 如，猪肉是世界上消费量最大的肉类，每年生产超过1亿吨猪肉，并且在任何时间都存在20 亿头饲养活猪。美国和欧洲提供1/3的产量，并且几乎所有出生的猪仔都是人工授精（AI) 产生的。AI已显著地增加了这些动物的遗传变异性并提高猪肉的总体品质，特别是减少很 多潜在消费者不喜欢的脂肪含量。关键的是，选择用于配种的公猪以及其他雄性哺乳动物 具有高质量精子，使得受精成功率高，并且授精能实现频繁和健康的传代。
[0008] 当精子与卵子周围的专门的细胞外基质（称为透明带（ZP))结合时，启动哺乳 动物的受精作用。这种结合触发直接导致顶体胞吐作用的信号转导级联（Yanagimachi， 1994)。通过使质膜与顶体（位于质膜正下方的精子细胞器）的外膜融合，在显微镜下显 示了该反应的诱导。融合的膜经过囊泡化和穿孔，形成膜泡，膜泡从精子头部脱落，暴露内 部顶体膜。该膜上的粘附分子与ZP相互作用，从而使顶体反应的精子结合并穿透该基质。 精子进入卵周隙，并与卵细胞融合，从而完成受精所必需的细胞结合事件（Lopoetal.， 1982；Yanagimachi,1994)〇
[0009] 在数种无脊椎海洋动物种类中最初获得了碳水化合物识别在介导精子-卵子结 合中发挥重要作用的证据（Lopo et al.，1982;Mengerink^PVacquier，2001;Monroy， 1965 ;Vacquier和Moy，1977)。基于这些发现，正常的假设是，哺乳动物的精子-卵子 结合还依赖于凝集素样相互作用。自从30多年前最初分离鼠的和猪的ZP(pZP)糖蛋 白（1316；[1和￥38831'11^11，1978;011油316七31.，1978)以来，明确该结合事件所基于的 分子学基础的特征已成为重大研宄课题。在大鼠、仓鼠和豚鼠中也研宄了该相互作用 (Tulsiani et al.，1997)。最近，本申请的发明人的研宄也提示，人ZP上表达的唾液酸 基Lewisx(sialyl_Lewis x)序列是作为介导人配子结合的碳水化合物配体（Pang et al.， 2011)0
[0010] 很多研宄表明，在受精的初始阶段，位于哺乳动物精子质膜上的凝集素样卵子结 合蛋白出8?)与2?上存在的多聚糖结合（(：1&4,2010;1\1181 &1116七&1.，1997)。在体细 胞粘附系统中获得的证据也支持猪的和鼠的精子的表面上存在凝集素样EBP(Clark，2010 ; Sutton-Smith et al. ，2007)。
[0011] 经典的凝集素通常对携带多价配体的糖缀合物展现出nM范围的显著的Kd值（Dam et al.，2009)。所考虑的可能性是，凝集素样EBP需要合适地呈现的碳水化合物配体来介 导精子结合，但是不需要同时识别ZP蛋白骨架。小鼠、猪和人ZP糖蛋白相关的多聚糖现已 被测序（01&^，2010;]^(11'；[。1^，2008;1^0811(311；[和似1^110，1993;?31^6七31.，2011)。自从 1970年而来，还进行了与生殖功能无关的很多糖蛋白的糖组学分析（North et al.，2009)。 但是，基于经历顶体胞吐作用的结合活性和能力的精子受精能力的直接测试还尚未被考虑 或成功尝试。
[0012] 因此，需要提供用于测定哺乳动物受精能力的新的测试方法和装置，其利用关注 于精子运动力、形态学、与卵子的结合能力和经历顶体胞吐作用的能力的特异性测试。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明提供了用于测定哺乳动物精子的受精能力的新的装置/系统，例如，试剂 和试剂盒，其基于模拟精子与卵子结合和经历顶体反应的能力的特异性精子结合测试。一 些实施方案包括标准体外受精介质中的具有化合物或缀合物的表面修饰的珠，所述化合 物或缀合物含有碳水化合物序列，所述碳水化合物序列与哺乳动物透明带（ZP)糖蛋白 相关的末端碳水化合物序列相同或具有85 %同源性。可以使用AFFI-GELK(Bio-Rad， Hercules，CA)珠，并且具有所需的碳水化合物序列的化合物或缀合物可以以饱和密度固定 于珠上，以便于快速和准确测试。
