Hcv重组融合抗原及其表达基因和制备方法
【专利摘要】本发明公开了丙型肝炎重组融合抗原及其表达基因和制备方法。所述的丙型肝炎重组融合抗原的氨基酸组成由SEQ?ID?NO.1所示氨基酸、第一连接子、SEQ?ID?NO.2所示氨基酸、第二连接子、SEQ?ID?NO.3所示氨基酸、第三连接子及SEQ?ID?NO.4所示氨基酸顺次组合构成，每个连接子分别由6个柔性分子量小的、极性且亲水的氨基酸构成。其制备方法包括：重组质粒pET41a-Core-NS3-NS41-NS42的构建；丙型肝炎重组融合抗原的表达和纯化。所述的丙型肝炎重组融合蛋白具有较高的灵敏度和特异性，可应用于生物医药领域，特别是应用在丙型肝炎抗体胶体金检测试纸条中。
【专利说明】HCV重组融合抗原及其表达基因和制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药生物领域，具体是涉及一种HCV重组融合抗原及其表达基因和制备方法
【背景技术】
[0002]丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis c virus, HCV)感染引起的，非A,非B(NANB)病毒性肝炎。1974年Ianeld首次报告输血后非甲非乙型(NANB)肝炎，1989年Choo等成功从受感染的黑猩猩血液标本中分离得到(NANB)病毒，并从此展开对这一陌生病毒的研究。据世界卫生组织统计，全球HCV的平均感染率为3%左右，约有117~210亿人感染HCV，每年新发病例约315万例，每年约有35万人因丙肝相关疾病而死亡。
[0003]丙型肝炎病毒主要通过血液传播，占据输血后肝炎的80-90%，急性丙型肝炎中，50%-60%患者会发展成慢性肝炎，其中20%又有可能进一步发展成肝硬化。由于目前没有有效治疗丙型肝炎的药物，早期发现HCV感染，准确判断病毒亚型及患者感染状况，是有效防控丙肝的重要手段。因此，研制特异性强、灵敏度高和稳定性好的诊断试剂，对血源及血制品执行严格筛查程序，是控制HCV传播的必然选择。
[0004]HCV是黄病毒科，正链RNA，全长9.5kb，仅有一个开放阅读框，编码一个3011个氨基酸的聚蛋白前体。蛋白前体在宿主及病毒自身蛋白酶的作用下，被切割成多个功能蛋白，包括结构蛋白:核衣壳蛋白Core，囊膜糖蛋白El和E2，和非结构蛋白P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B。该病毒的这一复杂的蛋白组成体系给丙型肝炎病毒诊断试剂的研发带来很大困难。从1989年HCV的发现至今，国际HCV诊断试剂的发展先后经历三个阶段。第一代抗-HCV ELISA诊断试剂采用的抗原C100-3是HCV非结构基因(NS3/NS4)和人超氧化物歧化酶(SOD)基因嵌合后表达的融合蛋白，由于ClOO只含363个氨基酸,而HCV基因组编码的蛋白有长达3011个氨基酸，因此C100-3抗原-抗体系统只代表整个HCV抗原-抗体系统中很小部分，所以敏感性不高，很难满足试剂检测需求；另外，抗C100-3出现比较晚，不满足早期诊断的基本条件。第二代抗-HCV ELISA诊断试剂在第一代基础上增加了核心区重组蛋白C22和NS3区重组蛋白C33c，使检出率提高了 25%~30%，而且检测抗体的窗口期也有所缩短，但由于重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以仍存在抗-SOD造成的假阳性问题和少数漏检问题。当前用的第三代抗-HCV ELISA诊断试剂，其包被抗原为HCV核心抗原Core，NS3、NS4和NS5抗原，使特异性达到99%。虽然第三代HCV抗体ELISA诊断试剂增加了 HCV NS5区表达的蛋白作为抗原，提高了试剂敏感性，但从HCV感染到可检测出抗体仍40多天，因此，第三代ELISA诊断试剂的质量仍有很大改进空间。
