一种提高大肠杆菌耐热性的分子调控方法
【专利摘要】针对现代生物医药与轻工业食品产业体系中，微生物控温发酵生产过程高能耗的问题。本发明提供了一种提高大肠杆菌耐热性的分子调控方法，属于生物化工领域。以嗜热菌和耐热菌热激蛋白、泛素、热诱导转录因子基因作为核心功能元件，不同强度启动子作为调控元件，通过单功能、簇状、多功能串联3种方式组装耐热元器件，并实现与底盘宿主大肠杆菌的集成。通过梯度升温和恒定高温培养发酵表征元器件的耐热性，根据工程菌不同耐热温度范围，将耐热元件划分为强、中、弱三类，实现大肠杆菌在分子水平上不同耐热程度的调控。为工业发酵生产生物基产品的高效、低能耗过程提供了新方法。
【专利说明】一种提高大肠杆菌耐热性的分子调控方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及大肠杆菌耐热元器件的构建方法及其与底盘宿主的集成，实现分子水平上调控大肠杆菌耐热性，属于生物化工领域。
【背景技术】
[0002]微生物耐热性是决定发酵过程能量消耗和产物合成效率的重要因素。在利用微生物发酵生产生物制品的过程中，细胞新陈代谢释放出大量的热，发酵体系逐渐升温，无法自行降到反应所需的最适温度，所以需消耗大量冷却水控温，导致动力费用增加、发酵过程高能耗的问题。但与之矛盾的是，胞内大多数酶最适反应温度都高于最适生长温度，从反应热力学角度分析，提高温度可以有效地活化反应过程，加速代谢传质，提高细胞合成效率。所以提高发酵菌株耐热性，扩宽最适生长温度的范围将很好的解决这一矛盾，同时能够大幅度降低成本，提高生产效率。
[0003]大肠杆菌的基因操作简单，易于培养，生产成本低，是工业生物技术应用最广泛的工业生产菌株之一。因此，提高大肠杆菌的耐热性是获得低成本生物制品的有效途径。目前研究中，主要通过高温筛选或驯化的方式提高大肠杆菌耐热性，但这种方法只能提高最适生长温度，无法扩宽最适生长温度范围，不能满足工业发酵逐渐升温的需求。对于分子层面上的研究，目前主要通过调控大肠杆菌自身一些转录因子或蛋白表达来提高耐热性，此方法受限于大肠杆菌本身的耐热机制，效果并不明显。而通过引入外源耐热机制分子水平上改造大肠杆菌的耐热性虽已有报道，但研究不系统，应用于工业梯度升温发酵还未见报道。
[0004]嗜热微生物大部分属古菌域，一般生活在地球上的极热环境中，代表了生命温度的极限，部分耐热的机理已经得到合理的阐述，比如特殊细胞膜组成成分、更紧密的蛋白质空间结构、热诱导转录因子、热激蛋白(HSP)等。其中产生大量热激蛋白是一种重要的分子调控手段，其不仅在热胁迫下能够有效的保护细胞，对于有机溶剂、酸性环境等胁迫也能发挥其生理生化功能。目前，将 热保护机制中的关键的基因开发成具有耐热功能的分子元器件来改造大肠杆菌的耐热性，并且应用于工业生产的发酵过程还未见有文献报道。
[0005]基于近年来合成生物学快速发展，发掘了不同强度的耐热元器件并进行人工设计及优化，对大肠杆菌进行分子水平的调控，提高了其耐热性。应用于微生物发酵生产过程，将大幅度提高生产强度，降低成本。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是通过提高大肠杆菌耐热性，解决其在工业发酵过程中由于控制常温发酵导致生产过程高能耗的问题，降低生产成本。
[0007]为实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种构建耐热元器件及耐热大肠杆菌的方法，实现从分子水平上调控大肠杆菌的耐热性。从嗜热菌和耐热菌中通过克隆或人工合成得到一系列对细胞具有热保护功能的基因作为功能元件，如热激蛋白(HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、smHSP)、泛素和热诱导转录因子基因等，同时以大肠杆菌不同强度启动子和终止子作为调控元件，通过以下3种不同的组装方式构建耐热元器件。(I)以单个功能元件和调控元件组装成耐热元器件:启动子-功能元件-终止子。(2)针对耐热功能互作的功能元件共组装成簇状耐热元器件:启动子-功能元件1-功能元件2…功能元件η-终止子(n ^ 2)。(3)针对具有不同热保护功能的耐热功能元件组装成串联型耐热元器件:启动子1-功能元件1-启动子2-功能元件2...启动子η-功能元件η-终止子(n ^ 2)。将构建的所有耐热元器件连接载体后，转化大肠杆菌，实现耐热元器件与底盘宿主大肠杆菌的集成，以拓宽大肠杆菌的最适生长温度范围，提高其耐热性。通过梯度升温发酵及恒定高温发酵表征工程菌耐热性，根据耐热温度范围，将所有耐热元器件划分为强、中、弱三类，可实现大肠杆菌不同耐热程度的分子调控。