[0015] 根据本发明的一个实施方案，哺乳动物精子受精能力测试包括标准体外受精介质 中的一定量的AF'n-GELK:珠，珠表面修饰有含有lacNAc(Gal M-4GlcNAc序列）的化合 物或缀合物。此外，化合物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白，猪科N-多聚糖或猪科0-多聚糖， 牛科甲状腺球蛋白、猪科N-多聚糖或猪科0-多聚糖的模拟物或以上的组合。在一些实施 方案中，精子来自公猪。
[0016] 根据本发明的另一个实施方案，牛的精子受精能力测试包括标准体外受精介质中 的一定量的AFFI-GELt珠，珠表面修饰有含有末端高甘露糖序列（Man5GlcNAc2)的化合物 或缀合物。
[0017] 根据本发明的另一个实施方案，人精子受精能力测试包括标准体外受精介质中的 一定量的AFFI-GEL?珠，珠表面修饰有含有唾液酸基Lewisx序列的化合物或缀合物。
[0018] 本发明还提供了评价哺乳动物精子的受精能力的测试方法，所述方法基于模拟精 子与卵子结合以及随后经历顶体反应的特异性精子结合测试。本发明的测试方法包括以下 步骤：1)提供标准体外受精介质中的一定量的具有化合物、缀合物的表面修饰的珠，所述 化合物、缀合物含有碳水化合物序列，所述碳水化合物序列与哺乳动物ZP糖蛋白相关的末 端碳水化合物序列相同或具有85%同源性，以及2)将精子添加到受精介质中。为了实现定 量结果，本发明的测试方法还可以包括以下步骤：去除未与珠结合的精子，并对与珠结合的 精子进行计数。
[0019] 本发明的一些实施方案涉及评价非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的 方法。所述方法包括将非人哺乳动物精子样品、有助于保持精子的生理活性的介质和至少 一个基底组合在一起，所述基底在其表面的至少一部分上包含化合物或缀合物。化合物或 缀合物包含Gal M-4GlcNAc末端碳水化合物。所述组合允许至少一部分的非人哺乳动物 精子样品与所述基底结合。精子与包含所述化合物或缀合物的基底的结合指示精子与哺乳 动物卵子的结合。可以将形成的组合孵育一定时间，例如约30分钟，从而允许至少一部分 的非人哺乳动物精子样品与所述基底结合。接下来，对与所述基底结合的精子进行可视化 或定量，从而评价非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力。在一些实施方案中，所述方 法还包括在对与所述基底结合的精子进行可视化或定量之前，去除至少一部分的未结合的 精子。进行该步骤可以增加可视化或定量的灵敏性或准确性。在一些实施方案中，基底包 括交联的琼脂糖珠。在一些实施方案中，化合物或缀合物连接于样本载片、盘或微量滴定板 的孔的表面，和/或化合物或缀合物被固定用于流式细胞术。在一些实施方案中，哺乳动物 精子是马的或猪的精子。在一些实施方案中，哺乳动物精子来自牛、绵羊、山羊、狗、猫、兔、 小鼠、大鼠、仓鼠或豚鼠。在一些实施方案中，化合物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白，猪科 N-多聚糖或猪科0-多聚糖，牛科甲状腺球蛋白、猪科N-多聚糖或猪科0-多聚糖的模拟物 或以上的组合。