[0005]目前，国际上的主流试剂主要是采用HCV基因组表达的多区段优势抗原，如结构区核壳蛋白C22、非结构NS3区C33c、NS4区ClOO或5_1_1抗原等组装成HCV诊断试剂，如CHIRON? RffiA? HCV3. 0sia。CHIRON? RIBA? HCV3.0sia 是目前公认的丙型肝炎确诊试剂，经调查，该试剂也是国内外很多科研院校相关学术研究成果报道中的确诊参比试剂。该试剂也是选用了 HCV的主要的优势抗原表位，包括两个重组抗原(C33C和NS5)及两个合成多肽(C100P和5-1-1P)。但是单个小蛋白的表达耗时费力，合成肽成本高，在胶体金检测试剂中的应用更加困难。
[0006]在近年病毒免疫学的研究中，有人提出“多表位抗原”的概念，将病毒主要的抗原表位进行融合表达。通过基因工程技术手段，将多个优势表面抗原肽基因融合表达，不仅可以省去分别表达、单个纯化不同抗原的烦琐操作，而且还可以满足诊断试剂盒所要求的等摩尔比混合的要求。如1994年CHIEN等表达了融合抗原C25，2001年沈小川等表达的Core-NS3-NS4抗原，都表现了良好的抗原性和特异性。黄建生等优选了 5个高度保守的T细胞及(或)B细胞表位，组合成一个HCV多表位融合蛋白，氨基酸序列及位置分别为核心蛋白(I ~16，132 ~141)，El (126 ~135)，NS3 (139 ~147)及 NS5 (768 ~775)。但是该研究结果显示，检测HCV的阳性率高达90%，其中假阳率高达20%，因此显然仅仅考虑抗原的线性表位是不合理的。2010年聂东宋等也发表了关于HCV融合多表位抗原的报道，但是该融合蛋白也仅仅处于实验室研究阶段，在灵敏度及特异性评价中仅检测10慢性肝病患者和5份HCV阴性的血清进行检测，没有涉及后续的研究。并且实验选用的抗原表位过于简短，虽然包括了主要的抗原表位，但不能折叠成HCV的空间构象，这种蛋白如果用于诊断试剂用抗原，必定造成漏检及假阳。
[0007]经对丙型肝炎病毒的免疫学信息研究发现，HCV在患者血液中的抗体主要是对以下抗原表位的免疫应答产生，Core (2-120aa), NS3 (1192-1457)，NS4 (1694-1735)，NS4(1859-1931)，NS5A(2212-2313)。2005年，余龙林课题组将第三代抗一 HCVELISA诊断试剂所需全长NS5A和高免疫源区NS5A蛋白(氨基酸2212~2313)的基因分别进行原核表达后，灵敏度检测结果发现，NS5A全长基因重组蛋白与NS5A高免疫区基因重组蛋白都具有良好的免疫学检测效果，但NS5A全长重组蛋白的检测灵敏度明显高于NS5A高免疫区重组蛋白。且有研究报道显示，NS5A和NS4免疫应答产生的抗体存在一定的交叉，即对NS5A免疫应答产生的抗体与NS4抗原有特异性的反应。另外，第三代诊断试剂加入的NS5A全长基因表达的蛋白过大，与Core、NS3、NS4优势抗原表位串联表达后，会因空间结构的遮挡而使部分抗原表位不能暴露在分子表面；另外，查阅国内外报道，没有血清中仅与NS5发生特异性反应的抗体。基于以上原因，该研究选取合适的Core (2-125aa)、NS3 (1192~1459)、NS4(1694-1735aa)、NS4 (1901_1936aa)基因`片段，通过6个氨基酸的柔性链接子进行串联，进行融合表达。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题之一是提供一种检测HCV抗体的重组融合抗原。
[0009]解决上述技术问题的技术方案如下:
[0010]一种HCV重组融合抗原，由SEQ ID N0.1所示氨基酸、第一连接子、SEQ ID N0.2所示氨基酸、第二连接子、SEQ ID N0.3所示氨基酸、第三连接子及SEQ ID N0.4所示氨基酸顺次组合构成，每个连接子分别由6个柔性分子量小的、极性且亲水的氨基酸构成。
[0011]在其中一个实施例中，所述第一连接子的氨基酸组成如SEQ ID N0.5 ;所述第二连接子的氨基酸组成如SEQ ID N0.6 ;所述第三连接子的氨基酸组成如SEQ ID N0.7所示。
[0012]本发明的另一目的是提供编码上述HCV重组融合抗原的表达基因。
