一种脂肪酶及其突变体的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种新型脂肪酶及其突变体，所述的脂肪酶的氨基酸序列为SEQ?ID?NO：1。本发明从塔宾曲霉中克隆得到一种新型脂肪酶Lip-1，其最适作用pH值为6.5，最适作用温度为40℃；在pH4.0-7.0的范围内能保留52.3%以上的酶活力。本发明同时在脂肪酶Lip-1基础上进行突变，获得了三个单点突变体，所述突变体对胰蛋白酶的耐受性较突变前分别提高了34.64%，36.30%和53.43%，因此更有利于其在饲料添加剂领域的应用。本发明所述脂肪酶Lip-1及其三个突变体均能有效提高饲料中油脂类物质的利用率，从而提高肉鸡的采食量和日增重，降低料肉比，提高养殖动物的生产性能，应用前景广泛。
【专利说明】一种脂肪酶及其突变体
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程及蛋白质改造【技术领域】，具体涉及一种脂肪酶及其突变体。【背景技术】
[0002]脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构(Schmid等，1998)。脂肪酶具有广泛的应用价值，已成为市场上的第三大工业用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品、医药、日化等工业。
[0003]酶学特性和酶的稳定性是影响其应用的关键因素之一；同时，很多酶学性质较好的蛋白在实际应用条件下，使用效果并不好。塔宾曲霉脂肪酶具有较好的胃酸和胃蛋白的耐受性；但是对胰蛋白酶耐受性较差。由于动物肠道是消化和吸收脂肪的主要器官，肠道中PH接近中性同时含有大量的胰蛋白酶；因此，肠道的消化特点限制了塔宾曲霉作为饲用酶制剂作用效果。
[0004]寻找和克隆合适饲用脂肪酶的途径有2个:一是筛选产新型酶的微生物；二是对酶进行适当的蛋白质工程改造。微生物菌种选育是工业生产和学术研究最常用和最简单的手段之一；但是，其缺点是工作量大，随机性强；因此往往很难筛选到理想菌株。而蛋白质工程是这些年新兴的、借用分子生物学和生物信息学的方法对蛋白进行定向突变和理性改造，而获得理想蛋白或酶方法。其优点是工作量相对较小和概率大；缺点是多数突变体蛋白酶学性质没有改变或者变得更差。因此，获得更好效果的脂肪酶突变体一直是本领域的研究热点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是 提供一种新型脂肪酶及其突变体。本发明利用分子生物学手段从塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)中克隆得到一种新型脂肪酶,所述脂肪酶与已报道的黑曲霉(Aspergillus niger)的脂肪酶仅存在五个氨基酸位点的不同，但所述位点的不同导致两者的酶学性质发生很大变化。为了进一步提高所述脂肪酶的胰蛋白酶耐受性，本发明通过蛋白质改造技术，获得了该脂肪酶的突变体，所述突变体对胰蛋白酶的耐受性得到显著提升，因此更有利于其在饲料领域中的广泛应用。
[0006]本发明一方面提供了一种新型脂肪酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
[0007]所述脂肪酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
[0008]本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:2的脂肪酶基因的质粒。
[0009]本发明还包括携带有上述质粒的里氏木霉(Trichoderma reesei)。
[0010]为了进一步提高上述脂肪酶的胰蛋白酶耐受性，本发明对氨基酸序列为SEQ IDNO:1的脂肪酶进行突变，获得了三个脂肪酶突变体。
[0011]本发明提供了第一个脂肪酶突变体，是将氨基酸序列为SEQ ID N0:1的脂肪酶的142位氨基酸由Lys变为He。
[0012]上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:5，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:6。
[0013]本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:6的脂肪酶突变体基因的质粒。
[0014]本发明提供的第二个脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶的154位氨基酸由Lys变为Cys。
[0015]上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:7，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:8。
[0016]本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:8的脂肪酶突变体基因的质粒。
[0017]本发明提供的第三个脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶的156位氨基酸由Lys变为Trp。
[0018]上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:9，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:10。
[0019]本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO: 10脂肪酶突变体基因的质粒。
[0020]将上述的质粒转入里氏木霉中，重组表达的脂肪酶突变体对胰蛋白酶具有很好的耐受性。
[0021]本发明从塔宾曲霉中克隆得到一种新型脂肪酶Lip-Ι，其最适作用pH值为6.5，最适作用温度为40°C ;在？財.0-7.0的范围内能保留52.3%以上的酶活力，比对照组的脂肪酶Lip具有更宽泛的pH适用范围。本发明同时在脂肪酶Lip-1基础上进行突变，获得了三个单点突变体，所述突变体对胰蛋白酶的耐受性较突变前分别提高了 34.64%，36.30%和53.43%，因此更有利于其在饲料添加剂领域的应用。本发明所述脂肪酶Lip-1及其三个突变体均能有效提高饲料中油脂类物质的利用率，从而提高肉鸡的采食量和日增重，降低料肉比，提高养殖动物的生产性能，应用前景广泛。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为脂肪酶Lip-1和脂肪酶Lip最适作用pH-相对酶活曲线；
[0023]图2为脂肪酶Lip-1和脂肪酶Lip最适作用温度-相对酶活曲线。
【具体实施方式】
[0024]本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