[0020]在一些实施方案中，评价非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的方法包括 将马的或猪的哺乳动物精子样品、有助于保持精子的生理活性的介质和至少一个基底组合 在一起，所述基底在其表面的至少一部分上包含化合物或缀合物，其中所述化合物或缀合 物是牛科甲状腺球蛋白，猪科N-多聚糖或猪科0-多聚糖，牛科甲状腺球蛋白、猪科N-多聚 糖或猪科〇-多聚糖的模拟物或以上的组合，并且基底包括交联的琼脂糖珠。所述组合允许 至少一部分哺乳动物精子样品与基底结合。精子与包含所述化合物或缀合物的基底的结合 指示精子与哺乳动物卵子的结合。可以将形成的组合孵育一定时间，例如约30分钟，从而 允许至少一部分的非人哺乳动物精子样品与所述基底结合。接下来，对与所述基底结合的 精子进行可视化或定量，从而评价非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力。在一些实 施方案中，所述方法还包括：在对与所述基底结合的精子进行可视化或定量之前，去除至少 一部分的未结合的精子。进行该步骤可以增加可视化或定量的灵敏性或准确性。在一些实 施方案中，化合物或缀合物以饱和浓度连接于所述基底的表面。在一些实施方案中，化合物 或缀合物是牛科甲状腺球蛋白或其模拟物，以及在一些实施方案中，哺乳动物精子是猪的 精子以及化合物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白或其模拟物。在一些实施方案中，化合物或 缀合物是猪科N-多聚糖或其模拟物，以及在一些实施方案中，哺乳动物精子是猪的精子并 且化合物或缀合物是猪科N-多聚糖或其模拟物。在一些实施方案中，化合物或缀合物是猪 科〇-多聚糖或其模拟物，以及在一些实施方案中，哺乳动物精子是猪的精子并且化合物或 缀合物是猪科〇-多聚糖或其模拟物。在一些实施方案中，哺乳动物精子是马的精子并且化 合物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白或其模拟物。在一些实施方案中，哺乳动物精子是马的 精子并且化合物或缀合物是猪科N-多聚糖或其模拟物。在一些实施方案中，哺乳动物精子 是马的精子并且化合物或缀合物是猪科〇-多聚糖或其模拟物。在一些实施方案中，哺乳动 物精子是牛的精子并且化合物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白或其模拟物。在一些实施方案 中，哺乳动物精子是牛的精子并且化合物或缀合物是猪科N-多聚糖或其模拟物。在一些实 施方案中，哺乳动物精子是牛的精子并且化合物或缀合物是猪科〇-多聚糖或其模拟物。在 一些实施方案中，哺乳动物精子是鼠的精子并且化合物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白或其 模拟物。在一些实施方案中，哺乳动物精子是鼠的精子并且化合物或缀合物是猪科N-多聚 糖或其模拟物。在一些实施方案中，哺乳动物精子是鼠的精子并且化合物或缀合物是猪科 〇-多聚糖或其模拟物。在一些实施方案中，哺乳动物精子来自大鼠、兔、绵羊、山羊、豚鼠、 猫、狗或仓鼠，以及化合物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白或其模拟物。在一些实施方案中， 哺乳动物精子来自大鼠、兔、绵羊、山羊、豚鼠、猫、狗或仓鼠，以及化合物或缀合物是猪科 N-多聚糖或其模拟物。在一些实施方案中，哺乳动物精子来自大鼠、兔、绵羊、山羊、豚鼠、 猫、狗或仓鼠，以及化合物或缀合物是猪科0-多聚糖或其模拟物。
[0021] 一些实施方案涉及用于测定非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的试剂。 所述试剂包括基底，所述基底在其表面的至少一部分上包含化合物或缀合物，其中所述化 合物或缀合物包含GalM_4GlcNac末端碳水化合物。在一些实施方案中，基底包括交联的 琼脂糖珠。在一些实施方案中，化合物或缀合物以饱和浓度连接于所述基底的表面。在一 些实施方案中，化合物或缀合物连接于样本载片、盘或微量滴定板的孔的表面，和/或化合 物或缀合物被固定用于流式细胞术。在一些实施方案中，化合物或缀合物是牛科甲状腺球 蛋白，猪科N-多聚糖或猪科0-多聚糖，牛科甲状腺球蛋白、猪科N-多聚糖或猪科0-多聚 糖的模拟物，或以上的组合。