[0013]解决上述技术问题的技术方案如下:[0014]一种编码权利要求1所示的HCV重组融合抗原的表达基因，包括a:由SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列、编码第一连接子的核苷酸序列、SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列、编码第二连接子的核苷酸序列、SEQ ID N0.10所示的核苷酸序列、编码第三连接子的核苷酸序列及SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列顺次组合构成；b:与a的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与a的核苷酸序列不同的序列；C:对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
[0015]在其中一个实施例中，所述编码第一连接子的核苷酸序列为SEQ ID N0.12;所述编码第二连接子的核苷酸序列为SEQ ID N0.13、所述编码第三连接子的核苷酸序列为SEQID N0.14 所示。
[0016]本发明另一发明目的是提供上述HCV重组融合抗原的制备方法。
[0017]实现该目的的技术方案如下:
[0018]上述HCV重组融合抗原的制备方法，其步骤如下:
[0019](I)得到碱基组成序列为SEQ ID N0.26的基因片段；
[0020](2)将所述基因片段经BamHI和HindII双酶切，酶切产物纯化回收后，与经同样限制性内切酶酶切后的表达载体连接；
[0021 ] (3)通过热激法将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5 α，涂布于含50 μ g/ml Kan+的LB琼脂培养基上，筛选得到阳性质粒；
[0022](4)将步骤(3)中得到的阳性质粒，通过热激法转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含Kan+的LB琼脂培养基上，培养；挑取单菌落接种至Kan+的LB液体培养基中，培养过夜；次日，转接于新鲜的含Kan+的LB液体培养基中，培养至0D600~0.4~
0.6时加入IPTG至终浓度0.2~0.6mM,低温`诱导培养4~5h ;得到HCV重组融合抗原。
[0023]优选地，步骤(4)为:将步骤(3)中得到的阳性质粒，通过热激法转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于Kan+浓度为50 μ g/ml的LB琼脂培养基上，37°C培养16h ;挑取单菌落接种至含50 μ g/ml Kan+的LB液体培养基中，37°C，培养过夜；次日，以1:100转接于新鲜的含50 μ g/ml Kan+的LB液体培养基中，37 °C，培养至0D600 ^ 0.4~0.6时加入IPTG至终浓度0.2~0.6mM,低温诱导培养4~5h ;得到HCV重组融合抗原。
[0024]在其中一个实施例中，所述表达载体为pET41a。利用该表达载体上促进蛋白可溶表达的GST标签得到上清表达的HCV重组融合抗原。
[0025]在其中一个实施例中，步骤(4)诱导培养的温度为20~37°C (更优选为20~25°C)。该低温诱导可以降低蛋白表达速率，提高蛋白可溶表达量。
[0026]在其中一个实施例中，所述制备方法还包括步骤(5)纯化:诱导培养后收集菌体，并用蒸馏水洗涤两次后用20mM PBS pH7.3的缓冲液重悬；加入ImM PMSF后冰浴条件下超声破碎，离心；取上清进行纯化；上样缓冲液为20mM PBS pH7.3 ;平衡缓冲液为:20mMTrisUOmM GSHUM NaCl pH8.0 ;洗脱缓冲液为:50mM Tris、50mM GST pH8.0 ;最后将洗脱的目的蛋白在保存Buffer中透析过夜。
[0027]发明的有益效果如下:
[0028]1、本发明旨在研发一种重组融合HCV抗原，该融合抗原涵盖了 HCV核衣壳蛋白及非结构蛋白NS3、NS4的主要抗原表位，具有很高的灵敏度及特异性。
[0029]2、此外，此融合抗原在设计上，经过对蛋白的疏水氨基酸截除，很大程度提高了抗原的亲水性而不损害抗原性。
