用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法，属于基因检测【技术领域】。本发明公开了用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1、GJB2-M2或GJB2-M3、GJB2-M4和GJB2-M5筛查的引物和探针及其使用方法，用于人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1或GJB3-M2筛查的引物和探针及其使用方法，用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1和SLC26A4-M2筛查的引物和探针及其使用方法。本发明提供的引物和探针及其使用方法，可以在同一次PCR反应中检测多个样本，相比传统的检测方法具有准确率高、步骤少，耗时少的优点。
【专利说明】用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因检测【技术领域】，特别涉及用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法。
【背景技术】
[0002]耳聋是严重影响人类健康的一种常见疾病，也是临床上最常见的遗传性疾病之一，因其病因复杂、发生率高且治疗困难，从而极大的影响着患者的人际交往与生活质量。据统计，耳聋在新生儿中的发病率约为1%。~3%。，全世界约有7000万人罹患不同程度的听力缺损，而我国是世界上听力障碍人口最多的国家，在全国各类残疾人中，听力残疾约占总数的24%，累及全国数千万个家庭。
[0003]耳聋的致病因素有很多，包括遗传因素和环境因素等，其中约50%_60%由遗传因素导致，即遗传性耳聋。在大量迟发性听力下降的患者中，许多也是由于自身基因缺陷或由于基因缺陷和多态性造成对环境因素的易感性增加而致病。根据是否伴有耳外组织的异常或病变，遗传性耳聋分为综合征性耳聋(SHL)和非综合征性耳聋(NSHL)，其中NSHL占70%甚至更多。而根据遗传方式的不同又可将遗传性耳聋分为常染色体显性遗传(DFNA)、常染色体隐性遗传(DFNB)、X连锁遗传、Y连锁遗传及线粒体遗传五类，其中以DFNB最为常见，约占60%~75% ;其次为DFNA，约占20%~30%。一般情况下，DFNB多表现为语前聋或先天性耳聋，DFNA多表现为语后聋或渐进性听力下降。
[0004]随着基因组学以及分子生物学技术的迅猛发展，对于遗传性耳聋相关基因及发病机制的研究已经取得了很大的进展。研究发现，在70%~80%的遗传性耳聋患者中可发现致聋基因突变，已知有数百个基因与遗传性耳聋有关，且绝大多数的遗传性耳聋为单基因病，而耳聋相关的遗传基因突变在正常群体中也并不少见，在我国现有人口中，携带遗传性致聋基因的比例约为6%。研究结果还表明，遗传性耳聋的致病基因及同一基因的突变位点在不同种族，甚至在同一种族的不同地区的人群中都不完全相同。目前，欧美发达国家列入耳聋致病基因临床检测的项目包括EYAl、TIMM8A、GJB2、GJB6、SLC26A4、USH2A、USH3A、P0U3F4、WFS1、COCH、OTOF, TECTA以及线粒体DNA CmtDNA)等，但最普遍也是最基本的检测项目是GJB2、GJB6、SLC26A4、COCH和mtDNA基因的突变检测。而国内进行的耳聋分子流行病学调查结果显示，我国大部分的遗传性耳聋主要由GJB2、GJB3、SLC26A4以及mtDNA等为数不多的几个基因突变引起，对这几个基因进行遗传学检测可以明确耳聋人群中40%的遗传学病因，结合家族史 分析和查体可以诊断95%以上的遗传性耳聋，这为我国耳聋致病基因筛查以及临床基因诊断工作的大规模开展提供了理论依据。
[0005]GJB2基因定位于13qll2ql2上，含2个外显子，是NSHL最常见的致病基因，已被证实与常染色体隐性遗传性耳聋(DFNBl)和显性遗传性耳聋(DFNA3)有关，其编码的连接蛋白26 (conneXin26)表达于耳蜗，参与细胞间信号介导和离子传递。突变的GJB2基因可导致连接蛋白异常，进而影响细胞间隙的连接功能，引起内耳钾离子回收障碍而致耳聋。GJB2基因突变是中国人散发性先天性耳聋的主要病因，且有26%-33%的语前聋患儿为GJB2基因突变所致。目前在NSHL病人中已经发现了 100多种GJB2基因突变类型，其主要突变类型包括 35delG、167delT、235delC、V371、299-300delAT、R143W、W24X 等，这些突变类型在不同种族人群中的发生频率和分布情况差异很大，其中35delG为高加索人的致病热点突变，而我国的致病热点突变则为235delC。
[0006]GJB3基因于1998年由夏家辉等研究中国两个常染色体显性遗传非综合征性耳聋的家系时定位并克隆，该基因定位于人类染色体1ρ33-ρ35，编码由270个氨基酸组成的连接蛋白31 (connexin31)。GJB3突变既可导致DFNA，又可导致DFNB，其错义突变E183K和无义突变R180X被认为与高频听力下降有关，复合杂合突变423-425delATT和423A-G能导致隐性非综合征性耳聋。多项研究结果表明，GJB3基因突变在中国耳聋人群中的携带率约为3% ο
[0007]SLC26A4基因定位于7q31，亦称PDS基因，含21个外显子，是Pendred综合征和大前庭水管综合征的致病基因。SLC26A4基因编码的Pendred蛋白主要由疏水性氨基酸组成，其功能主要是参与碘/氯离子的转运。SLC26A4的突变导致Pendred蛋白发生异常，既可影响细胞内外阴离子的转运，从而影响声音传递而导致听力损失。在中国大陆，大前庭水管综合征患者SLC26A4基因突变检出率为97.9%，高于韩国(78%)、日本(92%)和欧洲(40%)。全国分子流行病学研究结果表明，中国人群的SLC26A4基因具有独特的突变谱，其IVS7-2A>G突变是大前庭水管综合征中的高发突变，在聋人群体中的检出率达到14.3%，占所有SLC26A4突变的45-60%，其次为第19外显子上的2168A>G突变。而在欧美国家耳聋患者中最常见的T416P、IVS8+1G>A、L236P等SLC26A4基因突变，在中国大前庭水管综合征患者中却鲜有发现。