[0022] 在用于测定非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的试剂的一些实施方案 中，试剂包括基底，所述基底在其表面的至少一部分上包含化合物或缀合物，其中所述化合 物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白，猪科N-多聚糖或猪科0-多聚糖，牛科甲状腺球蛋白、猪 科N-多聚糖或猪科0-多聚糖的模拟物，或以上的组合，以及其中所述基底包括交联的琼脂 糖珠。在一些实施方案中，化合物或缀合物以饱和浓度连接于所述基底的表面。在一些实 施方案中，化合物或缀合物连接于样本载片、盘或微量滴定板的孔的表面，和/或化合物或 缀合物被固定用于流式细胞术。
[0023] 本发明的一些实施方案提供了用于测定非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的 能力的试剂盒。这种试剂盒包括化合物或缀合物以及至少一种其他试剂，其中所述化合物 或缀合物包含Gal|3l_4GlcNac末端碳水化合物，所述至少一种其他试剂选自：（i)所述化 合物或缀合物可以连接的基底和（ii)有助于保持精子的生理活性的介质的至少一种组 分。在一些实施方案中，基底包括交联的琼脂糖珠。在一些实施方案中，化合物或缀合物是 牛科甲状腺球蛋白，猪科N-多聚糖或猪科0-多聚糖，牛科甲状腺球蛋白、猪科N-多聚糖或 猪科〇-多聚糖的模拟物，或以上的组合。
[0024] 在用于测定非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的试剂盒的一些实施方 案中，试剂盒包括化合物或缀合物以及至少一种其他试剂，其中所述化合物或缀合物是牛 科甲状腺球蛋白，猪科N-多聚糖或猪科0-多聚糖，牛科甲状腺球蛋白、猪科N-多聚糖或猪 科〇-多聚糖的模拟物，或以上的组合，所述至少一种其他试剂选自：（i)包含所述化合物或 缀合物可以连接的交联琼脂糖珠的基底，和（ii)有助于保持精子的生理活性的介质的至 少一种组分。
[0025] 附图简要描述
[0026] 图1展示了与人的ZP相关的碳水化合物序列。
[0027] 发明详细描述
[0028] 本发明提供了用于测定雄性哺乳动物的受精能力的简单和灵敏的装置/系统和 方法，所述测定是基于模拟精子与卵子的结合以及随后经历顶体反应的特异性精子结合测 试。本发明的实施方案关注于精子运动力和形态学，并使得使用者能够更好地预测特定雄 性哺乳动物的受精能力和鉴定具有高计数的有功能精子的雄性哺乳动物。
[0029] 在不被理论所束缚的情况下，哺乳动物的精子与卵子的结合主要依赖于识别与透 明带（ZP)糖蛋白相关的多聚糖上存在的物种特异性末端碳水化合物序列。有明确的迹象 表明，来自不同物种的精子表达具有与经典凝集素相关的特性的卵子结合蛋白（EBP)。很多 凝集素对携带它们的多价配体的糖缀合物表现出nM范围内的解离常数（Kd)，这表明凝集 素样EBP单独就能介导有效的精子结合。因此，在不存在ZP蛋白骨架的情况下，携带与ZP 基质上表达的多聚糖相似的多聚糖的糖蛋白能介导精子结合。
[0030] 本发明的一方面提供了用于测定来自具体哺乳动物的精子的受精能力的本发明 的装置/系统，其包括标准体外受精介质中的具有化合物或缀合物的表面修饰的珠，所述 化合物或缀合物含有碳水化合物序列，所述碳水化合物序列与哺乳动物ZP糖蛋白相关的 末端碳水化合物序列相同或具有85%同源性。可以使用AFFI-GEI； I;^，以及具有所需的 碳水化合物序列的化合物或缀合物以饱和密度固定于珠上，以便于快速和准确测试。