[0030]3、进一步地，为了最大程度提高此抗原的亲水性，根据各抗原表位自身一级结构和二级结构的特点选择不同的亲水性较强的连接子连接不同的抗原表位，该连接子的选择也很大程度提高了重组抗原的亲水性。
[0031]4、经验证，本发明制备的重组抗原溶解性好，可在大肠杆菌菌体内完成折叠，可溶表达，不需要后期的复性而有很高的活性，从而克服了重组HCV抗原由于溶解性差而在免疫检测的应用中受限的缺点。
[0032]5、同时，本发明也公布了经筛选优化后的HCV各抗原表位的基因序列，及整个抗原设计构建的技术路线，为高品质HCV抗体快速检测试剂的开发奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1:实施例2中重组表达质粒的酶切鉴定图；从左到右，依次为=Marker DL5000、酶切结果、PET41a-Core-NS3-NS41-NS42。
[0034]图2:实施例3中重组抗原诱导表达鉴定图；从左到右，依次为:蛋白Marker、沉淀、上清、全菌。
[0035]图3:实施例4中重组抗原纯化电泳图。从左到右，依次为:蛋白Marker、破碎上清、流穿样品、洗脱目的 蛋白。
【具体实施方式】
[0036]实施例一:HCV融合抗原的设计
[0037]由于病毒性传染病的抗原往往较大，难以实现体外完整蛋白的表达，即使能够实现完整蛋白的表达，由于种属差异，分子量比较大的蛋白往往不能正确折叠，后期的复性困难，而制约检测试剂的开发。因此利用基因工程技术，将多个优势表面抗原肽基因融合表达成为抗原研究的方向。本发明通过大量实验的筛选，最后确定选取core (2-125aa)、NS3(1192 ~1459aa)、NS4 (1694_1735aa)、NS4 (1901_1936aa)四个有优势抗原表位，对密码子进行优化后分别通过亲水性较强的柔和连接子GGGGGG、SGGGGS, GGGSGG将其串联。选取的Core的抗原表位为2-125aa，其氨基酸序列为SEQ ID N0.1，对应的优化后的核苷酸序列为SEQ ID N0.8。选取的NS3的优势抗原表位为1192~1459aa，其氨基酸序列为SEQ IDN0.2，对应的优化后的核苷酸序列为SEQ ID N0.9。选取的NS4的两个优势抗原表位分别为 1694-1735aa、1901-1936aa，其对应的氨基酸序列分别为 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4，对应的优化后的核苷酸序列分比为SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11。将上述四个抗原表位通过相应的连接子串联后的氨基酸序列为SEQ ID N0.23，该HCV重组融合抗原对应优化后的核苷酸组成序列为SEQ ID N0.24。
[0038]以上优化的整一条编码融合抗原的表达基因序列采用化学合成的方法得到四个抗原表位的核苷酸序列(SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.11)，然后以SEQ ID N0.8为模板，以SEQ ID N0.15,SEQ ID N0.16为引物进行PCR扩增，纯化回收后得到基因片段I ;以SEQ ID N0.9为模板，以SEQ ID N0.17,SEQ ID N0.18为引物进行PCR扩增，纯化回收后得到基因片段I1:以SEQ ID N0.10为模板，以SEQ ID N0.19,SEQ ID N0.20为引物进行PCR扩增，纯化回收后得到基因片段III ;以SEQ ID N0.11为模板，以SEQ IDN0.21、SEQ ID N0.22为引物进行PCR扩增，纯化回收后得到基因片段IV ;将片段I和片段111:1混合后的混合片段为模板，以SEQ ID N0.15,SEQ ID N0.18为引物进行PCR扩增，纯化回收后得到片段V;将片段V和片段1115:1混合后的混合片段为模板，以SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.20为引物进行PCR扩增，纯化回收后得到片段VI ;将片段VI和片段IV5:1混合后的混合片段为模板，以SEQ ID N0.15,SEQ ID N0.22为引物进行PCR扩增，纯化回收后得到目的基因片段SEQ ID N0.26。
