西尼罗病毒的荧光定量rt-pcr检测试剂、试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，所述检测试剂是针对以西尼罗病毒E基因的保守片段为靶目标的，包括一对特异性引物、一条特异性探针和一条内标探针。试剂盒包括PCR混合液、Taq?DNA聚合酶、DEPC-H2O、阳性质控品、阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液；其中PCR混合液中含有一对特异性引物、一条特异性探针和一条内标探针。检测方法包括：总RNA提取、反应组分配制、标准品稀释制作标准曲线、扩增、结果判定。本发明的试剂和试剂盒特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对低含量西尼罗病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，检测方法快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品。
【专利说明】西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]西尼罗病毒病是一种烈性人畜共患传染病，会导致严重的公共卫生问题。西尼罗河病毒可以通过蚊或蜱等血媒介传播，大多缺乏有效的治疗和预防措施，给疾病控制提出了严峻的挑战。西尼罗病毒血清学诊断方法较多，但这些方法都有一定得局限性。比如ELISA不是特异诊断方法，只能用于病毒抗体的筛查，不能进行确诊；特异的蚀斑减少中和试验操作较繁，费时费力，难以应用于大规模普查。西尼罗病毒核酸检测方法主要有普通RT-PCR方法，但是其在检马脑组织病料时，敏感性差。此方法还有一个很大的缺点:就是易污染、易出现假阳性现象。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对低含量西尼罗病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂和西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
[0004]本发明进一步要解决的问题在于，提供一种快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测方法。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0006]一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，所述检测试剂是针对以西尼罗病毒E基因的保守片段为靶目标的，包括:
[0007]引物:WNV-PF909:5' -CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3'
[0008]WNV-PR999:5/ -GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3;
[0009]探针:WNV-PB941:5' -CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3'
[0010]内标探针:WNV-PBIC:5' -CTGCAGGCAACGCAGCCGTCACC-3'，
[0011]所述探针和内标探针的5'端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3'端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。
[0012]所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为:
[0013]CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
[0014]所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，所述探针5'端标记的荧光报告基团是FAM,所述探针的3'端标记的突光淬灭基团为BHQl ;所述内标探针的5'端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3'端标记的荧光淬灭基团为BHQl。
[0015]所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂中，还包括作为内标的假病毒，用于制作所述假病毒的内标核苷酸序列为:
[0016]CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCC GTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
[0017]一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、DEPC-H2O,阳性质控品、阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液；
[0018]其中，所述PCR混合液中包含:
[0019]引物:WNV-PF909:5' -CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3'
[0020]WNV-PR999:5/ -GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3;
[0021]探针:WNV-PB941:5' -CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3'
[0022]所述假病毒内标溶液中包含:内标核苷酸序列制作的假病毒；
[0023]所述探针和内标探针的5'端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3'端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团；
[0024]所述引物和探针对应于西尼罗病毒E基因的保守片段，所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为: [0025]CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
[0026]所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒中，所述探针5'端标记的荧光报告基团是FAM,所述探针的3'端标记的突光淬灭基团为BHQl ;所述内标探针的5'端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3'端标记的荧光淬灭基团为BHQl。
[0027]所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒中，用于制作假病毒的内标核苷酸序列为:
[0028]CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
[0029]所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒中，优选各种试剂的含量为:
[0030]
【权利要求】
1.一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂是针对以西尼罗病毒E基因的保守片段为靶目标的，包括:
弓丨物:WNV-PF909: 5' -CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3'
WNV-PR999: 5' -GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3'
探针:WNV-PB941:5/ -CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3' 内标探针:WNV-PBIC:5/ -CTGCAGGCAACGCAGCCGTCACC-3'， 所述探针和内标探针的5'端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3'端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团； 所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为:
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
2.根据权利要求1所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于，所述探针5'端标记的突光报告基团是FAM,所述探针的3'端标记的突光淬灭基团为BHQl ;所述内标探针的5'端标记的突光报告基团是HEX,所述内标探针的3'端标记的突光淬灭基团为BHQl。
3.根据权利要求1所述的西尼 罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括作为内标的假病毒，用于制作所述假病毒的内标核苷酸序列为:
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
4.一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR混合液、TaqDNA聚合酶、AMV酶、DEPC-H2O,阳性质控品、阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液； 其中，所述PCR混合液中包含:
弓丨物:WNV-PF909: 5' -CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3'
WNV-PR999: 5' -GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3' 探针:.ν-ΡΒ941:5' -CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3' 所述假病毒内标溶液中包含:内标核苷酸序列制作的假病毒； 所述探针和内标探针的5'端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3'端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团； 所述引物和探针对应于西尼罗病毒E基因的保守片段，所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为:
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
5.根据权利要求4所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3'端标记的荧光淬灭基团为BHQl ；所述内标探针的5'端标记的突光报告基团是HEX,所述内标探针的3'端标记的突光淬灭基团为BHQl。
6.根据权利要求5所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，用于制作假病毒的内标核苷酸序列为:
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
7.根据权利要求5所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中各种试剂的含量为:
8.—种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，采用权利要求4的试剂盒，检测方法包括以下步骤: (1)、总RNA提取:在待测样品中加入假病毒内标溶液后，提取待测样品的RNA，得到模板RNA溶液； (2 )、反应组分配制:分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、模板RNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、TaqDNA聚合酶、AMV酶、阳性质控品和DEPC-H2O制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、阴性质控品和DEPC-H2O制成阴性对照物； (3)、标准品稀释制作标准曲线:对定量用标准品进行多种比例的稀释后制作标准曲线.-^4 ， (4)、扩增:分别将检测物、阳性对照物和阴性对照物放入PCR仪进行扩增，首先50°C下反转录20min,接着95°C预变性3min, 95°C下变性IOsec,在60°C下退火延伸45sec,采集荧光信号，进行40个PCR循环； (5)结果判定:根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果；当内标检测结果的Ct值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效；若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时结果无效，需重复此样本的检测。
9.根据权利要求8所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中，判定结果包括定性结果判定和定量结果判定； 所述定性结果判定为: Ct值> 40.0或无扩增曲线，表示样品中无西尼罗病毒； Ct值< 35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在西尼罗病毒； Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性； 所述定量结果判断为:先根据标准品稀释制作标准曲线，对定量用标准品进行多种比例的稀释后与未知样品同时做荧光PCR检测；然后根据已知量，计算出各个浓度对应的核酸拷贝数；以标准品的核酸拷贝数的对数值为Y轴，荧光PCR检测的Ct值为X轴作回归曲线，获得标准曲线；将样品的检测Ct值代入标准曲线公式算出未知样品的核酸浓度。
【文档编号】C12Q1/68GK103773896SQ201410014796
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】翟建新, 花群义, 朱志杰, 张利 申请人:深圳澳东检验检测科技有限公司