一种mrsa利奈唑胺耐药预测方法
【专利摘要】本发明公开了一种MRSA利奈唑胺耐药预测方法，该MRSA利奈唑胺耐药预测方法包括对于临床长期使用利奈唑胺治疗的MRSA，应用PCR技术检测相关的23S?rRNA点突变基因；通过体外菌谱分析方法，及早筛选异质性耐药菌株，提示临床利奈唑胺是否存在异质性耐药。本发明的MRSA利奈唑胺耐药预测方法，能够对可能存在的诱导耐药风险给予预测和评估，指导临床合理使用利奈唑胺，以降低金黄色葡萄球菌耐药株的产生。
【专利说明】—种MRSA利奈唑胺耐药预测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种MRSA利奈唑胺耐药预测方法。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、假膜性肠炎、心包炎等，甚至血流感染、脓毒症等全身感染。特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)已经成为世界范围引起医院内感染首要的病原菌。目前MRSA耐药严重，往往具有多重耐药性，对氯霉素、林可霉素、氨基糖苷类.、四环素类、大环内酯类等耐药率均较高，但对噁唑烷酮类(利奈唑胺)和糖肽类抗生素(万古霉素或替考拉宁)的敏感性较好。但由于糖肽类抗生素的不良反应限制了其在MRSA治疗中的大范围应用，而利奈唑胺对大多数革兰阳性菌引起的感染具有较好的治疗作用，一直被临床誉为抗击MRSA感染中的一线药物。
[0003]但最近的报道表明，在长期的利奈唑胺治疗MRSA感染的过程中会诱导出现利奈唑胺耐药的菌株(LRSA)，目前还没有一种MRSA利奈唑胺耐药预测方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种MRSA利奈唑胺耐药预测方法，旨在解决目前还没有一种MRSA利奈唑胺耐药预测方法来对可能存在的诱导耐药风险给予预测和评估，指导临床合理使用利奈唑胺，以降低金黄色葡萄球菌耐药株产生的问题。 [0005]本发明是这样实现的，一种MRSA利奈唑胺耐药预测方法，所述的MRSA利奈唑胺耐药预测方法包括以下步骤:
[0006]步骤一、对于临床长期使用利奈唑胺治疗的MRSA，应用PCR技术检测相关的23SrRNA点突变基因；
[0007]步骤二、通过体外菌谱分析方法，及早筛选异质性耐药菌株，提示临床利奈唑胺是否存在异质性耐药。
[0008]进一步，在步骤一中，PCR中基因组DNA提取:依据DNA提取试剂盒进行全基因组DNA提取，取15-20个菌落加入200ulTE，4ul溶葡萄球菌酶，是菌落充分溶解，37°C IOOrpm温育I小时，56°C IOOrpm温育30min，将裂解完全的液体180ul转移至EP管，加入25ul蛋白酶K和200ul的Buffer AL，振荡混匀5秒，加入200ul无水乙醇振荡混匀5秒，将溶液加入DNA提取试剂盒中8000rpmlmin,弃废液,用Wash Bufferl和Wash Buffer2冲洗，最后用IOOul Elufion Buffer8000rpmlmin将DNA洗脱，测定基因组DNA纯度及浓度备用。
[0009]进一步，在步骤一中，23S rRNA点突变筛选，使用23S rRNA PCR引物，23S rRNA热循环参数为94°C预变性4min，94°C 60s ；62°C 30s ；72°C 30s ；30个循环；最后72°C延长IOmin ；PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果；鉴定正确后送TaKaRa公司测序；测序后结果登陆NCBI进行blast比对，检测突变位点。
[0010]进一步，在步骤二中，采用的菌谱分析法包括:[0011]取ATCC29213及待测菌株在血平板上经24h培养菌落，用M-H肉汤调节为IOiciCFU/mL，并继续以1: 10系列稀释为106-101(lCFU/mL，取每个浓度菌液10uL，分别划线接种到含利奈唑胺2，3，4，6，8，12，16，24，32，48，56 μ g/ml利奈唑胺脑心浸液选择性培养基，35°C孵育48h后计数菌落，N = η X 102/106-10, N大于IO8为阳性筛选菌株，阳性菌株重新进行细菌鉴定，鉴定正确后转种血平板孵育24h，检测对利奈唑胺药敏试验。
[0012]本发明的MRSA利奈唑胺耐药预测方法，能够对可能存在的诱导耐药风险给予预测和评估，指导临床合理使用利奈唑胺，以降低金黄色葡萄球菌耐药株的产生。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是本发明实施例提供的MRSA利奈唑胺耐药预测方法的流程图。
【具体实施方式】
[0014]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0015]图1示出了本发明的MRSA利奈唑胺耐药预测方法的流程，如图所示，本发明是这样实现的，一种MRSA利奈唑胺耐药预测方法包括以下步骤:
[0016]SlOl:对于临床长期使用利奈唑胺治疗的MRSA，应用PCR技术检测相关的23SrRNA点突变基因；
[0017]S102:通过体外菌谱分析方法，及早筛选异质性耐药菌株，提示临床利奈唑胺是否存在异质性耐药。
[0018]本发明的具体步骤为:
[0019]步骤一、对于临床长期使用利奈唑胺治疗的MRSA，应用PCR技术检测相关的23SrRNA点突变基因，具体方法为:
[0020]基因组DNA提取:依据德国Qiagen Company DNA提取试剂盒进行全基因组DNA提取，取15-20个菌落加入200ulTE，4ul溶葡萄球菌酶，是菌落充分溶解。37°C IOOrpm温育I小时，56°C IOOrpm温育30min，将裂解完全的液体180ul转移至EP管，加入25ul蛋白酶K和200ul的Buffer AL，振荡混匀5秒，加入200ul无水乙醇振荡混匀5秒。将溶液加入DNeasy Mini Spin Column 中，8000rpmlmin,弃废液,用 Wash Bufferl 和 Wash Buffer2 冲洗，最后用IOOul Elution Buffer8000rpmlmin将DNA洗脱。测定基因组DNA纯度及浓度备用。
[0021]23S rRNA点突变筛选，23S rRNA PCR引物由TaKaRa公司合成，23SrRNA热循环参数为 94°C预变性 4min，94°C 60s ；62°C 30s ；72°C 30s ；30 个循环。最后 72°C延长 lOmin。PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果。鉴定正确后送TaKaRa公司测序。测序后结果登陆NCBI进行blast比对，检测突变位点。
[0022]步骤二、通过体外菌谱分析方法，及早筛选异质性耐药菌株，提示临床利奈唑胺是否存在异质性耐药；
[0023]采用菌谱分析法，取ATCC29213及待测菌株在血平板上经24h培养菌落，用M-H肉汤调节为10lclCFU/mL，并继续以1: 10系列稀释为106-10lclCFU/mL，取每个浓度菌液10uL，分别划线接种到含利奈唑胺2，3，4，6，8，12，16，24，32，48，56 μ g/ml利奈唑胺脑心浸液选择性培养基，35°C孵育48h后计数菌落(n)，N = nX 102/106_1(1。N大于IO8为阳性筛选菌株，阳性菌株重新进行细菌鉴定，鉴定正确后转种血平板孵育24h，检测对利奈唑胺药敏试验。
[0024]本发明的MRSA利奈唑胺耐药预测方法，能够对可能存在的诱导耐药风险给予预测和评估，指导临床合理使用利奈唑胺，以降低金黄色葡萄球菌耐药株的产生。
[0025]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动即可做出的各种`修改或变形仍在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种MRSA利奈唑胺耐药预测方法，其特征在于，所述的MRSA利奈唑胺耐药预测方法包括以下步骤: 步骤一、对于临床长期使用利奈唑胺治疗的MRSA，应用PCR技术检测相关的23S rRNA点突变基因； 步骤二、通过体外菌谱分析方法，及早筛选异质性耐药菌株，提示临床利奈唑胺是否存在异质性耐药。
2.如权利要求1所述的MRSA利奈唑胺耐药预测方法，其特征在于，在步骤一中，PCR中基因组DNA提取:依据DNA提取试剂盒进行全基因组DNA提取，取15-20个菌落加入200ulTE，4ul溶葡萄球菌酶，是菌落充分溶解，37 °C IOOrpm温育I小时，56°C IOOrpm温育30min，将裂解完全的液体180ul转移至EP管，加入25ul蛋白酶K和200ul的BufferAL，振荡混匀5秒，加入200ul无水乙醇振荡混匀5秒，将溶液加入DNA提取试剂盒中8000rpmlmin,弃废液，用 Wash Bufferl 和 Wash Buffer2 冲洗，最后用 IOOul ElutionBuffer8000rp mlmin将DNA洗脱，测定基因组DNA纯度及浓度备用。
3.如权利要求1所述的MRSA利奈唑胺耐药预测方法，其特征在于，在步骤一中，23SrRNA点突变筛选，使用23S rRNA PCR引物，23S rRNA热循环参数为94°C预变性4min，94°C 60s ；62°C 30s ；72°C 30s ；30 个循环；最后 72°C延长 IOmin ;PCR产物 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果；鉴定正确后送TaKaRa公司测序；测序后结果登陆NCBI进行blast比对，检测突变位点。
4.如权利要求1所述的MRSA利奈唑胺耐药预测方法，其特征在于，在步骤二中，采用的菌谱分析法包括: 取ATCC29213及待测菌株在血平板上经24h培养菌落，用M-H肉汤调节为1010CFU/mL，并继续以1: 10系列稀释为106-101(lCFU/mL，取每个浓度菌液10uL，分别划线接种到含利奈唑胺2，3，4，6，8，12，16，24，32，48，56 μ g/ml利奈唑胺脑心浸液选择性培养基，35°C孵育48h后计数菌落，N = ηX 102/106-10, N大于IO8为阳性筛选菌株，阳性菌株重新进行细菌鉴定，鉴定正确后转种血平板孵育24h，检测对利奈唑胺药敏试验。
【文档编号】C12Q1/68GK103882120SQ201410065064
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】徐修礼, 周珊, 郝晓柯, 刘家云, 杨佩红 申请人:徐修礼