[0039]实施例二:HCV融合抗原表达载体的构建
[0040]经生物学软件分析发现该重组蛋白疏水性强，为了增加该蛋白的水溶性，本发明优先选择主要的抗原表位，并尽量去掉疏水性较强的非抗原表位区；同时优先的选择pET41a作为表达载体，利用该表达载体上亲水性较强的促溶标签GST使蛋白可溶表达。
[0041]将实施例一中得到的目的基因片段(SEQ ID N0.26)和表达载体pET41a分别经限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，16°C过夜连接，并将连接产物通过热激法转入感受态DH5 α，涂布于含50 μ g/ml Kan+的LB琼脂培养基上，筛选得到阳性质粒。次日挑取阳性克隆子培养提取质粒测序及酶切鉴定。测序结果与预期一致，没有任何碱基置换；双酶切鉴定可见一条大小1400bp左右的目的片段(SEQ ID N0.24)，大小正确，说明目的基因已成功克隆入表达载体pET41a，并命名为pET41a-Core-NS3-NS41-NS42 (见图1)。
[0042]实施例三:HCV融合抗原的诱导表达及纯化 [0043]3.1融合抗原的诱导表达:将测序正确的酶切鉴定过的阳性重组质粒用热激发转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)感受态细胞，复苏后涂布于Kan+浓度为50 μ g/ml的LB琼脂培养基上，37°C培养16h ;挑取4个单菌落接种至含50 μ g/ml Kan+的5ml LB液体培养基中，37°C，200r/min培养过夜;次日，以1:100比例转接于5ml新鲜含50 μ g/ml Kan+的LB液体培养基中，37°C，200r/min培养至0D600 ^0.6时，按正交试验进行表达因素筛选，包括温度、诱导剂量、诱导时间、宿主菌OD值以及培养基pH值等；结果发现，加入IPTG至终浓度0.5mM，25°C诱导培养5h时，蛋白可以部分可以可溶性上清表达，且上清表达量达到最高(图 2)。
[0044]3.2融合抗原的纯化按上述确定的诱导条件进行大量发酵培养400ml。收集菌体，并用蒸馏水洗涤两次后用20mM PBS pH7.3的缓冲液重悬；加入ImM PMSF后冰浴条件下超声破碎(超声破碎条件为:超声5s,间隔12s,超声总时间为15min);12000rpm/min,4°C离心15min ;取上清进行纯化。上样缓冲液为20mM PBS pH7.3 ;平衡缓冲液为:20mM TrisUOmMGSHUM NaCl pH8.0 ;洗脱缓冲液为:50mM Tris、50mM GST pH8.0 ;最后将洗脱的目的蛋白在保存Buffer中透析过夜。HCV重组融合蛋白保存Buffer为:20mM TrisUmM EDTA、0.02%叠氮钠、20%甘油。透析后蛋白纯度大于90% (图3)。
[0045]实施例四:HCV融合抗原灵敏度检测
[0046]在其它生产工艺完全一致的情况下，用本发明的实施例3所制备的HCV重组融合抗原代替广州万孚生物技术股份有限公司生产的HCV胶体金检测试纸条的标记蛋白(暂命名为:所述HCV重组融合抗原制备的CS3S4胶体金试纸条)，并检测公司内控标准阳性样本，进行本发明蛋白的灵敏度评价。结果表明本发明重组融合抗原对公司现有阳性质控品的检测均能达到公司对该产品的要求，能满足免疫诊断试剂开发的需求(表1)
[0047]表1CS3S4胶体金试纸条灵敏度检测结果[0048]
【权利要求】
1.一种HCV重组融合抗原，其特征是，由SEQ ID N0.1所示氨基酸、第一连接子、SEQ IDN0.2所示氨基酸、第二连接子、SEQ ID N0.3所示氨基酸、第三连接子及SEQ ID N0.4所示氨基酸顺次组合构成，每个连接子分别由6个柔性分子量小的、极性且亲水的氨基酸构成。
