一种刺参科17种经济海参基于coi基因的pcr-rflp鉴别方法
【专利摘要】本发明公开了一种刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法。它包括a、以待检测刺参科海参作为检测样品，提取其DNA，以其作为模板，利用引物COIe-F:5`-ATA?ATGATAGGAGGRTTTGG-3`，COIe-R:5`-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3`PCR扩增出CO?I片段，所述的R为A/G；b、用限制性内切酶组合DdeI/SfcI或BstNI/Sau3AI对COI片段进行酶切，酶切产物进行电泳，估算待检测样品各电泳条带大小，将电泳图中的电泳条带数量及条带大小的估算值与17种海参的标准带谱进行对比，查找到电泳条带数量及大小均与标准谱带匹配的，该标准谱带所代表的种类即为被检测样品的种类。本发明适用范围广，操作简单，检测准确、快速，尤其适用于大批量商品海参的鉴定，从而为刺参科海参样品的鉴定提供科学方法，为规范海参商品市场和保护海参资源提供技术支持。
【专利说明】—种刺参科1 7种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种简便的海参种类分子鉴定方法，具体涉及一种刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法。
【背景技术】:
[0002]海参具有较高的营养价值和药用价值，在我国被认为是传统的美味和滋补品，位列“八珍”之一。全球记录的海参种类有1400多种，而可供食用的海参种类约50多种，主要是海参科(Holothuriidae)和刺参科(Stichopodidae)种类。与海参科种类相比，刺参科海参背面有较大疣足，骨片多为桌形体，无扣状体，但有C形体或双分枝杆状体，或简单颗粒体。作为名贵的海产品，海参在市场上通常加工为干品或冻品出售，海参经过多道工序加工成干品后，很难从外部形体上分辨出其种类。目前在市面上销售的海参产品，大多根据其颜色和产地来命名贴标，如“美国红参”、“非洲海参”等，缺乏规范的商品命名，海参市场贴标混乱。因此，非常有必要开发出准确区分和鉴定海参种类的方法。
[0003]线粒体DNACOI序列被广泛应用在海参系统进化和种类鉴定的研究中，C0IPCR-RFLP是一种操作简单、快捷的种类鉴别方法，目前该方法在海参种类鉴定中应用较少，缺乏系统研究。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的是提供一种适用范围广，操作简单，对仪器设备要求低，检测准确、快速，尤其适用于大批量商品海参鉴定的刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法。
[0005]本发明的刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006]a、以待检测刺参科海参作为检测样品，提取其DNA，然后以其作为模板，利用引物COIe-F: 5' -ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3'，COIe-R: 5' -GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3' PCR 扩增出COI片段，所述的R为A/G;
[0007]b、用限制性内切酶组合Ddel/Sfcl或BstNI/Sau3AI对COI片段进行酶切，酶切产物进行电泳，估算待检测样品各电泳条带大小，将电泳图中的电泳条带数量及条带大小的估算值与下表所示17种海参的标准带谱进行对比，查找到电泳条带数量及大小均与标准谱带匹配的，
[0008]该标准谱带所代表的种类即为被检测样品的种类:
[0009]
【权利要求】
1.一种刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法，其特征在于，包括以下 步骤: a、以待检测刺参科海参作为检测样品，提取其DNA，然后以其作为模板，利用引物COIe-F: 5' -ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3'，COIe-R: 5' -GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3'PCR 扩增出 COI片段，所述的R为A/G; b、用限制性内切酶组合Ddel/Sfcl或BstNI/Sau3AI对COI片段进行酶切，酶切产物进行电泳，估算待检测样品各电泳条带大小，将电泳图中的电泳条带数量及条带大小的估算值与下表所示17种海参的标准带谱进行对比，查找到电泳条带数量及大小均与标准谱带匹配的， 该标准谱带所代表的种类即为被检测样品的种类:
2.根据权利要求1所述的刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法，其特征在于，所述的步骤a的PCR扩增出COI片段为:PCR反应体积为50 μ L，包含 37.6μ L 无菌 7jC, 5 μ LlOXPCRBuffer, I μ LlOuMCOIe-F 引物，I μ LlOuMCOIe-R 引物，4μ L2.5mMdNTPmixture，0.4μ L5U/y LTaq?酶，I μ LDNA模板；PCR反应条件为，先94°C预变性2分钟，而后94°C变性30秒，48°C复性30秒和72°C延伸45秒，共35个循环，最后72°C延伸7分钟，得COI片段。
3.根据权利要求1所述的刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法，其特征在于，所述的步骤b的用限制性内切酶组合Ddel/Sfcl或BstNI/Sau3AI对COI片段进行酶切具体为:限制性内切酶Ddel/Sfcl酶切反应体积为20 μ L，包含2 μ LlO X buffer，SfcI和DdeI各3U，16 μ LCOI片段，余量为水，反应条件为37°C温浴2个小时；限制性内切酶 BstNI/Sau3AI 酶切反应体积为 20 μ L，包含 2 μ LlO X buffer，BstNI 和 Sau3AI 各 4U,16 μ LCOI片段，余量为水，反应条件为先37°C温浴I个小时，随后60°C温浴I个小时。
【文档编号】C12Q1/68GK103923972SQ201410010808
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】夏建军, 胡超群, 任春华, 罗鹏, 于宗赫 申请人:中国科学院南海海洋研究所