[0031] 在一些实施方案中，所述装置/系统是用于测定哺乳动物精子结合哺乳动物卵子 的能力的试剂。在一些实施方案中，哺乳动物精子来自非人哺乳动物。此类示例性的非限制 性实例包括猪（猪科）、牛（牛科）、马（马科）、绵羊、山羊、小鼠（鼠科）、大鼠、兔、仓鼠和 豚鼠。所述试剂包括基底，所述基底在其表面的至少一部分上包含化合物或缀合物。在一些 实施方案中，化合物或缀合物是糖蛋白。在一些实施方案中，基底能结合糖蛋白，例如但不 限于，包括交联的琼脂糖珠的基底。AFFI-GEL?珠是示例型的能结合糖蛋白的交联的琼 脂糖珠。在一些实施方案中，化合物或缀合物包含Gal M_4GlcNac末端碳水化合物。化合 物或缀合物的示例性的非限制性实例包括牛科甲状腺球蛋白，猪科N-多聚糖，猪科0-多聚 糖，牛科甲状腺球蛋白、猪科N-多聚糖、猪科0-多聚糖的模拟物，或以上的组合。在一些实 施方案中，化合物或缀合物以饱和浓度连接于基底的表面。在不被理论所束缚的情况下，以 饱和浓度将化合物或缀合物连接于基底的表面减少或甚至消除基底的表面的可接近区域， 使得仅有表面上的化合物或缀合物可被接近，从而模拟卵子表面。另外，为了提高例如方便 性、处理量、平行处理等方面，基底可连接于样本载片、盘或微量滴定板的孔的表面，或可固 定用于流式细胞术。
[0032] 本发明的一些实施方案涉及评价哺乳动物精子的受精能力的新的测试方法，所述 方法是基于模拟精子与卵子的结合以及随后经历顶体反应的特异性精子结合测试。所述实 施方案包括以下步骤：1)提供标准体外受精介质中的一定量的具有化合物或缀合物的表 面修饰的珠，所述化合物或缀合物含有碳水化合物序列，所述碳水化合物序列与哺乳动物 ZP糖蛋白相关的末端碳水化合物序列相同或具有85%同源性，以及2)将精子添加到受精 介质中。为了实现定量结果，本发明的测试方法还可以包括以下步骤：去除未与珠结合的精 子，并对与珠结合的精子进行计数。
[0033] 27 -些实施方案涉及评价哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的方法。哺乳动 物可以是非人哺乳动物，例如但不限于，猪（猪科）、牛（牛科、马（马科）、绵羊、山羊、小鼠 (鼠科）、大鼠、兔、仓鼠和豚鼠。在一些实施方案中，非人哺乳动物是猪科或马科。在一些实 施方案中，所述方法包括形成包含以下的组合：（i)哺乳动物精子样品，（ii)有助于保持精 子的生理活性的介质，和（iii)至少一个基底，所述基底在其表面的至少一部分上包含化 合物或缀合物，其中所述化合物或缀合物包含Gal0l-4GlcNAc末端碳水化合物。本领域普 通技术人员能够理解"形成组合"能够以多种不同方式实现，例如，通过使组分在孔、盘中、 在样本载片的表面上或在装置（其中例如介质和样品流过基底或以其他方式接触基底）内 彼此接触。形成所述组合以允许至少一部分的哺乳动物精子样品与基底结合。例如，本发 明的方法的一些实施方案涉及使精子样品通过固定的基底，并捕获与基底结合的至少一部 分精子样品，其中不与基底结合的精子样品的部分不被捕获。所述介质可以是任何有助于 保持精子的生理活性的介质，例如体外受精介质。在使精子与基底结合后，可以对与基底结 合的精子进行可视化或定量。通过固定和/或染色结合的精子可以增强结合的精子的可视 化和定量。在一些实施方案中，结合的精子的细胞化学或免疫组化染色可以用于增强可视 化和定量。定量可通过多种方法实施，例如，通过人工计数精子或利用成像或流式细胞术方 法自动计数。在一些实施方案中，可以检查包被有化合物或缀合物的全部基底表面。在一 些实施方案中，可以检查仅一部分基底表面来确定结合该部分的精子的量。所获得的值可 以用于确定另一个值，例如样品中结合的全部精子的数目或近似数目。与任何量的基底结 合的精子的数量还可以用于计算，例如，单位基底表面面积或单位基底浓度或单位可用于 结合的化合物或缀合物密度等中结合的精子的量或近似量。一个样品中结合的精子的数量 还可以与一个或多个其他样品中结合的精子的数量进行比较，从而确定比值。结合的精子 的数量或结合的精子的比值可用于评价精子样品结合碳水化合物序列的能力，其可以代表 和/或预测精子样品结合卵子的能力。