一株产紫青霉菌及其生物制剂和防治荔枝霜疫霉病的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物农药领域，公开了一株以荔枝内生微生物为筛选对象，分离得到的对荔枝霜疫霉病菌有显著抑制作用的荔枝内生产紫青霉菌及其生物制剂和防治荔枝霜疫霉病的应用。将该产紫青霉菌命名为产紫青霉（Penicillium?purpurogenum）GY-19，于2013年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC?NO:M2013738。该菌株来源于荔枝内生真菌，能很好地在荔枝果实表面定殖，对荔枝霜疫霉病菌具有强烈的抑制作用，具有优异的防治荔枝霜疫霉病的生防作用，且生物来源环保无毒性，对生态环境影响小，培养条件低，具有很好的开发应用前景。
【专利说明】一株产紫青霉菌及其生物制剂和防治荔枝霜疫霉病的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物农药领域，特别涉及一株以荔枝内生微生物为筛选对象，分离得到的对荔枝霜疫霉病菌有显著抑制作用的荔枝内生产紫青霉菌及其生物制剂和防治荔枝霜疫霉病的应用。
【背景技术】
[0002]荔枝(Litchi chinensis Sonn)是南方地区重要的亚热带经济作物，素有“中华之珍果”的美称，其经济价值高，是我国在国际市场上最具竞争力的果品之一。但是在我国荔枝主产区，由蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)引起的霜疫霉病是引起荔枝减产的最主要的病害之一。该病害的流行具有间接性爆发的特点，受气候影响较大，在适宜发病的年份，可引起荔枝80%以上的损失。目前，对荔枝霜疫霉病害控制的有效措施主要以化学防治为主，但是由于化学农药的大量使用所诱发的环境污染问题和病原物的抗药性问题日显突出，因而研究和开发低毒、无残留的生物源农药用于荔枝病害的防治，对于控制农残量、确保食用安全性和提高产品国际竞争力具有十分重要的意义。 [0003]青霉属(Penicillium spp.)和拟青霉属(Paecilomyces spp.)真菌是一种广谱性的拮抗菌，其代谢产物——青霉素作为抗菌素的一种，能够对多种人类病原细菌及植物病原真菌起到显著的抑制作用。王波等研究发现淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)作为重要的线虫寄生真菌，对根结线虫属、球孢囊线虫属、米穿刺线虫属和假根结线虫属等多种线虫有较强的侵染力；赵瑞等从红树林保护区的红海榄根际土壤中分离到一株青霉菌，其发酵液具有明显的抑菌抑制植物病原真菌生长的作用。对于产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum),吴长景等研究发现产紫青霉G59的两株突变体的新产活性产物具有显著的抗肿瘤活性；王涛等从土壤中分离得到的一株产紫青霉对稻痕病菌(Pyriculariaoryzae)有明显的抑菌作用。
[0004]因此，产紫青霉菌作为一类重要的自然资源，已引起广泛关注，具有开发生物农药的潜力。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有技术的缺点与不足，开发产紫青霉菌的应用，本发明的首要目的在于提供一株以荔枝内生微生物为筛选对象，分离得到的对荔枝霜疫霉病菌有显著抑制作用的蒸枝内生青霉菌，经鉴定为产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)GY-19,为蒸枝霜疫霉病的生物防治奠定基础。由于本发明从荔枝上筛选到的拮抗内生菌，将其用回荔枝病害的防治，仅仅表现为特定种群间某种微生物数量的增长或消减，并未改变荔枝上微生物种群的类别从而维持了种群的稳定性。同时，由于其与荔枝长期共存，互惠共生，形成了一系列与其相似的生存机制。
[0006]本发明另一目的在于提供一种基于上述荔枝内生产紫青霉菌制备得到的生物制剂。[0007]本发明再一目的在于提供上述荔枝内生产紫青霉菌在防治荔枝霜疫霉病中的应用。
[0008]本发明的目的通过下述方案实现:
[0009]一株产紫青霉菌，将其命名为产紫青霉(Penicillium purpurogenum) GY-19,保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址:中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCCN0:M2013738，保藏时间为2013年12月31日。
[0010]所述的产紫青霉菌在PDA培养基上25°C培养7d，菌落绒状，菌丝黄色，产孢面深绿色，后变为暗深绿色，背面红色或紫红色，分生孢子梗短而光滑，小梗披针形，分生孢子椭圆形至亚球形。
[0011 ] 一种生物制剂，基于上述产紫青霉菌制备得到。
[0012]所述的生物制剂由荔枝内生产紫青霉菌经液体发酵制备得到，优选包含以下步骤:将产紫青霉菌接种至PDB培养液中培养，所得菌悬液经离心，即可获得生物制剂。
[0013]所述TOB培养液的pH值为7.0。
[0014]所述的培养指在28~30°C，摇床震荡速率为180~200rpm下培养4d。
[0015]上述生物制剂在防治荔枝霜疫霉病中的应用。
[0016]上述洛枝内生广紫青霉囷在防治洛枝霜疫霉病中的应用。
[0017]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果:
[0018]( I)本发明得到的产紫青霉菌来源于荔枝内生真菌，能很好地在荔枝果实表面定殖；另外本发明从荔枝上筛选到的拮抗内生菌，将其用于荔枝病害的防治，仅仅表现为特定种群间某种微生物数量的增长或消减，并未改变荔枝上微生物种群的类别从而影响种群的稳定性，另外由于其与荔枝长期共存，互惠共生，形成了一系列与其相似的生存机制，将其喷施到荔枝表面用于病害的防治，对荔枝的食用及其加工产品来说更加安全可靠。
[0019](2)本发明的产紫青霉菌对荔枝霜疫霉病菌具有强烈的抑制作用，具有优异的防治荔枝霜疫霉病的生防作用，而且生物来源环保无毒性，对生态环境影响小。
[0020](3)本发明得到的产紫青霉菌，培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为产紫青霉GY-19在胡萝卜培养基上的正面图(A)和背面图(B)。
[0022]图2为产紫青霉GY-19的分生孢子(梗)图。
[0023]图3为产紫青霉GY-19对荔枝霜疫霉病菌的抑制作用效果图，其中，A为荔枝霜疫霉病菌正常生长菌落形态，B为产紫青霉菌对荔枝霜疫霉病菌的抑制图。
[0024]图4为产紫青霉GY-19及其生物制剂对荔枝霜疫霉的防治效果图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0026]实施例1:荔枝内生产紫青霉菌的分离、纯化和保藏
[0027](I)PDA培养基的配置:称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸0.5h，纱布过滤，再加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，1211:灭菌201^11，分装入培养皿中冷却后贮存备用。
[0028](2)荔枝内生产紫青霉菌的分离、纯化:
[0029]用于分离的荔枝果实样品分别采自华南农业大学园艺学院荔枝基地、深圳市麒麟山庄荔枝园和深圳市宝安农科果园，所选的荔枝品种为糯米糍、妃子笑和桂味三大主栽品种，分为三组。
[0030]参照常规组织分离法，并稍作修改:将健康的组织(叶片、果实)用自来水冲洗干净，晾干水分后剪成约2cmX2cm的小块，按照下列程序进行表面消毒:用70%的酒精漂洗(叶片35~45s,果皮40~50s),然后用5%次氯酸钠漂洗3~5min,最后用无菌水冲洗4次，在无菌滤纸上吸干水分后将组织块贴放于PDA平板上进行培养，每皿放5块组织块，每个处理3个重复，置于25°C培养箱中培养观察，随时挑取长出的菌落进行纯化。
[0031]采取漂洗液检验法(Schulz et al.，1993.)进行检验组织表面的消毒效果，取
0.2mL的最后一次的漂洗液涂布于LB固体平板上进行培养，观察培养有无菌落长出，若无菌落出现，证明材料表面灭菌彻底，否则分离结果不能使用。
