一种高产金属硫蛋白的酵母菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产金属硫蛋白的酵母菌及其应用，属于食品生物【技术领域】。是以本实验室筛选的酿酒酵母为出发菌株，经过恒化器连续培养，筛选到一株高产金属硫蛋白的酿酒酵母CGMCC?No.7971。本发明采用定向进化的方法提高了酿酒酵母金属硫蛋白的产量，本发明为工业化生产金属硫蛋白提供有力保障。
【专利说明】一种高产金属硫蛋白的酵母菌及其应用
【技术领域】[0001]本发明涉及一种高产金属硫蛋白的酿酒酵母及其应用，属于食品生物【技术领域】。【背景技术】
[0002]金属硫蛋白(metal1thionein,MT)是新发现的一种机体内源性物质,是种可被金属金属离子诱导、富含半胱氨酸的特异蛋白质，分子量较低，广泛存在于生物体内。MT构象比较坚固，耐热性强，具有稳定的生物学性质，抗酶解，氨基酸排列有重复性。整个分子为椭圆形，分子最大直径为30~50A，分子量为6000~7000U。MT上含有20个处于还原状态的活性巯基多肽链和7个二价金属原子(主要是在肝脏中的锌和肾脏中的镉)。MT具有四种异构体，MT-1和MT-1I异构体广泛存在于大多数哺乳动物的内脏器官中，参与功能调节；MT-1II和MT-1V异构体分别存在于中枢神经系统和扁平上皮中。
[0003]MT的生物学功能有:1、强力清除自由基:MT清除自由基的能力很强，约是超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的10000倍。2、抗辐射和紫外线照射:MT可抵抗电离辐射或紫外线引起的细胞组织损伤。3、重金属解毒作用:有毒金属一般指铅、砷、汞等。MT可以和有毒金属紧密结合，起到解除重金属毒素的作用，是目前临床最理想的生物解毒剂。4、参与微量元素贮存、运输和代谢:金属硫蛋白根据体内微量元素状况，自动释放出金属离子，补充体内所缺少的元素，调节体内微量元素平衡，增强体质。5、防止细胞癌变:MT可消除自由基和重金属损伤，防止“三致”作用。维持细胞正常代谢和分裂，激发人体免疫功能，增加肌体防癌抗癌的作用等。对MT的研究涉及农业、医药、食品、生物工程等各个领域，吸引了越来越多的研究者，特别是近年来对MT与疾病关系的研究显示了开发和利用MT的诱人前
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【发明内容】
[0004]本发明提供一种高产金属硫蛋白的酿酒酵母，保藏编号为CGMCC N0.7971，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,于2013年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0005]本发明还提供了一种生产金属硫蛋白的方法，是采用CGMCC N0.7971发酵生产金属硫蛋白。
[0006]具体而言，是将活化的种子液转接至含CuCl2的YEro诱导培养基中，诱导培养，离心，去上清，收集菌体，后用Tris.HCl缓冲液反复洗涤，去除残留的培养基，向离心管中加ATris.Cl缓冲液，充分搅拌，混匀，用超声波破壁器破壁；离心，收集上清液，于沸水浴中加热，迅速冷去，加入离心管中，最后离心，收集上清液。
[0007]所述诱导培养基采用YEro培养基，具体组成为:蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L,铜盐。
[0008]所述诱导培养的温度为30°C,诱导培养时间为48h。[0009]本发明的优点:
[0010]I)本发明通过对野生菌株进行定向进化筛选出高产金属硫蛋白的菌株，提高了金属硫蛋白的产量，该方法得到的菌株遗传性能稳定；
[0011]2)本发明筛选得到菌株可用于金属硫蛋白的发酵生产，本发明方法为工业化生产金属硫蛋白提供有力保障。
【具体实施方式】
[0012]酵母菌金属硫蛋白(MT)酶联免疫分析试剂盒由上海劲马生物科技有限公司提供，牛血清白蛋白(生化试剂)由北京奥博星生物技术有限责任公司提供，氯化铜、90%乙醇、85% (W/V)的磷酸、NaOH由天津永大化学试剂有限公司提供，丙酮由北京化工厂提供，考马斯亮蓝G-250 (生化试剂)AMRESC0公司，NTG日本TCI公司。
[0013]生物材料保藏信息:酿酒酵母N-8，保藏编号为CGMCC N0.7971，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,于2013年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0014]活化培养基(YPD):蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L。
[0015]诱导培养基(YEH)):蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，铜盐1.0mmol/L。
[0016]Cu- MT 的诱导:
[0017]将活化三次的种子液转接至YEH)诱导培养基中(含CuCl2),于30°C诱导培养48h。以5000r/min离心25min,去上清，收集菌体，后用0.01mol/L Tris.HCl (pH8.6)缓冲液反复洗涤，去除残留的培养基，向离心管中加入15mL，0.0ImoI/LTris.HCl (pH8.6)缓冲液，充分搅拌，混匀，用超声波破壁器破壁40min ；10000r/min离心15min，收集上清液，于沸水浴中加热3min，迅速冷去，加入离心管中，以10000r/min离心15min，收集上清液。
[0018]酿酒酵母类MT的分析测定:
[0019](I)总蛋白含量的测定
