一种高纯度α-环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高纯度α-环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法，本发明采用以下步骤实现：首先进行α-环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液制备、再进行发酵上清液饱和硫酸铵沉淀、进行离子交换柱层析、进行Native-PAGE电泳分离、再进行目标蛋白的电泳回收，即可得到高纯度的α-环糊精葡萄糖基转移酶酶。与现有技术相比，本发明制备出的α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯度高且制备步骤少，生产效率高，能够满足环糊精工业化生产的要求，减少了环糊精后期提纯的难度，使得环糊精的生产成本大大降低，极大地提高了CGTase的应用和环糊精的规模化生产，具有推广应用的价值。
【专利说明】一种高纯度Cl -环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，尤其涉及一种高纯度α -环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法。
【背景技术】
[0002]环糊精是由D-吡喃葡萄糖基以α -1, 4葡萄糖苷键连接而成的环状低聚糖，其中最常见的是α -环糊精、β -环糊精、Υ -环糊精，分别由六个、七个和八个葡萄糖分子构成。环糊精分子经X射线衍射和核磁共振研究证明其具有中空圆筒状结构，内部疏水，外部亲水，可将许多化学物质包结在其环形空隙里，从而改变这些被包结物质的稳定性、溶解性、挥发性及化学反应性能等各种理化性质，因而广泛应用于医药、食品、化妆品、化学分析、环保、农业、化学检测等诸多领域；此外，经小鼠毒理学实验已证明环糊精的使用安全性与一般的淀粉或糊精相同。因而环糊精受到了各行业尤其是化妆品、食品和医药行业的青睐，其全球需求量呈逐年大幅度增长。
[0003]目前，环糊精的工业化生产均采用来自芽孢杆菌属的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase;EC2.4.1.19)催化淀粉等相关基质来合成；不同微生物来源的CGTase性质差异较大，但普遍存在野生菌株产酶能力低、产物专一性不强和耐热性差等缺陷，一方面导致CGTase的产量远不能满足环糊精工业化生产的要求，另一方面增加了环糊精后期提纯的难度，使得环糊精的生产成本大大增加，极大地限制了 CGTase的应用和环糊精的规模化生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目 的就在于为了解决上述问题而提供一种高纯度α -环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法。
[0005]本发明通过以下技术方案来实现上述目的:
[0006]本发明包括以下步骤:
[0007]步骤一:进行α -环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液制备:α -环糊精葡萄糖基转移酶产生菌经96h发酵后，对发酵液进行离心处理，收集上清液即为粗酶液；
[0008]步骤二:进行发酵上清液饱和硫酸铵沉淀:冰浴条件下，往发酵上清液中加入已研碎的硫酸铵直至饱和度为90%，4°C冰箱放置沉淀过夜；第二天离心收集沉淀，收集的沉淀经Tris-HCl Buffer复溶后于4°C冰箱中透析除盐；
[0009]步骤三:进行离子交换柱层析:取适量透析保留液进行DEAE-Sepharose Fastflow离子交换柱层析，离子交换柱用含0.04M NaCl的Tris-HCl Buffer平衡,用含0.1MNaCl的Tris-HCl Buffer进行洗脱，流速设定为0.5ml/min，采用部分收集器收集馏分，每3ml收集I管，碘显色法确定具有酶活性的馏分，并对活性馏分进行冷冻干燥；
[0010]步骤四:进行Native-PAGE电泳分离:冷冻干燥样品经最小体积的上样缓冲液复溶后进行Native-PAGE电泳分离，电泳结束后切取部分凝胶进行R-250染色和活性染色以进行目标蛋白的定位；
[0011]步骤五:进行目标蛋白的电泳回收:确定目标蛋白在凝胶中的位置后，将包含目标蛋白的凝胶切下并放入透析袋内，往透析袋内加入适量的电极液即可进行电泳回收，期间隔几个小时收集已电泳出来的组分，将电泳出的组分合并于透析袋内透析以去除电极液中高浓度的甘氨酸组分，透析采用磷酸盐缓冲液(pH=6.0);透析保留液冷冻干燥即可获得高纯度的α-环糊精葡萄糖基转移酶酶。