[0008]综上所述，对遗传性耳聋致病基因GJB2、GJB3和SLC26A4的热点突变进行筛查，明确患者耳聋病因，依据基因检测结果指导临床医生及患者的疾病治疗情况以规避耳聋风险，对夫妻双方均为遗传性耳聋致病基因携带者的胎儿进行产前诊断，对于我国防治遗传性耳聋、推进优生优育、提高人口素质具有重要意义。目前，对遗传性耳聋致病基因进行检测的方法包括限制性片段长度多·态性分析(RFLP)，变性高效液相色谱分析(DHPLC)，直接测序法等，这些方法或者不能定性，或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是这些方法难以同时对不同基因或同一基因的多个突变位点进行检测。由于遗传性耳聋具有遗传异质性强、突变位点多以及人群患病率及携带致病基因比例高等特点，因此有必要建立一种高通量、高效率的基因突变检测方法，以实现临床快速检测或大规模的人群筛查。基因芯片技术用于遗传性耳聋致病基因检测，具有通量高、自动化程度高等优点，但存在重复性差、易产生交叉污染从而造成假阳性结果等缺点。Real-Time PCR法在实时荧光定量PCR平台上进行闭管检测，能够有效克服PCR产物遗留污染的问题，且操作简便、快捷，根据引物和探针的优化设计，可同时检测多个样品不同基因或同一基因的多个突变位点，能够有效的应用于遗传性耳聋致病基因检测，是一种极具潜力的耳聋基因检测工具。
【发明内容】
[0009]为解决上述问题，本发明提出了一种用于人类耳聋多基因突变筛查的引物、探针及其使用方法。
[0010]一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1筛查的引物和探针，所述的引物和探针如下:
[0011]所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的DNA序列，Primer-R为序列表中SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示的DNA序列；
[0012]所述的探针为Probe-1和Probe-2，其中Probe-1为序列表中SEQ ID N0.38或SEQID N0.40所示的DNA序列；Probe_2为序列表中SEQ ID N0.39或SEQ ID N0.41所示的DNA序列；
[0013]其中，所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第30-35位碱基G的缺失。
[0014]上述用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1筛查的引物和探针的使用方法，包括如下步骤:
[0015]步骤1:样品的DNA提取；
[0016]步骤2:荧光PCR扩增:
[0017]PCR体系如下:
[0018]
【权利要求】
1.一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1筛查的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针如下: 所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID N0.1或SEQID N0.2所示的DNA序列，Primer-R为序列表中SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示的DNA序列； 所述的探针为Probe-1和Probe-2，其中Probe-1为序列表中SEQ ID N0.38或SEQ IDN0.40所示的DNA序列；Probe-2为序列表中SEQ ID N0.39或SEQ ID N0.41所示的DNA序列； 其中，所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第30-35位碱基G的缺失。
2.权利要求1所述的用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1筛查的引物和探针的使用方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1:样品的DNA提取； 步骤2:荧光PCR扩增: PCR体系如下:
IOX PCR缓沖霞5μ?MgCfc5.0 ~ICLOnimoldNTPs0,8 ~i Jmmol·Primer-FO, I ~I ,Ομηιο IPrimcr-RO, I ~I ,ΟμηιοIProbe-10.5 ~!.Ομηιο IProbe-20.5 ~1.ΟμηιοΙ
Taq _2.0~3.0 U
DNA40 ~_Eg
加水个:SOpL PCR反应条件如下: 95°C预变性5分钟；95°C变性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93°C变性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31个循环； 其中，Primer-F为序列表中SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的DNA序列；Primer-R为序列表中SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示的DNA序列；Probe-1为序列表中SEQ ID N0.38或 SEQ ID N0.40 所示的 DNA 序列；Probe_2 为序列表中 SEQ ID N0.39 或 SEQ ID N0.41 所不的DNA序列； 步骤3:检测: 采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线； 步骤4:结果判定:根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线，判断样品提供者的GJB2基因突变情况: 如果样品孔只有FAM信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M1纯合突变； 如果样品孔只有HEX信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M1野生型； 如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M1杂合突变； 其中，所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M1为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第30-35位碱基G的缺失。