[0025]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OFMICROB10L0GY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al.，2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(Hale etal.，2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。
[0026]除非另作说明，核酸是按5,至3,方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。
[0027]如本文所用，术语“脂肪酶”即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。其基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性决定于它的蛋白质结构。
[0028]如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因。
[0029]术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。
[0030]如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
[0031]术语“核酸”包括DNA、RNA,单链或双链的，以及它们的化学修饰物。
[0032]术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。
[0033]术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。
[0034]术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适 宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。
[0035]术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。
[0036]与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。
[0037]由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0038]术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。
[0039]下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0040]实施例1脂肪酶基因的扩增
[0041](I)提取塔宾曲霉总基因组DNA
[0042]将塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)接种摇瓶培养基过夜培养,取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min,弃上清；加入400 μ I抽提缓冲液(IOOmMTrisHCl, IOOmMEDTA, 250mMNaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠、在珠打仪剧烈振荡2min左右；水浴锅65°C水浴20min后加入200 μ 110MNH4AC冰浴IOmin ；13000rpm离心IOmin取上清，然后加入2倍体积的无水乙醇，_20°C放置30min ;13000rpm离心IOmin弃上清，用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入适量水溶解于_20°C保存。
[0043](2)基因克隆
[0044]以提取的基因组总DNA为模板利用引物[0045]at1-F AAAGGTACCATGTTCTCTGGACGGTTTG 和
[0046]at 1-R AGCTCTAGATTATAGCAGGCACTCGGAAATC)进行 PCR 扩增。PCR 扩增条件为950C 4min ；94°C 30S，59°C 40S，72°C lmin30 个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
[0047](3)基因测序分析及合成
[0048]将回收的扩增产物连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-ATL质粒并送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果，扩增产物的基因序列为SEQ ID N0:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，多个克隆的结果证明没有发生扩增错误。
[0049]经过NCBI Blast序列比对发现，SEQ ID NO:1与已公开的黑曲霉(Aspergillusniger)的脂肪酶序列 SEQ ID NO:3 (GenBank:BAL22280.1)相似性最高，为 98.3%，仅第 25位、第56位、第117位、第150位和第253位的氨基酸存在差异。
[0050]为了进一步验证本发明克隆得到的脂肪酶(命名为脂肪酶Lip-Ι)与SEQ ID NO:3所述脂肪酶(命名为脂肪酶Lip)在酶学性质上是否相同，依照里氏木霉的密码偏爱性而优化合成SEQ ID N0:3所述脂肪酶的编码基因，并且在合成序列5’和3’两端分别加上KpnI和XbaI两个酶切位点。上述基因合成工作由上海生工生物工程股份有限公司完成，合成后的基因序列为SEQ ID N0:4。
[0051 ] 实施例2表达载体的构建
[0052]将实施例1克隆得到的基因序列SEQ ID NO:2进行KpnI和XbaI过夜双酶切，然后凝胶回收目的基因片段；同样，对木霉表达载体PTG (含潮霉素hph基因)进行KpnI和XbaI双酶切和回收；将回收的基因片段和载体16°C过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，最后获得木霉重组表达质粒，分别命名为pTG-Lip-1。`
[0053]采用上述同样方法，构建得到携带SEQ ID NO: 4的重组表达质粒，命名为pTG_Lip。
[0054]实施例3转化和筛选
[0055](I)原生质体制备
[0056]接种里氏木霉(Trichoderma reesei )菌丝于PDA平板上生长4天；切取直径约3cm的菌落置于约60mlYEG (0.5%酵母粉、1%葡萄糖)的液体培养基中，30°C，200rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20ml裂解酶液(SigmaL1412)酶解
