基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒及其检测方法

基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒及其检测方法，涉及MicroRNA。试剂盒设有盒体、隔板、外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶。提取样本中miRNA，若为血清/血浆或其他体液样本，则在样本充分裂解后加入试剂盒提供的浓度为5n?mol的外源性参照cel-miR-395μL，漩涡震荡；若为细胞或组织样本，则无需加入外源性参照cel-miR-39；采用试剂盒提供的茎环逆转录试剂逆转录miRNA为cDNA；采用试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时PCR扩增；综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析。
【专利说明】基于AIIG10探针荧光定量PCR的hsa-m i RH 323检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及MicroRNA，尤其是涉及一种基于AllGl0探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】 [0002]MicroRNA (miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的长约22个核苷酸的非编码RNA分子，参与了在生物体中许多生理病理过程，通过调苄基因表达，在细胞增殖、凋亡、生长发育、细胞分化、代谢等过程中发挥重要作用，具体表现为miRNA在细胞核内经过形成最初的初级转录本pr1-miRNA到pre_miRNA,后转运出细胞核,通过剪切形成成熟miRNA,通过与Ago蛋白等形成RISC (RNA诱导的沉默复合体)，部分抑制或降解靶mRNA序列，参与基因表达调控(Bartel DP.MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J].Cell, 2004，116(2):281-297)。
[0003]由于miRNA在肿瘤的发生、发展、预后判断以及许多其他疾病状态下扮演着重要角色，精确检测其表达情况对于研究miRNA的作用具有重大意义。目前，检测miRNA的方法主要有northern blot技术、实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术、微阵列芯片技术等。其中，northern blot技术是RNA检测的早期手段之一，但其特异性和敏感性低，如果样本RNA含量低或存在降解，可能检测不到；原位杂交技术用于检测组织和细胞水平miRNA的分布情况，同时对miRNA进行半定量检测，其不足地方在于不能准确检测到低表达的miRNA ；微阵列芯片技术是一种高通量的检测技术，能同时检测一种或多种样本的大量的miRNA，但存在芯片制作费时，费力和标记成本高，检测灵敏度和特异性低等问题。
[0004]实时荧光定量技术(RT-qPCR)是目前最普遍用于基因表达检测的技术之一，具有简便快速、敏感性高和特异性好等特点。目前，用于检测miRNA的实时荧光定量PCR方法包括miRNA逆转录和下游的荧光定量PCR两部分，其中逆转录根据反转录引物的不同分为两种:同聚物加尾法和茎环逆转录法；荧光定量PCR的检测分为染料法和探针法，其中目前检测miRNA的探针多为Taqman-MGB探针(一种适合于扩增短片段的突光探针)，由于成熟的miRNA具有片段短小的特点，要特异的检测，探针法更有优势，在敏感性和特异性上优于染料法。基于茎环结构的逆转录引物能特异识别，扩增成熟的miRNA序列，而miRNA的前体并未被扩增，Taqman-MGB探针检测miRNA缺点在于合成价格贵,不利于推广。
[0005]目前，AllGl0探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变(Feng, Z.L.Yuj X.Y.Lu，Z.M.Gengj D.Y.Zhang, L.Chen, S.J.Rapid detection of thehepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo? probes [J].Clin Chim Acta, 2011,412 (11-12): 1018-1021)、侵袭性曲霉菌病(Wuj D.S.Shenj J.Z.Zhou, X.Q.Shenj S.F.Wuj X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AlIGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke ZaZhij 2010，49 (2): 142-145)、K-ras基因突变、强直性脊柱炎等检测。[0006]有研究表明，hsa-miR-1323与肝癌关系密切(Law PT, Qin H, Ching AK, LaiKP, Co NN, He M, et al.Deep sequencing of small RNA transcriptome reveals novelnon-coding RNAs in hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol, 2013，58(6):1165-73);另外有研究表明hsa-miR-1323作为胎盘一种特异性表达的miRNA，在诊断胎儿畸形方面有其独特优势(Higashi jima A, Miura K, Mishima H, Kinoshita A, Jo O, Abe S, etal.Characterization of placenta-specific microRNAs in fetal growth restrictionpregnancy [J].Prenat Diagn, 2013, 33 (3):214-22),目前hsa-miR-1323 在生物及其他领域的功能越来越得到重视，使得精确检测hsa-miR-1323成为迫切需要。

【发明内容】

[0007]本发明的目的之一在于针对现有检测miRNA方法中使用的试剂盒和检测方法存在的上述缺陷，提供基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒。
[0008]本发明的目的之二在于提供基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323的检测方法。
[0009]所述hsa-miR-1323为一种人源性miRNA，其核苷酸序列为:SEQ ID N0.15 ; -UCAAAACUGAGGGGCAUUUUCU-3 ;。
[0010]所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒，设有盒体、隔板、外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，外源性参照瓶内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂 。