3.—种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2或GJB2-M3筛查的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针如下: 所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID N0.5或SEQID N0.6所示的DNA序列；Primer_R为序列表中SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.8所示的DNA序列； 所述的探针为 Probe-l> Probe-2> Probe-3 和 Probe-4, Probe-1 为序列表中 SEQ IDN0.42所示的DNA序列；Probe-2为序列表中SEQ ID N0.43所示的DNA序列；Probe_3为序列表中SEQ ID N0.44所示的DNA序列；Probe_4为序列表中SEQ ID N0.45所示的DNA序列； 其中，所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第167位碱基T的缺失；所述的人类耳聋GJB2`基因突变GJB2-M3为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第176-191位16个碱基的缺失。
4.权利要求3所述的用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2或GJB2-M3筛查的引物和探针的使用方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1:样品的DNA提取； 步骤2:荧光PCR扩增: PCR体系如下:
IOX PCR缓冲液SpLMgCb5,0~ 10,OmmoldNTPs0,8 ~1,5mmolMmer-F0,1~1.Ομηιο?Priincr-R0.1 ~1.Ομηιο?Probe-10.5 ~1.ΟμηιοiProbc-20.5 ~Ι,ΟμηιοΙProbe-30.5 — 1.Ομηιο?Probc-4D.5 ~1.Ομηιο iTaq _2.0~3,0 U
DNA40 ~60ng
加水至50μΙ PCR反应条件如下: 95°C预变性5分钟；95°C变性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93°C变性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31个循环； 其中，Primer-F为序列表中SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.6所示的DNA序列；Primer-R为序列表中SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.8所示的DNA序列；Probe-1为序列表中SEQ ID N0.42所示的DNA序列；Probe-2为序列表中SEQ ID N0.43所示的DNA序列；Probe_3为序列表中SEQ ID N0.44所示的DNA序列；Probe_4为序列表中SEQ ID N0.45所示的DNA序列；· 步骤3:检测: 采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线； 步骤4:结果判定: 根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线，判断样品提供者的GJB2基因突变情况: 如果样品孔只有FAM信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M2或GJB2-M3纯合突变； 如果样品孔只有HEX信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M2或GJB2-M3野生型； 如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M2或GJB2-M3杂合突变； 其中，所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M2为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第167位碱基T的缺失；所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M3为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第176-191位16个碱基的缺失。
5.一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4筛查的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针如下: 所述的引物为Primer-F和Primer-R, Primer-F为序列表中SEQ ID N0.9或SEQ IDN0.10所示的DNA序列；Primer-R为序列表中SEQ ID N0.11或SEQ ID N0.12所示的DNA序列； 所述的探针为Probe-1和Probe-2，其中Probe-1为序列表中SEQ ID N0.46或SEQ IDN0.48所示的DNA序列；Probe-2为序列表中SEQ ID N0.47或SEQ ID N0.49所示的DNA序列； 其中，所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第233-235位碱基C的缺失。
6.权利要求5所述的用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4筛查的引物和探针的使用方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1:样品的DNA提取； 步骤2:荧光PCR扩增: PCR体系如下:
IOX PCR缓冲液5μ?MgCb5,0~ 10,OmmoldNTPsO J~IjmmolPrimcr-FO, I ~ I ,Ομηιο?Primer-R0.1 ~ I,Ομηιο?Probe-10,5~1,0μηιοΙProbe-20,5 ~L Ομηιο ITaq _2,0 ~3,0 U`
DNA40 ~60ng
加水至50μΙ PCR反应条件如下: 95°C预变性5分钟；95°C变性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93°C变性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31个循环； 其中，Primer-F 为序列表中 SEQ ID N0.9 或 SEQ ID N0.10 所示的 DNA 序列；Primer_R为序列表中SEQ ID N0.11或SEQ ID N0.12所示的DNA序列；Probe_l为序列表中SEQ IDN0.46 或 SEQ ID N0.48 所示的 DNA序列;Probe_2 为序列表中 SEQ ID N0.47 或 SEQ ID N0.49所示的DNA序列； 步骤3:检测: 采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线； 步骤4:结果判定: 根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线，判断样品提供者的GJB2基因突变情况: 如果样品孔只有FAM信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M4纯合突变； 如果样品孔只有HEX信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M4野生型； 如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M4杂合突变； 其中，所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M4为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第233-235位碱基C的缺失。
7.一种用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5筛查的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针如下: 所述的引物为 Primer-F 和 Primer-R, Primer-F 为序列表中 SEQ ID N0.13 或 SEQ IDN0.14所示的DNA序列；Primer-R为序列表中SEQ ID N0.15或SEQ ID N0.16所示的DNA序列； 所述的探针为Probe-1和Probe-2，其中Probe-1为序列表中SEQ ID N0.50或SEQ IDN0.52所示的DNA序列；Probe-2为序列表中SEQ ID N0.51或SEQ ID N0.53所示的DNA序列； 其中，所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第299-300位碱基AT的缺失。
8.权利要求7所述的用于人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5筛查的引物和探针的使用方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1:样品的DNA提取； 步骤2:荧光PCR扩增: PCR体系如下:
IOX PCR缓冲液5pLMgCIi5,0 ~l0.0mmol·dNTPs0.8 ~L5mmoiPri mer-F0.1 ~ I.Ομηιο IPrimer-R0.1 ~ 1.Ομηιο?Probe-10,5~ Ι,ΟμιηοΙProbc-20,5 ~丨,Ομηιο?Taqft2.0 ~3.0UDNA40 ~60ng
加水至50μΙ PCR反应条件如下: 95°C预变性5分钟；95°C变性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93°C变性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31个循环； 其中，Primer-F 为序列表中 SEQ ID N0.13 或 SEQ ID N0.14 所示的 DNA序列；Primer_R为序列表中SEQ ID N0.15或SEQ ID N0.16所示的DNA序列；Probe_l为序列表中SEQ IDN0.50 或 SEQ ID N0.52 所示的DNA序列;Probe_2 为序列表中 SEQ ID N0.51 或 SEQ ID N0.53所示的DNA序列； 步骤3:检测: 采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线； 步骤4:结果判定:根据步骤3得到的GJB2基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线，判断样品提供者的GJB2基因突变情况: 如果样品孔只有FAM信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M5纯合突变； 如果样品孔只有HEX信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M5野生型； 如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的GJB2基因为GJB2-M5杂合突变； 其中，所述的人类耳聋GJB2基因突变GJB2-M5为人类耳聋GJB2基因的第二外显子的第299-300位碱基AT的缺失。
