用于指导华法林个体化用药的多重pcr联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法
【专利摘要】用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法，涉及华法林。所述试剂盒包括：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂和盒体。所述检测方法：人类全血基因组DNA提取；多重PCR扩增反应；单链DNA样本分离和纯化；焦磷酸测序与结果分析。通过检测影响华法林个体剂量差异的最主要因素，即VKORC1和CYP2C9的重要基因多态性位点，具体为VKORC1-1639G>A、CYP2C9*2和CYP2C9*3，达到指导需要服用华法林者使用个体化剂量进行治疗，以降低副作用的目的。
【专利说明】用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学检验领域，涉及华法林，尤其涉及一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]华法林是一种双香豆素衍生物，华法林通过抑制维生素K及其2，3-环氧化物(维生素K环氧化物)的相互转化而发挥抗凝作用。虽为最古老的口服抗凝药物，华法林仍然是目前需要长期抗凝治疗患者的最常用药物[1]。华法林的临床应用包括静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的一级和二级预防、心房颤动(房颤)血栓栓塞的预防、瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成的预防等[2’3]。非瓣膜病房颤研究荟萃分析显示，华法林可使卒中的相对危险度降低64%，全因死亡率显著降低26% [4]。但是，华法林临床应用存在有效血药浓度范围狭窄和个体间稳定剂量差异显著(不同患者个体间剂量差异可达数十倍)两大问题。这两个问题直接导致出血或血栓形成等副作用的发生:在美国，华法林的致死性副反应一度居所有药物之首[5]。
[0003]造成华法林个体剂量差异的原因包括非遗传因素和遗传因素。非遗传因素主要指身高、年龄、体重、饮食、药物相互作用等，非遗传因素是华法林用药剂量差异的次要原因。遗传因素是影响华法林个体剂量差异的关键因素。其中最重要的遗传因素为与华法林药效动力学和药代动力学相关的酶或靶蛋白的基因发生变异导致此关键酶或靶蛋白的含量或活性的变化，进而增强 或降低华法林的敏感性，影响到华法林的剂量。
[0004]华法林代谢的关键酶为细胞色素P450超家族的第二亚家族的CYP2C9蛋白，该酶将华法林代谢为无活性成分，并且已知CYP2C9基因单核苷酸多态性对华法林用药剂量的个体差异有显著影响[6]。CYP2C9包含CYP2C9*1—CYP2C9*15等多种基因型，而其中的CYP2C9*2 (rsl799853)和CYP2C9*3 (rsl057910)基因型对华法林代谢影响最大。例如，CYP2C9*3的1075A>C突变导致该酶359位氨基酸由异亮氨酸变为亮氨酸，酶活性失活(突变型酶活性仅为野生型5%)，导致华法林的清除率低于正常，血药浓度升高。因此，此类人群需要降低临床用药剂量，以防止药物过量导致的出血等不良反应的发生。华法林作用的靶蛋白为维生素K还原酶复合物(VK0RC)，该酶正常的生理功能为将环氧化形式的维生素K转化为氢醌形式，后者则在维生素K依赖的凝血因子F I1、FVI1、FIX、F X活化中起重要作用。同样的，编码VKORC蛋白的VKORCl基因的SNP多态性也会导致VKORC酶的活性改变，进而影响到华法林的抗凝效果，并且在亚洲人群VKORCl对华法林剂量的影响更为重要，可达16 — 30%m。其中又以VKORCl基因启动子区-1639G>A (rs9923231，也被称为VK0RC1*2基因型)最为重要，G基因型比A基因型的酶活性高40%，因此A基因型突变时华法林剂量较G基因型要低。
[0005]可见CYP2C9*2、CYP2C9*3和VK0RC1_1639G>A基因多态性是影响华法林个体剂量
差异的主要因素。而且基于这些基因多态性位点的检测以分层用药剂量或联合患者的身高、体重等信息做的剂量预测方程预测具体剂量以在有检测条件的发达国家和地区应用，并表现了优于传统固定剂量给药方式的高疗效和低副作用[8?9]。目前检测上述华法林个体化剂量相关基因多态性的方法较多，包括实时荧光PCR法、限制性内切酶片段多态性分析(RFLP)、基因芯片、Sanger测序法、普通PCR联合电泳分析等等，但是这些方法存在灵敏度不够、耗时、交叉污染和成本昂贵等问题。
[0006]焦磷酸测序技术是基于实时反应、边合成边测序的新型核酸序列分析技术，该技术具有操作简便、检测成本较低、快捷、准确、可高通量，同时也无需荧光标记和电泳分析等操作，非常适合临床检验的用途。本发明即是基于焦磷酸测序技术进行华法林个体化治疗剂量相关基因多态性检测试剂盒的开发和应用。
[0007]参考文献:
[0008]1、中华医学会心血管病学分会，中国老年学学会心脑血管病专业委员会.华法林抗凝治疗的中国专家共识.中华内科学杂志.2013;52:76-82.[0009]2、Hirsh J，Fuster V, Ansell J，Halperin 几，American Heart A，AmericanCollege of Cardiology F.American heart association/american college ofcardiology foundation guide to warfarin therapy.Circulation.2003;107:1692-711.[0010]3、Mueller RL.First-generation agents:Aspirin，heparin and coumarins.Best practice & research Clinical haematology.2004;17:23-53.[0011]4λHart RGiPearee LA.Aguilar M1.Meta, analysis:antithrombotic therapy toprevent stroke in patients who have nonvalvular atrial fibrillation.Ann InternMed.2007，146:857-867.