[0020]考马斯亮蓝G-250法。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。测定范围为IO-1OOug蛋白质，微量测定范围是1-1Oug蛋白质。
[0021](2)金属硫蛋白含量的测定
[0022]酶联免疫分析法(ELISA法)。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗MT抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗MT抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MT呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品浓度。
[0023](3)巯基活性的测定
[0024]简化的巯基试剂(DTNB)法。巯基试剂的配置:称取DTNB 0.0594g,盐酸胍0.0172g, EDTA 0.0112g 用 0.lmol/L PBS 试剂溶解定容至 IOOmL0
[0025]将样品配成IOOuL 溶液，加入 20uL 1.2mol/L HCl 和 400uL 0.lmol/L EDTA 反应10分钟脱去金属，加入200uL巯基试剂，混匀3min使MT变性后与DTNB形成黄色络合物，用 0.lmol/LPBSPH7.3 稀释至 6mL，在 412nm 处测紫外吸收值。用 C=DA/ ε ( ε =1.23X104(mol/L) ―1.cnT1)测算巯基浓度。
[0026]实施例1:菌株筛选
[0027]以本实验室前期经过诱变得到的菌株酿酒酵母突变株为出发菌株，该菌株总蛋白含量为170.2mg/g菌体，金属硫蛋白含量为163.4ng/L，巯基活性为0.146μπι01，并且该菌株具有较好的遗传稳定性。
[0028]将其在活化培养基中活化后，将种子培养至对数生长期，接种于诱导培养基中培养至0D_=1.0后，按照稀释率0.0511的流加速率向恒化器中流加诱导培养基至稳态，再提高流加的诱导培养基中铜盐含量至2.0mmol/L,当菌体浓度达到0D_=1.0时，流加铜盐含量至3.0mmol/L的活化培养基至稳态。如此反复操作逐步使菌株可以含有在5mmol/L的活
化培养基至稳态。
[0029]取恒化培养的最终培养液，经适当稀释涂布于诱导培养基平板上，挑选单菌落，分别将收集的单菌落活化三次的种子液转接至YEro诱导培养基中(含CuCl2),于30°C诱导培养 48h。以 5000r/min 离心 25min,去上清，收集菌体,后用 0.01mol/L Tris.HCl (ρΗ8.6)缓冲液反复洗涤，去除残留的培养基，向离心管中加入15mL，0.01mol/L Tris -HCKpH 8.6)缓冲液，充分搅拌，混匀，用超声波破壁器破壁40min ；10000r/min离心15min，收集上清液，于沸水浴中加热3min，迅速冷去，加入离心管中，以10000r/min离心15min，收集上清液。 [0030]该菌株总蛋白含量为160.lmg/g菌体，金属硫蛋白含量为203.2ng/L，巯基活性为
0.168 μ mol,并且该菌株具有较好的遗传稳定性。
[0031]实施例2:菌株CGMCC N0.7971发酵生产金属硫蛋白
[0032]诱导剂浓度为1.3mmol/L,诱导培养时间为65h,诱导培养pH 6.4,诱导培养温度为30°C。按照以上培养条件安排实验，测得金属硫蛋白产量为221.16ng/L。
[0033]实施例3:菌株CGMCC N0.7971发酵生产金属硫蛋白
[0034]诱导剂浓度为1.0mmol/L,诱导培养时间为50h,诱导培养pH 6.0,诱导培养温度为25°C。按照以上培养条件安排实验，测得金属硫蛋白产量为190.82ng/L。
[0035]实施例4:菌株CGMCC N0.7971发酵生产金属硫蛋白
[0036]诱导剂浓度为0.9mmol/L,诱导培养时间为58h,诱导培养pH 6.2,诱导培养温度为30°C。按照以上培养条件安排实验，测得金属硫蛋白产量为210.55ng/L。
【权利要求】
1.一种酿酒酵母，其特征在于，保藏编号CGMCC N0.7971。
2.权利要求1所述酿酒酵母用于发酵生产金属硫蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将活化的种子液转接至含CuCl2的YEH)诱导培养基中，诱导培养，离心，去上清，收集菌体，后用Tris -HCl缓冲液反复洗涤，去除残留的培养基，向离心管中加入Tris.HCl缓冲液，充分搅拌，混匀，用超声波破壁器破壁?’离心，收集上清液，于沸水浴中加热，迅速冷去，加入离心管中，最后离心，收集上清液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基YEH)的组成为:蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L和铜盐。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的温度为30°C。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述诱导培养时间为65h。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述CuCl2含量为1.3mm0l/L。
8.根据权利要求3所述的方法，其`特征在于，所述YEH)诱导培养基pH为6.4。
【文档编号】C12P21/02GK103695328SQ201410000287
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】王颖, 张东杰, 张桂芳, 苗兰兰, 徐炳政, 王月 申请人:黑龙江八一农垦大学