在一些实施方案中，结合的精子可以经历顶体胞吐 作用，其可以通过FITC标记的花生（Arachishypogaea)凝集素与暴露的内部顶体膜和顶 体套（acrosomalshrouds)的结合来检测。在一些实施方案中，在可视化或定量之前，可以 去除未结合的精子，从而提高这些步骤的灵敏性。基底、化合物或缀合物等如前文所述。例 如，在一些实施方案中，基底包括交联的琼脂糖珠。化合物或缀合物可以以饱和浓度连接于 基底表面。在一些实施方案中，化合物或缀合物是糖蛋白。例如，化合物或缀合物可以选自 牛科甲状腺球蛋白、猪科N-多聚糖、猪科0-多聚糖或以上的组合。在一些实施方案中，基 底可以连接于样本载片、盘或微量滴定板的孔的表面，或以其他方式固定用于流式细胞术。
[0034] 本发明的一些实施方案涉及用于按照本文所述的方法测定哺乳动物精子结合哺 乳动物卵子的能力的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含化合物或缀合物，其中所述化 合物或缀合物包含GalM_4GlcNac末端碳水化合物。试剂盒还包含至少一种选自以下的 其他试剂：（i)可以连接所述化合物或缀合物的基底和（ii)有助于保持精子的生理活性的 介质的至少一种组分。这种试剂盒可以提供有已连接于基底的化合物或缀合物，或者允许 使用者在使用前将化合物或缀合物连接于基底。按照上文所述本发明的试剂和方法的实施 方案，基底可以包括交联的琼脂糖珠。化合物或缀合物可以选自牛科甲状腺球蛋白、猪科 N-多聚糖、猪科0-多聚糖或以上的组合。
[0035] 与来自人、小鼠、牛科、猪科和其他哺乳动物的ZP相关的碳水化合物序列现已由 本申请的发明人和其他研宄人员严格定义（<^]^4,2010 ;116(11'；[01^，2008;?3叩6丨31.， 2011)。因此，可以相应地产生前述化合物或缀合物以包含对每个个体物种具有特异性的末 端碳水化合物序列，这进一步将本发明的测试装置和方法扩展到很多哺乳动物物种，包括 但不限于猪科、马科和人。
[0036] 图1显示了与人的ZP相关的碳水化合物序列。如图1所示，人ZP糖蛋白表达非 常高密度的携带唾液酸基Lewisx序列的N-多聚糖。
[0037] 以下公开的实施例仅仅示例本发明，而本发明可以体现为多种形式。因此，以下实 施例公开的具体的结构、功能和程序上的细节不应解释为限制性的。 实施例
[0038] 公猪精子受精能力测试。公猪精子受精能力测试包括标准体外受精介质中的一定 量的AFFI-GEL1:1珠，珠表面修饰有含有Gal M-4GlcNAc序列的化合物或缀合物（例如选 自牛科甲状腺球蛋白、猪科N-多聚糖、猪科0-多聚糖或以上的模拟物）。对于每ml包装的 珠AFF[-GEL?珠可以偶联（连接）多至35-40mg的蛋白。为了在饱和条件下连接珠以 产生饱和浓度，将lml包装的珠与2-3ml的偶联缓冲液孵育，偶联缓冲液含有100mg牛科甲 状腺球蛋白。
[0039] 包被牛科甲状腺球蛋白（bTg)的珠优选用于公猪精子测试装置。通过了解糖生 物学文献可知，牛科甲状腺球蛋白（bTg)和猪的ZP(pZP)之间存在潜在的糖基化重叠。基 于很多研宄的结果，pZP糖蛋白表达大量的硫酸化和唾液酸化的N-和0-多聚糖。末端为 lacNAc (Gal M_4GlcNAc)序列的中性三分支和四分支N-多聚糖已被提示为用于公猪精子 ZP结合的主要配体。已经对bTg进行了有限的糖组学分析，尽管如此，这些分析表明与pZP 存在潜在的糖基化重叠。
[0040] 为了进一步确认这种关系，通过使用现代质谱方法对bTg进行糖组学和硫基糖组 学分析。已确认bTg和pZP糖蛋白之间存在大量的糖基化结构重叠。
[0041] 在具体的公猪精子受精能力测试中，通过利用基于N-羟基琥珀酰亚胺的反应，将 bTg以饱和浓度连接于琼脂糖珠。在与包被有bTg的珠孵育之前，使公猪精子在标准猪IVF 条件下获得能育力和孵育。精子快速且稳健地与这些珠结合，正如它们与体外成熟的猪科 卵子对照的结合。30分钟后，结合的精子经历顶体胞吐作用，顶体胞吐作用是通过FITC标 记的花生（Arachis hypogaea)凝集素与暴露的内部顶体膜和顶体套的结合来检测。在受 精的最佳条件下，牛科精子不与这些珠结合，并且也不经历顶体胞吐作用。