[0011]所述外源性参照可采用cel-miR-39等,所述cel-miR-39为一种线虫类miRNA,其核苷酸序列为:SEQ ID N0.25 ; -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3 ;;其工作浓度可为 5nmol。
[0012]所述茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5XRT缓冲液(所述5XRT缓冲液由 250m mol Tris-HCl,375m mol KClU5m mol MgCl2,50mmol DTT组成)、40单位/ μ L的RNA酶抑制剂、IOm mol的MgCl2、I μ mol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品(这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为IOOn mol )。
[0013]所述miRNA的特异逆转录引物由hsa-miR-1323的特异逆转录引物、外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物和内源性参照U6的特异逆转录引物组成:
[0014]所述hsa-miR-1323的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQ ID N0.35 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGAAAATG-3 ;；
[0015]所述外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQ ID N0.45 1-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3 ;；
[0016]所述内源性参照U6的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQ IDN0.55 ; -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ;。
[0017]所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10XTaq缓冲液(IOXTaq缓冲液包括100m mol Tris-HCl, 500m mol KCl)> 10m mol 的MgCl2、5单位/ μ L的Taq聚合酶、10m moldNTP混合液、IOOmL无核酶水、10 μ mol特异正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探针。
[0018]所述特异正向引物由hsa-miR-1323的特异引物、外源性参照celniR-39的特异引物和内源性参照U6的特异引物组成:
[0019]所述hsa-miR-1323的特异引物的核苷酸序列为:
[0020]SEQ ID N0.65 ; -TGCGGTCAAAACTGAGG-3 ;；
[0021]所述外源性参照cel-miR-39的特异引物的核苷酸序列为:
[0022]SEQ ID N0.75 ; -CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3 ;；
[0023]所述内源性参照U6的特异引物的核苷酸序列为:
[0024]SEQ ID N0.85 ; -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ;。
[0025]所述通用反向引物的核苷酸序列为:
[0026]SEQ ID N0.95 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;。
[0027]所述AllGlo探针由hsa-miR-1323的特异探针、内源性参照U6的特异探针和外源性参照cel-miR-39的特异探针组成；
[0028]所述hsa-miR-1323的特异探针的核苷酸序列为:
[0029]SEQ ID N0.10MAR-CACTGGATACGACAGAAAATGCCC-MAR ；
[0030]所述内源性参照U6的特异探针的核苷酸序列为:`[0031]SEQ ID N0.11JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP ;
[0032]所述外源性参照cel-miR-39的特异探针的核苷酸序列为:
[0033]SEQ ID N0.12JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP。
[0034]所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsaniR-1323的检测方法，其步骤如下:
[0035]I)采用常规方法提取样本中miRNA，若为血清/血浆或其他体液样本，则在样本充分裂解后加入所述基于AllGl0探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒提供的浓度为5n mol的外源性参照cel-miR-395 μ L，立即进行漩涡震荡15s ;若为细胞或组织样本，则无需加入外源性参照cel-miR-39 ；
[0036]2)采用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂逆转录miRNA为cDNA ；
[0037]3)采用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时PCR扩增；
[0038]4)综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline),进行结果分析。
[0039]所述AllGlo 探针可米用美国 AlleLogic Biosciences Corporation 公司的突光定量探针，它拥有普通Taqman, Taqman-MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，克服了目前这几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman —端报告基团一端淬灭基团的限制，利用了美国AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的几种常见波长的特制荧光染料，标记在寡核苷酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可以提高Tm值(退火温度)的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为报告基团，提高荧光增量。
[0040]所述AllGlo探针具有以下优势:
[0041]①提高Tm值(可达10°C以上)，探针更短可以达到15~16个碱基，可以适用A，T含量比较高的序列设计探针；