9.一种用于人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1或GJB3-M2筛查的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针如下: 所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID N0.17或SEQID N0.18 所示的 DNA 序列；Primer_R 为序列表中 SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20、SEQ IDN0.21、SEQ ID N0.22 和 SEQ ID N0.23 中的任一个所示的 DNA 序列； 所述的探针为Probe-1、Probe-2> Probe-3和Probe-4,其中Probe-1为序列表中SEQID N0.54所示的DNA序列；Probe_2为序列表中SEQ ID N0.55所示的DNA序列；Probe_3为序列表中SEQ ID N0.56或SEQ ID N0.58所示的DNA序列；Probe_4为序列表中SEQ IDN0.57 或 SEQ ID N0.59 所示的 DNA 序列； 其中，所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的第538碱基由G变成T ;所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M2为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的的第547碱基由G变成A。
10.权利要求9所述的用于人类耳`聋GJB3基因突变GJB3-M1或GJB3-M2筛查的引物和探针的使用方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1:样品的DNA提取； 步骤2:荧光PCR扩增: PCR体系如下:IOXPCR缓冲液5μΙMgCK5.0 ~10,OmmoldNTPs0.8 SmmolPrimer-F0.1 ~I ,ΟμιτιοIPri mcr- RO,卜 1.Ομ mo IPro be-10.5 ~L Ομηιο IProbe-20.5 ~1.0μ_1Probe-30.5 ~I.Ομηιο?Probe-40.5 ~ 1.Ομηιο?TaqR2.0-3.0U
DNA40~60ng
加水中:50μ? PCR反应条件如下: 95°C预变性5分钟；95°C变性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93°C变性25秒，60°C退火35秒，·72°C延伸20秒，31个循环； 其中，Primer-F 为序列表中 SEQ ID N0.17 或 SEQ ID N0.18 所示的 DNA序列；Primer-R为序列表中 SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21、SEQ ID N0.22 和 SEQ ID N0.23中的任一个所示的DNA序列；Probe-l为序列表中SEQ ID N0.54所示的DNA序列；Probe_2为序列表中SEQ ID N0.55所示的DNA序列；Probe_3为序列表中SEQ ID N0.56或SEQ IDN0.58所示的DNA序列；Probe-4为序列表中SEQ ID N0.57或SEQ ID N0.59所示的DNA序列； 步骤3:检测: 采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到GJB3基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线； 步骤4:结果判定: 根据步骤3得到的GJB3基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线，判断样品提供者的GJB3基因突变情况: 如果样品孔只有FAM信号，表明样品提供者的GJB3基因为GJB3-M1或GJB3-M2纯合突变； 如果样品孔只有HEX信号，表明样品提供者的GJB3基因为GJB3-M1或GJB3-M2野生型； 如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的GJB3基因为GJB3-M1或GJB3-M2杂合突变； 其中，所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M1为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的第538碱基由G变成T ;所述的人类耳聋GJB3基因突变GJB3-M2为人类耳聋GJB3基因的第二外显子的第547碱基由G变成>A。
11.一种用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1筛查的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针如下: 所述的引物为Primer-F和Primer-R,其中Primer-F为序列表中SEQ ID N0.24或SEQID N0.25 所示的 DNA 序列；Primer-R 为序列表中 SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27、SEQ IDN0.28和SEQ ID N0.29中的任一个所示的DNA序列； 所述的探针为Probe-1和Probe-2，其中Probe-1为序列表中SEQ ID N0.60、SEQ IDN0.61和SEQ ID N0.62中的任一个所示的DNA序列；Probe_2为序列表中SEQ ID N0.63所不的DNA序列； 其中，所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1为人类耳聋SLC26A4基因的IVS7-2A>G0
12.权利要求11所述的用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1筛查的引物和探针的使用方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1:样品的DNA提取； 步骤2:荧光PCR扩增: PCR体系如下:
IOX PCR缓冲液SnLMgCIi5,0~MIOmmoldNTPs0.8 ~ LSmmol` Primcr-F0.1 ~1.Ομηιο? Primer-R0.1 — 1.Ομηιο IProbe-10,5 ~ 1.ΟμηιοIProbe-20.5 ~】Λμηιο I Taqjfi2,0 ~3.0 U
DNA40~60ng