[0012]5、Budnitz DSj Lovegrove MC，Shehab N，Richards CL.Emergencyhospitalizations for adverse drug events in older americans.The New Englandjournal of medicine2011 ；365:2002-2012.[0013]6、Aithal GP，Day CP, Kesteven PJ，et al.Association of polymorphisms inthe cytochrome P450CYP2C9with warfarin dose requirement and risk of bleedingcomplications.Lancet，1999，353:717-719.[0014]7、Rieder MJ, Reiner AP, Gage BF, et al Effect of VKORCl haplotypes ontranscriptional regulation and warfarin dose.N Engl J Med.2005,352:2285-2293.[0015]8、Anderson JLj Horne BDj Stevens SM, Grove AS, Barton S，Nicholas ZP，KahnSFj May HT，Samuelson KM，Muhlestein JB，Carlquist JF;Couma-Gen Investigators.Randomized trial of genotype-guided versus standard warfarin dosing in patientsinitiating oral anticoagulation.Circulation.2007;116(22):2563-2570.[0016]9、Wen MS, Lee M，Chen JJ，Chuang HP, Lu LS，Chen CHj Lee TH，Kuo CT，SunFM，Chang YJ，Kuan PLj Chen YFj Charng MJj Ray CYj Wu JY，Chen YT.Prospective study ofwarfarin dosage requirements based on CYP2C9and VKORClgenotypes.Clin PharmacolTher.2008Jul;84(l):83-89.
【发明内容】
[0017]本发明的目的在于提供一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法。
[0018]所述用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒包括:
[0019](I)全血基因组DNA提取试剂:所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司，主要成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB等。
[0020](2)多重PCR扩增引物:所述多重PCR扩增引物包括:
[0021]PCR 引物 I (Seq N01):
[0022]VK0RC1-1639G>A (rs9923231)上游引物 5’ -GGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCT-3’ ；
[0023]PCR 引物 2 (Seq N02):
[0024]VK0RC1-1639G>A (rs9923231)下游引物 5，-GCCTCCAGGGTTCAAGTGG-3，；
[0025]PCR 引物 3 (Seq N03):
[0026]CYP2C9*2 (rsl799853)上游引物 5’-TACAGAGCTCCTCGGGCAGA-3’ ；
[0027]PCR 引物 4 (Seq N04):
[0028]CYP2C9*2 Crsl799853)下游引物 5’-CAGCGGGCTTCCTCTTGA-3’ ；
[0029]PCR 引物 5 (Seq N05):
[0030]CYP2C9*3 (rs l057910)上游引物 5，-TAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG-3’ ；
[0031]PCR 引物 6 (Seq N06):
[0032]CYP2C9*3 (rsl057910)下游引物 5’-GGGGACTTCGAAAACATGG-3’ ；
[0033]其中引物2、引物4、引物5的5’端均进行生物素标记。
[0034](3)多重PCR扩增反应试剂:所述多重PCR扩增反应试剂名为“2X PyroMark PCRMaster Mix”，来自德国QIAGEN公司的PyroMark PCR Kit试剂盒。具体成分主要包括热启动Taq DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg2+、钠离子Na+以及扩增反应特异性增强剂Q-Solution。
[0035](4)单链DNA分离和纯化试剂:所述单链DNA分离和纯化试剂，主要包括购自美国通用健康公司GE Healthcare的高性能链霉亲和素琼脂糖和购自德国QIAGEN公司的PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液IOX浓缩液。
[0036](5)焦磷酸测序引物:所述焦磷酸测序引物包括:
[0037]测序引物I (Seq N07):
[0038]VK0RC1-1639G>A (rs9923231)测序引物 5，-CCTGAAAAACAACCATTG-3，；
[0039]测序引物2 (Seq N08):
[0040]CYP2C9*2 (rsl799853)测序引物 5’-GAGGAGCATTGAGGAC-3’ ；
[0041]测序引物3 (Seq N09):
[0042]CYP2C9*3 (rsl057910)测序引物 5’ -TGGGGAGAAGGTCAA-3’。