2.根据权利要求1所述的HCV重组融合抗原，其特征是，所述第一连接子的氨基酸组成如SEQ ID N0.5 ;所述第二连接子的氨基酸组成如SEQ ID N0.6 ;所述第三连接子的氨基酸组成如SEQ ID N0.7所示。
3.一种编码权利要求1所示的HCV重组融合抗原的表达基因，其特征是，包括a:由SEQID N0.8所示的核苷酸序列、编码第一连接子的核苷酸序列、SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列、编码第二连接子的核苷酸序列、SEQ ID N0.10所示的核苷酸序列、编码第三连接子的核苷酸序列及SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列顺次组合构成； b ?与a的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与a的核苷酸序列不同的序列； c:对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的表达基因，其特征是，所述编码第一连接子的核苷酸序列为SEQ ID N0.12 ;所述编码第二连接子的核苷酸序列为SEQ ID N0.13、所述编码第三连接子的核苷酸序列为SEQ ID N0.14所示。
5.一种权利要求1所述HCV重组融合抗原的制备方法，其特征是，其步骤如下: (1)得到碱基组成序列为SEQID N0.26的基因片段； (2)将所述基因片段经BamHI和HindII双酶切，酶切产物纯化回收后，与经同样限制性内切酶酶切后的表达载体连接； (3)通过热激法将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含50 μ g/ml Kan+的LB琼脂培养基上，筛选得到阳性质粒； (4)将步骤(3)中得到的阳性质粒，通过热激法转入大肠杆菌E.coli BL2KDE3)感受态细胞，涂布于含Kan+的LB琼脂培养基上，培养；挑取单菌落接种至Kan+的LB液体培养基中，培养过夜；次日，转接于新鲜的含Kan+的LB液体培养基中，培养至0D600~0.4~0.6时加入IPTG至终浓度0.2~0.6mM，低温诱导培养4~5h ;得到HCV重组融合抗原。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，步骤(4)为:将步骤(3)中得到的阳性质粒，通过热激法转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于Kan+浓度为50 μ g/ml的LB琼脂培养基上，37°C培养16h ;挑取单菌落接种至含50 μ g/ml Kan+的LB液体培养基中，370C，培养过夜；次日，以1:100转接于新鲜的含50 μ g/ml Kan+的LB液体培养基中，37°C，培养至0D600 ^ 0.4~0.6时加入IPTG至终浓度0.2~0.6mM，低温诱导培养4~5h ;得到HCV重组融合抗原。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述表达载体为pET41a。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，步骤(4)诱导培养的温度为20~37°C。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述制备方法还包括步骤(5)纯化:诱导培养后收集菌体，并用蒸馏水洗涤两次后用20mM PBS pH7.3的缓冲液重悬;加入ImM PMSF后冰浴条件下超声破碎，离心；取上清进行纯化；上样缓冲液为20mM PBS pH7.3 ;平衡缓冲液为:20mM Tris、10mM GSH、1M NaCl pH8.0 ;洗脱缓冲液为:50mM Tris、50mM GST ρΗ8.0。
【文档编号】C12N15/62GK103819565SQ201410068106
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】任艳娜, 才蕾, 唐时幸, 王继华 申请人:广州万孚生物技术股份有限公司