_水至50μ[ PCR反应条件如下: 95°C预变性5分钟；95°C变性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93°C变性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31个循环； 其中，Primer-F 为序列表中 SEQ ID N0.24 或 SEQ ID N0.25 所示的 DNA序列；Primer-R为序列表中 SEQ ID N0.26,SEQ ID N0.27、SEQ ID N0.28 和 SEQ ID N0.29 中的任一个所示的 DNA 序列；Probe-l 为序列表中 SEQ ID N0.60,SEQ ID N0.61 和 SEQ ID N0.62 中的任一个所示的DNA序列；Probe-2为序列表中SEQ ID N0.63所示的DNA序列； 步骤3:检测: 采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线； 步骤4:结果判定: 根据步骤3得到的SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线，判断样品提供者的GJB3基因突变情况: 如果样品孔只有FAM信号，表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M1纯合突变；如果样品孔只有HEX信号，表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M1野生型；如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M1杂合突变； 其中，所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M1为人类耳聋SLC26A4基因的IVS7-2A>G0
13.—种用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2筛查的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针如下: 所述的引物为Primer-F和Primer-R，其中Primer-F为序列表中SEQ ID N0.30、SEQ IDN0.31和SEQ ID N0.32中的任一个所示的DNA序列；Primer_R为序列表中SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.35、SEQ ID N0.36 和 SEQ ID N0.37 中的任一个所示的 DNA 序列； 所述的探针为Probe-1和Probe-2，其中Probe-1为序列表中SEQ ID N0.64、SEQ IDN0.65、SEQ ID N0.66和SEQ ID N0.67中的任一个所示的DNA序列；Probe_2为序列表中SEQ ID N0.68所示的DNA序列； 其中，所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2为人类耳聋SLC26A4基因的第十九外显子的第2168碱基由A变成G。
14.权利要求13所述的用于人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2筛查的引物和探针的使用方法，其特征在于，包括如下步骤:· 步骤1:样品的DNA提取； 步骤2:荧光PCR扩增: PCR体系如下:
IOXPCR缓冲液5pLMgCb5,0 ~l0.0mmoldNTPsOJ ~ 1.Smmo I Prinier-FO,卜 1.0 μηιο I Primcr-RCU ~ I ,Ομηιο?Probc-10,5 ~I.0 μηιο IProbe-20,5 ~ 1.Ομηιο I Taq _2,0~3.0 U
DNA40 ~60r?g
加水.个:SOpL PCR反应条件如下: 95°C预变性5分钟；95°C变性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93°C变性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31个循环； 其中，Primer-F 为序列表中 SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.31 和 SEQ ID N0.32 中的任一个所示的DNA序列;Primer-R为序列表中 SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.35、SEQID N0.36和SEQ ID N0.37中的任一个所示的DNA序列；Probe_l为序列表中SEQ ID N0.64、SEQ ID N0.65、SEQ ID N0.66 和 SEQ ID N0.67 中的任一个所示的 DNA 序列；Probe_2 为序列表中SEQ ID N0.68所示的DNA序列； 步骤3:检测: 采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线； 步骤4:结果判定: 根据步骤3得到的SLC26A4基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线，判断样品提供者的GJB3基因突变情况: 如果样品孔只有FAM信号，表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M2纯合突变；如果样品孔只有HEX信号，表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M2野生型；如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的SLC26A4基因为SLC26A4-M2杂合突变； 其中，所述的人类耳聋SLC26A4基因突变SLC26A4-M2为人类耳聋SLC26A4基因的第十九外显子的第2168碱基由·A变成G。
【文档编号】C12N15/11GK103849682SQ201410027023
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】曾骥孟, 庄建立, 刘斌, 赖金娇 申请人:芮宝生物医药科技（厦门）有限公司