[0032]将分离纯化所得菌株进行ITS序列分析，确定为产紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum),命名为产紫青霉菌株GY-19。所述产紫青霉菌株GY-19分离自深圳市麒麟山庄荔枝园的桂味品种的叶片，其序列如下所示:与GenBank中登陆号为JQ422620的Penicillium purpurogenum同源性达100%,证实其分类命名为产紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum),命名为产紫青霉(Penicillium purpurogenum) GY-19。序列片段如下:
[0033]CCAACCTCCCACCCTTGTCTCTATACACCTGTTGCTTTGGCGGGCCCACCGGGGCCACCTGGTCGCCGGGGGACATCTGTCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCGCTCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTGAGTACTATGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATC`TTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTGCGGTCCCCCCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACTCGCTCGGGAAGGACTGGCGGGGGTTGGTCACCACCAAAATTTTACCACGGT。
[0034]产紫青霉GY-19在PDA培养基上30°C培养，培养7d，菌落绒状，菌丝黄色，产孢面深绿色，后变为暗深绿色，背面红色或紫红色。分生孢子梗短而光滑，小梗披针形，分生孢子椭圆形至亚球形。(见图1A、B和图2)。
[0035](3)产紫青霉GY-19的保藏:将该菌株于2013年12月31日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:M2013738o
[0036]实施例2:对峙培养法测定产紫青霉菌的活性
[0037](I)PDA培养基的制备同实施例1 ;PDB液体培养基的制备除不加琼脂，其他与PDA固体培养基的配方相同，将称得的药剂充分溶解后分装于锥形瓶(每瓶IOOmL培养液)，加塞、包扎，121°C灭菌20min，冷却后贮存备用。
[0038](2)胡萝卜培养基的制备:称取200g胡萝卜，用榨汁机充分榨汁后用16层纱布过滤，滤液补足水分至1000mL,再加15g琼脂，充分加热溶解后分装于锥形瓶(每瓶IOOmL培养液)，121°C灭菌20min，冷却后贮存备用。
[0039](3)产紫青霉菌单菌落和菌碟的制备:用接种针挑取青霉菌丝于PDA培养基平板上，28°C培养4~5d，即得单菌落；用打孔器在产紫青霉菌菌落边缘打孔，即得圆形菌碟。[0040](4)产紫青霉菌发酵液(生物制剂)和滤液的制备:取步骤(3)制备得到的产紫青霉菌菌碟接入步骤(1)制备得到的PDB培养液锥形瓶中，置于30°C，摇床速率为200rpm下培养4d后于5000rpm离心IOmin,取上清液即得产紫青霉菌生物制剂,再用孔径为0.2 μ m的过滤器滤除菌体，获得产紫青霉无菌滤液。
[0041](5)荔枝霜疫霉病菌的培养及其孢子囊悬浮液的制备:接种编号为肇庆10的荔枝霜疫霉病菌至胡萝卜平板上培养7d后，用直径为5mm的打孔器打取菌落边缘的菌丝，接种至新鲜的胡萝卜平板上，于25°C下培养7d后，在平板中加入无菌水冲洗孢子囊并配制成所需浓度的孢子囊悬浮液。
[0042](6)活性测定:
[0043]①产紫青霉菌对荔枝霜疫霉病菌生长的抑制作用测定:将步骤(3)制得的产紫青霉菌划线接种到胡萝卜培养基平板的中央，在距该菌饼3cm处接种荔枝霜疫霉病菌的菌饼，实验中以不接种产紫青霉菌为对照，3个重复，置于25°C下恒温培养，当对照菌落直径达到6cm时，测量抑菌带宽度，结果如图3所示。