[0042] 这些研宄提供有力的证据表明：固定化的bTg介导公猪精子结合并诱导顶体胞吐 作用。这些结果清楚地提示：1) bTg多聚糖在这些生物学活性中的作用，2)用bTg多聚糖修 饰的珠模拟猪科卵子的能力，以及3)本申请的测试用于评价公猪的受精能力（特别是在人 工授精和IVF周期之前）的优势。
[0043] 尽管已经结合具体实施方案描述了本发明，应当理解，本发明的装置能够进行其 他改动。本专利申请意图涵盖大体遵循本发明的原理的本发明的任何变形、用途或改进，并 包括如下变化：其在本发明所属领域的已知或常规实践的范围内并可应用于本文所述的必 要特征。
[0044] 参考文献
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【权利要求】
1. 评价非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的方法，所述方法包括： (a) 将非人哺乳动物精子样品、有助于保持精子的生理活性的介质和至少一个基底组 合在一起，所述基底在其表面的至少一部分上包含化合物或缀合物，其中所述化合物或缀 合物包含Gal β l-4GlcNAc末端碳水化合物，从而允许至少一部分的非人哺乳动物精子样 品与所述基底结合，其中所述精子与包含所述化合物或缀合物的基底的结合指示精子与哺 乳动物卵子的结合；以及 (b) 对与所述基底结合的精子进行可视化或定量， 从而评价非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力。
2. 如权利要求1所述的方法，其还包括在对与所述基底结合的精子进行可视化或定量 之前，去除至少一部分的未结合的精子。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述基底包括交联的琼脂糖珠。
4. 如权利要求1所述的方法，其中所述化合物或缀合物连接于样本载片、盘或微量滴 定板的孔的表面。
5. 如权利要求1所述的方法，其中所述化合物或缀合物被固定以用于流式细胞术。
6. 如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物精子是马科的或猪科的精子。
7. 如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物精子是猪科的精子。
8. 如权利要求1所述的方法，其中所述化合物或缀合物选自牛科甲状腺球蛋白、猪科 N-多聚糖、猪科O-多聚糖及以上的组合。
9. 评价非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的方法，所述方法包括： (a) 将马科或猪科哺乳动物精子样品、有助于保持精子的生理活性的介质和至少一个 基底组合在一起，所述基底在其表面的至少一部分上包含化合物或缀合物，其中所述化合 物或缀合物选自牛科甲状腺球蛋白、猪科N-多聚糖，猪科0-多聚糖及以上的组合，并且其 中所述基底包括交联的琼脂糖珠，从而允许至少一部分的哺乳动物精子样品与所述基底结 合，其中所述精子与包含所述化合物或缀合物的基底的结合指示精子与哺乳动物卵子的结 合；以及 (b) 对与所述基底结合的精子进行可视化或定量， 从而评价非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力。
10. 如权利要求9所述的方法，其还包括在步骤（b)中：在对与所述基底结合的精子进 行可视化或定量之前，去除至少一部分的未结合的精子。
11. 如权利要求9所述的方法，其中所述化合物或缀合物以饱和浓度连接于所述基底 的表面。