[0008]本发明的提高大肠杆菌耐热性的分子调控方法，具有以下优点:
[0009]1、本发明构建的耐热元器件实现了大肠杆菌不同程度耐热性的分子调控，满足了不同发酵生产要求。
[0010]2、本发明构建的耐热大肠杆菌工程菌，简化了发酵工艺，降低了生产成本，达到节能减排的目的。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0012]实施例1:单功能元件耐热元器件组装
[0013]通过NCB1、HSPIA等数据库查阅已完成测序的嗜热和耐热微生物以及相关具有热保护功能基因，选取热激蛋白、泛素和热诱导转录因子基因作为功能元件。以腾冲嗜热菌HSP20家族基因IbpA为例，`与启动子和终止子进行两次OE-PCR连接组装耐热元器件:启动子-1bpA-终止子。启动子与终止子两端分别设置Bgl II和Xho I酶切位点作为所有耐热元器件的酶切位点，耐热元器件与pET-28a(+)载体双酶切后进行连接，转入大肠杆菌，实现与底盘宿主大肠杆菌的集成。
[0014]实施例2:簇状耐热元器件组装
[0015]NCB1、HSPIA等数据库获得的功能元件中，有部分功能元件通过互相协作行驶正常的生理生化功能。以热激蛋白DnaK/DnaJ系统为例，DnaJ携带错误折叠的蛋白质结合到DnaK单体的ATP位点，帮助蛋白质正确折叠。通过OE-PCR和酶切连接的方式连接构建耐热元器件:启动子-DnaK-DnaJ-终止子。启动子与终止子两端分别设置Bgl II和Xho I酶切位点，耐热元器件与pET-28a(+)载体双酶切后进行连接，转入大肠杆菌获得耐热的工程菌。其他具有互作功能的元件采用同样的方式构建耐热元器件。
[0016]实施例3:多功能串联型耐热元器件组装
[0017]不同的功能元件对细胞具有不同的保护作用，以热诱导转录因子和热激蛋白为例，热诱导转录因子能在高温胁迫下转录翻译，激活细胞内的特殊热保护机制，平衡高温环境下的代谢平衡。热激蛋白最基本的功能是与高温环境下的变性的蛋白质结合，修复错误折叠的蛋白并维持空间构象和功能，防止其受到环境的损害。通过OE-PCR和酶切连接的方式连接构建耐热元器件:启动子1-热诱导转录因子-启动子2-热激蛋白-终止子。启动子I与终止子两端分别设置Bgl II和Xho I酶切位点，与载体双酶切后进行连接，转入大肠杆菌获得耐热的工程菌。其他功能的元件采用同样的方式构建耐热元器件。
[0018]实施例4:耐热元器件的验证及分类
[0019]通过工程菌高温发酵表征所有元器件的耐热性。37°C培养工程菌菌液OD6tltl达到
1.0左右后，通过两种方式进行高温培养发酵:第一种方法以3°C为一个温度梯度，逐步提高培养温度至40°C、43°C、46°C，每个温度梯度培养3h ;第二种方法将OD6tltl达到1.0左右的工程菌菌液直接放入40°C、43°C、46°C进行恒定高温培养。以0D_值的变化来表征耐热性，确定耐热范围，并将耐热元器件分为?强(37V -46°C)、中(37°C _43°C )、弱(37°C _40°C )三类。比如，元器件“启动子-1bpA-终止子”的耐热范围为37°C _46°C，划分为“强”耐热元器件类型；元器件“启动子-ThiF-终止子”的耐热范围为37°C _43°C，划分为“中”耐热元器件类型。
【权利要求】
1.一种提高大肠杆菌耐热性的分子调控方法，其特征在于，从嗜热菌和耐热菌中通过克隆或人工合成得到对细胞具有热保护功能的基因作为功能元件，以不同方式构建耐热元器件，提高大肠杆菌耐热性，将耐热元器件划分为强、中、弱三类，实现大肠杆菌不同耐热程度的分子调控。
2.如权利要求1所述的实现分子调控的耐热元器件的构建，通过3种方式构建耐热元器件:(I)以单个功能元件和调控元件组装成耐热元器件；(2)针对耐热功能互作的功能元件共组装成簇状耐热元器件；(3)针对具有不同热保护功能的耐热功能元件组装成串联型耐热元器件。
3.如权利要求2所述的耐热元器件及其 构建方法在提高大肠杆菌耐热性方面的应用。
【文档编号】C12N15/70GK103773791SQ201410020497
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】李春, 孙翔英, 刘月芹, 孙欢, 贾海洋, 周晓宏 申请人:北京理工大学