[0043](6)焦磷酸测序试剂:所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，购自德国QIAGEN公司，主要包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α -硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物为焦磷酸测序所有需要的酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；底物复合物为腺苷_5’ -磷酸硫酸酐。[0044](7 )盒体:全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。
[0045]所述用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序的检测方法，采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒，包括如下步骤:
[0046](1)人类全血基因组DNA提取:采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的全血基因组DNA提取部分试剂，包括利用缓冲液GB和蛋白酶K溶解外周血白细胞，缓冲液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脱液TB洗脱得到DNA成分，整个提取反应以吸附柱CB3为DNA与细胞碎片和DNA与蛋白质分离的介质。
[0047](2)多重PCR扩增反应:采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂，具体的反应体系和反应条件如表1和表2所不。
[0048]表1多重PCR扩增反应体系
【权利要求】
1.用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒，其特征在于包括: (I)全血基因组DNA提取试剂:所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB ； (2 )多重PCR扩增引物:所述多重PCR扩增引物包括: PCR 引物 1 (Seq NOl):
VK0RC1-1639G>A (rs9923231)上游引物 5’ -GGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCT-3’ ； PCR 引物 2 (Seq N02): VK0RC1-1639G>A (rs9923231)下游引物 5’ -GCCTCCAGGGTTCAAGTGG-3，； PCR 引物 3 (Seq N03):
CYP2C9*2 (rsl799853)上游引物 5’ -TACAGAGCTCCTCGGGCAGA-3’ ； PCR 引物 4 (Seq N04):
CYP2C9*2 (rsl799853)下游引物 5’ -CAGCGGGCTTCCTCTTGA-3’ ； PCR 引物 5 (Seq N05):
CYP2C9*3 (rsl057910)上游引物 5’ -TAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG-3’ ； PCR 引物 6 (Seq N06):
CYP2C9*3 (rsl057910)下游引物 5’ -GGGGACTTCGAAAACATGG-3’ ； 其中引物2、引物4、引物5的5’端均进行生物素标记； (3)多重PCR扩增反应试剂:所述多重PCR扩增反应试剂名为“2XPyroMark PCRMaster Mix”，PyroMark PCR Kit试剂盒,成分包括热启动Taq DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg2+、钠离子Na+以及扩增反应特异性增强剂Q-Solution ； (4)单链DNA分离和纯化试剂:所述单链DNA分离和纯化试剂包括链霉亲和素琼脂糖、PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液IOX浓缩液； (5)焦磷酸测序引物:所述焦磷酸测序引物包括: 测序引物1 (Seq N07):
VK0RC1-1639G>A (rs9923231)测序引物 5’ -CCTGAAAAACAACCATTG-3’ ； 测序引物2 (Seq N08):
CYP2C9*2 (rsl799853)测序引物 5’ -GAGGAGCATTGAGGAC-3’ ； 测序引物3 (Seq N09): CYP2C9*3 (rsl057910)测序引物 5’ -TGGGGAGAAGGTCAA-3’ ； (6)焦磷酸测序试剂:所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α -硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物为焦磷酸测序所有需要的酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；底物复合物为腺苷_5’ -磷酸硫酸酐； (7)盒体:全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。
2.用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序的检测方法，其特征在于采用如权利要求1所述用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒，包括如下步骤: (1)人类全血基因组DNA提取:采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的全血基因组DNA提取部分试剂，包括利用缓冲液GB和蛋白酶K溶解外周血白细胞，缓冲液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脱液TB洗脱得到DNA成分，整个提取反应以吸附柱CB3为DNA与细胞碎片和DNA与蛋白质分离的介质； (2)多重PCR扩增反应:采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂，具体的反应体系和反应条件如表1和表2所不；表1多重PCR扩增反应体系
【文档编号】C12Q1/68GK103820553SQ201410067919
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】叶辉铭, 苏晓崧, 张忠英 申请人:厦门大学附属中山医院, 叶辉铭