12. 如权利要求9所述的方法，其中所述化合物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白。
13. 如权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物精子是猪科的精子，并且所述化合物 或缀合物是牛科甲状腺球蛋白。
14. 用于测定非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的试剂，所述试剂包括基底， 所述基底在其表面的至少一部分上包含化合物或缀合物，其中所述化合物或缀合物包含 Gal β l_4GlcNac末端碳水化合物。
15. 如权利要求14所述的试剂，其中所述基底包括交联的琼脂糖珠。
16. 如权利要求15所述的试剂，其中所述化合物或缀合物以饱和浓度连接于所述基底 的表面。
17. 如权利要求14所述的试剂，其中所述化合物或缀合物连接于样本载片、盘或微量 滴定板的孔的表面。
18. 如权利要求14所述的试剂，其中所述化合物或缀合物被固定以用于流式细胞术。
19. 如权利要求14所述的试剂，其中所述化合物或缀合物选自牛科甲状腺球蛋白、猪 科N-多聚糖、猪科O-多聚糖及以上的组合。
20. 用于测定非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的试剂，所述试剂包括基底， 所述基底在其表面的至少一部分上包含化合物或缀合物，其中所述化合物或缀合物选自牛 科甲状腺球蛋白、猪科N-多聚糖、猪科0-多聚糖及以上的组合，并且其中所述基底包括交 联的琼脂糖珠。
21. 如权利要求20所述的试剂，其中所述化合物或缀合物以饱和浓度连接于所述基底 的表面。
22. 如权利要求20所述的试剂，其中所述化合物或缀合物连接于样本载片、盘或微量 滴定板的孔的表面。
23. 如权利要求20所述的试剂，其中所述化合物或缀合物被固定以用于流式细胞术。
24. 如权利要求20所述的试剂，其中所述化合物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白。
25. 如权利要求20所述的试剂，其中所述哺乳动物精子是猪科的精子，并且所述化合 物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白。
26. 用于测定非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的试剂盒，所述试剂盒包含 化合物或缀合物，以及至少一种其他试剂，其中所述化合物或缀合物包含Gal β l-4GlcNac 末端碳水化合物；所述至少一种其他试剂选自：（i)可以连接所述化合物或缀合物的基底， 和（ii)有助于保持精子的生理活性的介质的至少一种组分。
27. 如权利要求26所述的试剂盒，其中所述基底包括交联的琼脂糖珠。
28. 如权利要求26所述的试剂盒，其中所述化合物或缀合物选自牛科甲状腺球蛋白、 猪科N-多聚糖、猪科0-多聚糖及以上的组合。
29. 用于测定非人哺乳动物精子结合哺乳动物卵子的能力的试剂盒，所述试剂盒包含 化合物或缀合物，以及至少一种其他试剂，其中所述化合物或缀合物选自牛科甲状腺球蛋 白、猪科N-多聚糖、猪科0-多聚糖及以上的组合；所述至少一种其他试剂选自（i)可以连 接所述化合物或缀合物的、包括交联的琼脂糖珠的基底，和（ii)有助于保持精子的生理活 性的介质的至少一种组分。
30. 如权利要求29所述的试剂盒，其中所述化合物或缀合物是牛科甲状腺球蛋白。
【文档编号】C12N5/16GK104520425SQ201380041989
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年7月3日 优先权日:2012年7月3日
【发明者】加里·弗朗西斯·克拉克, 彼得·苏托夫斯基 申请人:密苏里大学管委会