[0042]②加大了多重荧光定量的选择，因为每种染料即是报告基团又是淬灭基团，打破传统Taqman探针因波长原因标记选择困难，不受淬灭基团波长限制；
[0043]③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的淬灭效果；
[0044]④成本较低，价格仅相当于Taqman-MGB探针的一半，具有MGB探针所有优势。
[0045]本发明采用了 AllGl0探针技术，建立了能检测miRNA的实时荧光定量PCR的方法，与taqman-MGB探针法相比，线性范围均能达到7个数量级。本发明建立的实时荧光定量PCR灵敏度最低可达10拷贝/yL，最高可达IO7拷贝/yL。 [0046]本发明采用了 AllGl0探针技术，设计了特异性引物和相应的AllGl0探针，探针分别标记2种特殊荧光基团(MAR、JUP)，并对该技术反应条件进行优化，建立了一种AllGl0探针荧光定量PCR技术检测hsa-miR-1323的方法，应用前景广阔。
[0047]本发明的有益效果如下:
[0048]本发明提供了一种基于AllGlo探针RT-qPCR的hsaniR-1323检测试剂盒和检测方法，其特异性和敏感性高，可快速准确检测样本中miRNA的含量，与现有技术相比具有以下优势:
[0049]1.与northern blot，miRNA芯片相比，AllGlo探针检测的特异性和敏感性均要高，价格比miRNA芯片要便宜；
[0050]2.与taqman-MGB探针相比，AllGl0探针采用相同的荧光基团，互为报告基团和淬灭基团，一方面释放的荧光信号更强，另一方面本底信号更低；而且合成程序简单，价格仅相当于Taqman-MGB的一半。
[0051]3.相比目前普遍采用的基于SYBGreen染料检测miRNA方法，基于AllGlo探针检测miRNA的反应时间大大缩短,而且敏感性与特异性要明显高于基于SYBGreen检测miRNA的方法；
[0052]4.本发明建立了基于AllGlo探针的RT-qPCR检测hsa-miR-1323的方法，适合于作为筛选miRNA的临床样本验证，为进一步研究miRNA在相关疾病中扮演的作用起到推动作用。
【专利附图】

【附图说明】
[0053]图1为本发明基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsaniR-1323检测试剂盒实施例的结构组成示意图。
【具体实施方式】
[0054]实施例1
[0055]参见图1，本发明所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒实施例，设有盒体1、隔板2、外源性参照瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂瓶5 ;隔板2设在盒体I内，外源性参照瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂瓶5插在隔板2上，外源性参照瓶3内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶4内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶5内装有实时荧光定量PCR试剂。
[0056]①所述外源性参照可采用cel-miR-39等,所述cel-miR-39为一种线虫类miRNA,,其工作浓度可为5n mol，其作用在于监测从miRNA提取到后续实时荧光定量PCR全过程的反应效率；
[0057]②茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5XRT缓冲液(5XRT缓冲液由 250m mol Tris-HCl, 375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50m molDTT组成)、40单位/ μ L的RNA酶抑制剂、IOm mol的MgC12、I μ mol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品(这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为IOOn mol);
[0058]③实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10XTaq缓冲液(10 X Taq缓冲液包括IOOmmol Tris-HCl, 500m mol KCl)> 10m mol 的 MgCl2、5 单位 / μ L 的 Taq 聚合酶、10m moldNTP 混合液、IOOmL无核酶水、10 μ mol特异正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探针。
[0059]实施例2
[0060]血清或血衆hsa-miR-1323的检测,包括以下步骤:
[0061]1.收集血浆或血清:
[0062]抽取新鲜血液标本2mL装于EDTA抗凝管或无抗凝剂管中，立即将上述试管颠倒混匀6~8次,然后将上述试管置于离心机3000r离心IOmin,结束后取出置于试管架上,小心吸取上清置于新的1.5mL的无RNA酶的离心管中，将装有上清的1.5mL的离心管置于离心机中13000r离心lOmin，结束后将上层血浆或血清转移至新的1.5mL无RNA酶的离心管中(此步骤注意不要吸取到下层的细胞沉淀。)，每管分装400~500 μ L，取200 μ L用于下一步提取，其余血浆或血清于-80°C冻存。
[0063]2.提取 microRNA
[0064]采用天根生物科技有限公司的生产的miRNA提取试剂盒(DP501)，按照操作说明书进行样本(血浆或血清)miRNA提取，其中200 μ L血浆或血清在加入同等体积的裂解液剧烈震荡30s后静置5min，然后加入外源性参照celnir-39 (其工作浓度为5n mol) 5 μ L，后按照说明书操作进行，最后用30 μ L的去核酶水溶解miRNA，于核酸分光光度仪器NanoDrop2000上分别测定浓度和纯度，取纯度A260/A280比值在1.6~2.2之间，取浓度2~20ng/ μ L的已提取的miRNA用于下游的逆转录,其余的miRNA均于_80°C冻存。
`[0065]3.miRNA 的逆转录:
[0066]3.1将逆转录所需成分于室温下溶解，震荡混匀后置于冰上；请按照表1配制逆转录反应液。
[0067]表1
[0068]
【权利要求】
1.基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒，其特征在于所述hsa-miR-1323 为一种人源性miRNA，其核苷酸序列为:SEQ ID N0.15 ; -UCAAAACUGAGGGGCAUUUUCU-3 ;； 所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒，设有盒体、隔板、外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，外源性参照瓶内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶内装有茎 环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。