2-3小时；取出酶解液，加入0.7MNaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000rpm，离心 IOmin ;弃上清，加 10-20ml STC 液(20%蔗糖，50mM Tris-Cl, 50mM CaCl2)悬浮，然后3000rpm,离心IOmin ;加适量STC悬浮分装(150 μ I/管，IO8个/ml)。
[0057](2)转化与验证
[0058]取2yg表达质粒pTG-Lip-Ι加入含150 μ?原生质体管中，接着加入500 μ 125%PEG轻轻混匀，室温静置25min ;然后分2_3次再加lml25%PEG，轻轻混匀，室温静置25min，把原生质体加到50ml左右熔化后冷却至45-55 °C的上层半固体培养基(0.l%MgS04,1%KH2P04,0.6%(NH4)2SO4,1% 葡萄糖，18.3% 山梨醇，0.35% 琼脂糖)，轻轻混匀后倒入含100μ g/ml潮霉素下层基础培养基平板(2%葡萄糖，0.5%(NH4)2SO4,1.5%KH2P04，0.06%MgS04,0.06%CaCl2, 1.5%琼脂)，28°C黑暗培养数天至转化子长出。
[0059]挑取转化子过夜培养,取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min,弃上清；加入 400 μ I 抽提缓冲液(IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA, 250mM NaCl, 1%SDS);然后加 IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；651:水浴201^11后，加入20 1101 NH4AC,冰浴1Omin ;13000rpm离心1Omin,取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20°C放置30min ；13000rpm离心lOmin，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存。
[0060]以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用引物For-pri和Bac-pri进行PCR扩增目的基因进行验证。
[0061]For-pri:ATGTTCTCCGGCCGGTTTGG
[0062]Bac-pri:GCAGACACTCTGAAATAGCG
[0063]PCR扩增条件为 95°C 3min ；94°C 30s ；55°C 30s, 72°C 1.5min30 个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析；从测序正确的阳性转化子中挑选一株命名为里氏木霉Lip-1 (Trichoderma reesei Lip-1),该菌株能重组表达脂肪酶Lip-10
[0064]采用上述同样方法构建得到能重组表达脂肪酶Lip的重组菌株里氏木霉Lip(Trichoderma reesei LipX
[0065]实施例4发酵验证和酶学性质测定
[0066]4.1发酵验证
[0067]将上述两株里氏木霉工程菌(Lip-1，Lip)分别接种于丽发酵培养基(1.5%葡萄糖，1.7% 乳糖，2.5% 玉米浆，0.44%(NH4) 2S04,0.09%MgS04, 2%KH2P04,0.04%CaCl2，0.018% 吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000)，28O培养48小时，然后25°C培养48小时，取发酵液离心处理，将上清液分别进行酶活测定和酶活性质分析。
[0068]脂肪酶活力定义
[0069]1g固体酶粉(或Iml液体酶),在一定温度和pH条件下，Imin水解底物产生I μ mo I的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。
[0070]酶活测定方法:
[0071]取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶⑶中各加入底物溶液4.0Oml和磷酸缓冲液5.00ml，再 于A瓶中假如95%乙醇15.00ml，于40°C ±0.2°C水浴中预热5min，然后于A、B瓶中各加待测酶液1.00ml，立即混匀计时，准确反应15min后，于B瓶中立即补加95%乙醇15.0Oml终止反应，取出；于空白和样品溶液中各加酚酞指示液两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保存30s，不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。
[0072]脂肪酶的酶活力按下列公式计算:
[0073]
【权利要求】
1.一种脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2.一种编码权利要求1所述脂肪酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQID NO:2。
3.—种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求2所述的基因。
4.一种重组里氏木霉，其特征在于，所述的重组里氏木霉携带有权利要求3所述的重组质粒。
5.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述的脂肪酶突变体是权利要求1所述脂肪酶的142位氨基酸由Lys变为He。
6.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述的脂肪酶突变体是权利要求1所述脂肪酶的154位氨基酸由Lys变为Cys。
7.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述的脂肪酶突变体是权利要求1所述脂肪酶的的156位氨基酸由Lys变为Trp。
8.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求5-7任一项所述的脂肪酶突变体。
9.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求8所述的基因。
10.一种重组里氏木霉，其特征在于，所述的重组里氏木霉携带有权利要求9所述的重组质粒。`
【文档编号】C12N15/80GK103773746SQ201410001214
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】吴秀秀, 张青, 李宾, 王华明 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司