焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒及其检测方法，涉及氯吡格雷。所述试剂盒包括：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂和盒体。所述检测方法：人类全血基因组DNA提取；多重PCR扩增反应；单链DNA样本分离和纯化；焦磷酸测序与结果分析。主要通过检测影响氯吡格雷代谢导致个体疗效差异的最主要因素，即CYP2C19的重要基因多态性位点，具体为CYP2C19*2和CYP2C19*3，达到指导心脑血管疾病需要长期抗凝者根据个体基因类型合理选择氯吡格雷及其剂量进行治疗。
【专利说明】焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学检验领域，涉及氯吡格雷，尤其是涉及一种焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]氯吡格雷是一种血小板聚集抑制剂，化学成分为噻吩并吡啶，目前广泛应用于冠状动脉血管疾病、外周血管疾病和脑血管疾病，如急性冠脉综合征、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎和动脉硬化及血栓栓塞引起的并发症等，也用于心脏支架术后患者长期抗凝[1_3]。临床研究表明氯吡格雷疗效存在明显的个体差异，4%~30%的患者服用常规剂量的氯吡格雷不能有效抑制血小板聚集反应⑷。美国食品药品监督管理局(FDA)于2010年要求厂商在氯吡格雷说明书中使用黑框警告标示“氯吡格雷(波利维)对特殊基因体质的患者在正常用药剂量下可能无法达到预期的疗效” [5]。
[0003]氯吡格雷主要经细胞色素P450家族的第二亚家族成员CYP2C19酶代谢生成活性代谢产物后发挥抗血小板效应。CYP2C19的变异是目前发现的氯吡格雷疗效个体差异的主要原因，CYP2C19*2 (rs4244285)和CYP2C19*3 (rs4986893)突变导致酶活性降低或丧失，造成活性代谢产物生成减少甚至不能生成，导致氯吡格雷抵抗，抗凝无效[4，6]。常规剂量的氯吡格雷在CYP2C19慢代谢型患者体内活性代谢物生产减少，对血小板的抑制作用下降。因此，美国FDA和美国心脏病学会建议，对于CYP2C19慢代谢基因型患者需增加氯吡格雷的剂量，或考虑改变治疗方案。国内学者近期的研究也显示基因检测可以提高氯吡格雷在经皮冠状动脉介入手术的冠心病患者的疗效[7]。
[0004]临床上可用于对CYP2C19*2 (rs4244285)和 CYP2C19*3 (rs4986893)多态性位点进行检测的方法包括Sanger测序法、基因芯片法和实时荧光定量PCR法(Taqman-MBG探针法)、限制性内切酶片段多态性分析(RFLP)、普通PCR联合电泳分析等多种检测方法，但是这些方法存在灵敏度不够、耗时、交叉污染和成本昂贵等问题。
[0005]焦磷酸测序技术是基于实时反应、边合成边测序的新型核酸序列分析技术，该技术具有操作简便、检测成本较低、快捷、准确、可高通量，同时也无需荧光标记和电泳分析等操作，非常适合临床检验的用途。本发明即是基于焦磷酸测序技术进行氯吡格雷个体化治疗剂量相关基因多 态性检测试剂盒的开发和应用。
[0006]参考文献:
[0007]
【权利要求】
1.焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒，其特征在于包括: (1)全血基因组DNA提取试剂:所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB ； (2 )多重PCR扩增引物:所述多重PCR扩增引物包括: PCR 引物1 (Seq NOl):
CYP2C19*2(rs4244285)上游引物 5’ -CAGAGCTTGGCATATTGTATCTA-3’ ； PCR 引物 2 (Seq N02):
CYP2C19*2 (rs4244285)下游引物 5’ -TTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCAC-3’ ； PCR 引物 3 (Seq N03):
CYP2C19*3 (rs4986893)上游引物 5’ -ACCCTGTGATCCCACTTTCAT-3’ ； PCR 引物 4 (Seq N04):
CYP2C19*3 (rs4986893)下游引物 5’ -ATGTACTTCAGGGCTTGGTCA-3’ ； 其中PCR引物2和PCR引物3的5’端均进行生物素标记； (3)多重PCR扩增反应试剂:所述多重PCR扩增反应试剂名为“2XPyroMark PCRMaster Mix”,具体成分包括热启动Taq DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg2+、钠离子Na+以及扩增反应特异性增强剂Q-Solution ； (4)单链DNA分离和纯化试剂:所述单链DNA分离和纯化试剂，包括链霉亲和素琼脂糖、PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液IOX浓缩液； (5)焦磷酸测序引物:所述焦磷酸测序引物包括: 测序引物I (Seq N05): CYP2C19*2 (rs4244285)测序引物 5’ -CCACTATCATTGATTATTTC-3，； 测序引物2 (Seq N06):
CYP2C19*3 (rs4986893)测序引物 5’ -AACTTGGCCTTACCTG-3’ ； (6)焦磷酸测序试剂:所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α -硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物为焦磷酸测序所有需要的酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；所述底物复合物为腺苷_5’ -磷酸硫酸酐； (7)盒体:全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。
2.焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性的检测方法，其特征在于采用如权利要求I所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒，包括如下步骤: (1）人类全血基因组DNA提取:采用所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的全血基因组DNA提取部分试剂，包括利用缓冲液GB和蛋白酶K溶解外周血白细胞，缓冲液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脱液TB洗脱得到DNA成分，整个提取反应以吸附柱CB3为DNA与细胞碎片和DNA与蛋白质分离的介质； (2)多重PCR扩增反应:采用所述焦磷酸测序氯吡格雷个体化用药基因多态性检测试剂盒的多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂，具体的反应体系和反应条件如表1和表2所示； 表1多重PCR扩增反应体系
【文档编号】C12Q1/68GK103789446SQ201410067924
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】叶辉铭, 苏晓崧, 张忠英 申请人:厦门大学附属中山医院, 叶辉铭