2.如权利要求1所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒，其特征在于所述外源性参照采用cel-miR-39,所述cel-miR-39为一种线虫类miRNA,其核苷酸序列为:SEQ ID N0.25 ; -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3 ;;其工作浓度为 5nmol。
3.如权利要求1所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒，其特征在于所述茎环逆转录试剂包括以下组份:200单位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5 X RT缓冲液、40单位/ μ L的RNA酶抑制剂、IOm mol的MgCl2U μ mol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品，浓度为IOOn mol ;所述5XRT缓冲液由250m mol Tris-HCl,375m mol KClU5m mol MgCl2,50m mol DTT 组成。
4.如权利要求3所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒，其特征在于所述miRNA的特异逆转录引物由hsa-miR-1323的特异逆转录引物、外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物和内源性参照U6的特异逆转录引物组成； 所述hsa-miR-1323的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQ ID N0.35 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGAAAATG-3 ;； 所述外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQ ID N0.45 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3 ;； 所述内源性参照U6的特异逆转录引物的核苷酸序列为:SEQ IDN0.55 ; -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ;。
5.如权利要求1所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒，其特征在于所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份=IOXTaq缓冲液、IOm mol的MgCl2、5单位/μ L的Taq聚合酶、IOm moldNTP混合液、IOOmL无核酶水、10 μ mol特异正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探针;所述10XTaq缓冲液包括IOOm mol Tris-HCl, 500mmol KCl0
6.如权利要求5所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒，其特征在于所述特异正向引物由hsa-miR-1323的特异引物、外源性参照cel-miR-39的特异引物和内源性参照U6的特异引物组成； 所述hsa-miR-1323的特异引物的核苷酸序列为:
SEQ ID N0.65 ; -TGCGGTCAAAACTGAGG-3 ;； 所述外源性参照cel-miR-39的特异引物的核苷酸序列为:
SEQ ID N0.75 ; -CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3 ;； 所述内源性参照U6的特异引物的核苷酸序列为:
SEQ ID N0.85 ; -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ;。
7.如权利要求5所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒，其特征在于所述通用反向引物的核苷酸序列为:
SEQ ID N0.95 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;。
8.如权利要求5所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒，其特征在于所述AllGlo探针由hsa-miR-1323的特异探针、内源性参照U6的特异探针和外源性参照cel-miR-39的特异探针组成； 所述hsa-miR-1323的特异探针的核苷酸序列为:
SEQ ID N0.10MAR-CACTGGATACGACAGAAAATGCCC-MAR ； 所述内源性参照U6的特异探针的核苷酸序列为:
SEQ ID N0.11JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP ； 所述外源性参照cel-miR-39的特异探针的核苷酸序列为:
SEQ ID N0.12JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP。
9.基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323的检测方法，其特征在于其步骤如下: 1)采用常规方法提取样本中miRNA，若为血清/血浆或其他体液样本，则在样本充分裂解后加入所述基于AllGl`o探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒提供的浓度为5nmol的外源性参照cel-miR-395y L，立即进行漩涡震荡15s ;若为细胞或组织样本，则无需加入外源性参照cel-miR-39 ； 2)采用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂逆转录miRNA为cDNA ； 3)采用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时PCR扩增； 4)综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析。
10.如权利要求9所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-1323的检测方法，其特征在于所述AllGlo探针采用美国AlleLogic Biosciences Corporation公司的突光定量探针。
【文档编号】C12Q1/68GK103773875SQ201410041117
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】唐晶, 张忠英 申请人:厦门大学附属中山医院