[0044]②产紫青霉菌对荔枝霜疫霉病菌孢子囊萌发的抑制作用的测定:将实施例1分离得到的产紫青霉菌菌株接种至步骤(1)制备得到的PDB液体培养基中摇菌，按照步骤(4)配制成浓度为IO2个/mL的产紫青霉菌发酵液和滤液，将发酵液、滤液分别与步骤(5)制得的孢子囊悬浮液浓度为4 X IO4个/mL的荔枝霜疫霉病菌孢子囊悬浮液等体积混合，并以无菌水、PDB与孢子囊悬浮液等体积混匀作为对照。取混合液100 μ L滴到无菌的凹面载片上，25°C保湿培养，4h后取出计算孢子囊的萌发率。
[0045]抑制率(％ )=(对照孢子囊萌发率-处理孢子囊萌发率)/对照孢子囊萌发率X 100
[0046]结果分析:
[0047]荔枝内生产紫青霉GY-19对荔枝霜疫霉病菌的生长具有明显的抑制作用。其中，本发明得到的菌株GY-19的发酵液及其滤液均对荔枝霜疫霉病菌的孢子囊萌发有极显著地抑制作用，抑菌率分别为100%和99.09%。
[0048]实施例3:荔枝内生产紫青霉GY-19防治荔枝霜疫霉病
[0049](I)PDA培养基的制备同实施例1。胡萝卜培养基和PDB液体培养基的制备同实施例2。
[0050](2)荔枝内生产紫青霉菌株GY-19发酵液和过滤液的制备、荔枝霜疫霉病菌培养及其孢子囊悬浮液的制备同实施例2。
[0051](3)挑取成熟度一致、大小均匀的荔枝健康果实，在流水中冲洗干净后，晾干，分别将荔枝果实在步骤(2)配制的产紫青霉菌发酵液及其无菌过滤液中浸泡大约5min，取出至液滴不再滴下，放入无菌保鲜盒中保湿处理。采用喷雾接种荔枝霜疫霉孢子囊的方法(IO4个/mL)，接种后于分别置于室温25°C和4°C (荔枝的储藏温度)培养，定期观察果实的发病情况。以清水处理、PDB培养液处理、只接产紫青霉菌生物制剂处理和只接荔枝霜疫霉病菌孢子囊悬浮液处理等4个处理作为对照。每个处理各选荔枝健果30颗，设置3个重复。
[0052]在平均温度25°C、相对湿度80%的条件下进行的室内接种试验，在接种36h后接有荔枝霜疫霉病菌的对照开始发病，而接种有产紫青霉菌生物制剂和产紫青霉菌过滤液的处理暂未发病；接种处理3d后，病菌对照的发病率为97.3%，而产紫青霉菌生物制剂及其滤液处理过的发病率仅为13.8%和18.9%，防治效果达到85.8%和80.6%。[0053]在平均温度4°C、相对湿度80%的条件下进行的室内接种试验，在储藏培养20d后的实验结果如表1和图4。
[0054]表1产紫青霉菌对荔枝贮藏期霜疫霉病的生防效果(4°C )
【权利要求】
1.一株产紫青霉菌,其特征在于将其命名为产紫青霉(Penicillium purpurogenum)GY-19，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址:中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC N0:M2013738，保藏时间为 2013 年 12 月 31 日。
2.根据权利要求1所述的产紫青霉菌，其特征在于:所述的产紫青霉菌在PDA培养基上25°C培养7d，菌落绒状，菌丝黄色，产孢面深绿色，后变为暗深绿色，背面红色或紫红色，分生孢子梗短而光滑，小梗披针形，分生孢子椭圆形至亚球形。
3.—种生物制剂，其特征在于:基于权利要求1所述的产紫青霉菌制备得到。
4.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于:由产紫青霉菌经液体发酵制备得到，包含以下步骤:将产紫青霉菌接种至PDB培养液中培养，所得菌悬液经离心，即可获得生物制剂。
5.根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于:所述PDB培养液的pH值为7.0。
6.根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于:所述的培养指在28~30°C，摇床震荡速率为180~200rpm下培养4d。
7.根据权利要求3~6任一项所述的生物制剂在防治荔枝霜疫霉病中的应用。
8.根据权利要求1~`2任一项所述的产紫青霉菌在防治荔枝霜疫霉病中的应用。
【文档编号】C12R1/80GK103773699SQ201410035994
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】习平根, 江立群, 徐丹丹, 姜子德, 许再元, 陈金红, 李敏慧, 黄陆浩, 钟瑾 申请人:华南农业大学