[0012]进一步，所述步骤一中的发酵液进行离心处理和所述步骤二中的离心收集沉淀的离心条件均为4°C、13000g离心lOmin。所述步骤四中进行Native-PAGE电泳分离的电泳条件为:分离胶浓度12%，浓缩胶浓度4%，电泳电压300V，电泳温度4°C，电泳时间为6h。所述步骤五中电泳回收的电泳条件为:电压60V，电泳温度4°C。
[0013]本发明的有益效果在于:
[0014]本发明是一种高纯度α -环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法，与现有技术相t匕，本发明制备出的α -环糊精葡萄糖基转移酶的纯度高且制备步骤少，生产效率高，能够满足环糊精工业化生产的要求，减少了环糊精后期提纯的难度，使得环糊精的生产成本大大降低，极大地提高了 CGTase的应用和环糊精的规模化生产，具有推广应用的价值。
【具体实施方式】
[0015]下面对本发明作进一步说明:
[0016]本发明包括以下步骤:
[0017]步骤一:进行α -环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液制备:α -环糊精葡萄糖基转移酶产生菌经96h发酵后，对发酵液进行离心处理，收集上清液即为粗酶液；
[0018]步骤二:进行发酵上清液饱和硫酸铵沉淀:冰浴条件下，往发酵上清液中加入已研碎的硫酸铵直至饱和度为90%，4°C冰箱放置沉淀过夜；第二天离心收集沉淀，收集的沉淀经Tris-HCl Buffer复溶后于4°C冰箱中透析除盐；
[0019]步骤三:进行离子交换柱层析:取适量透析保留液进行DEAE-Sepharose Fastflow离子交换柱层析,离子交换柱用含0.04M NaCl的Tris-HCl Buffer (pH8.9)平衡,用含0.1M NaCl的Tris-HCl Buffer (ρΗ8.9)进行洗脱，流速设定为0.5ml/min，采用部分收集器收集馏分，每3ml收集I管，碘显色法确定具有酶活性的馏分，并对活性馏分进行冷冻干燥；
[0020]步骤四:进行Native-PAGE电泳分离:冷冻干燥样品经最小体积的上样缓冲液复溶后进行Native- PAGE电泳分离，电泳结束后切取部分凝胶进行R-250染色和活性染色以进行目标蛋白的定位；
[0021]步骤五:进行目标蛋白的电泳回收:确定目标蛋白在凝胶中的位置后，将包含目标蛋白的凝胶切下并放入透析袋内，往透析袋内加入适量的电极液即可进行电泳回收，期间隔几个小时收集已电泳出来的组分(防止α-环糊精葡萄糖基转移酶经长时间的电泳而发生变性)，将电泳出的组分合并于透析袋内透析以去除电极液中高浓度的甘氨酸组分，透析采用磷酸盐缓冲液(ρΗ=6.0);透析保留液冷冻干燥即可获得高纯度的α -环糊精葡萄糖基转移酶酶。
[0022]进一步，所述步骤一中的发酵液进行离心处理和所述步骤二中的离心收集沉淀的离心条件均为4°C、13000g离心lOmin。所述步骤四中进行Native-PAGE电泳分离的电泳条件为:分离胶浓度12%，浓缩胶浓度4%，电泳电压300V，电泳温度4°C，电泳时间为6h。所述步骤五中电泳回收的电泳条件为:电`压60V，电泳温度4°C。
【权利要求】
1.一种高纯度α-环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一:进行α-环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液制备:α -环糊精葡萄糖基转移酶产生菌经96h发酵后，对发酵液进行离心处理，收集上清液即为粗酶液； 步骤二:进行发酵上清液饱和硫酸铵沉淀:冰浴条件下，往发酵上清液中加入已研碎的硫酸铵直至饱和度为90%，4°C冰箱放置沉淀过夜；第二天离心收集沉淀，收集的沉淀经Tris-HCl Buffer复溶后于4°C冰箱中透析除盐； 步骤三:进行离子交换柱层析:取适量透析保留液进行DEAE-Sepharose Fast flow离子交换柱层析，离子交换柱用含0.04M NaCl的Tris-HCl Buffer平衡，用含0.1M NaCl的Tris-HCl Buffer进行洗脱,流速设定为0.5ml/min,采用部分收集器收集懼分,每3ml收集I管，碘显色法确定具有酶活性的馏分，并对活性馏分进行冷冻干燥； 步骤四:进行Native-PAGE电泳分离:冷冻干燥样品经最小体积的上样缓冲液复溶后进行Native-PAGE电泳分离，电泳结束后切取部分凝胶进行R-250染色和活性染色以进行目标蛋白的定位； 步骤五:进打目标蛋白的电泳回收:确定目标蛋白在凝月父中的位直后，将包含目标蛋白的凝胶切下并放入透析袋内，往透析袋内加入适量的电极液即可进行电泳回收，期间隔几个小时收集已电泳出来的组分，将电泳出的组分合并于透析袋内透析以去除电极液中高浓度的甘氨酸组分，透析采用磷酸盐缓冲液；透析保留液冷冻干燥即可获得高纯度的α-环糊精葡萄糖基转移酶酶。
2.根据权利要求1所述的高纯度α-环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法，其特征在于:所述步骤一中的发酵`液进行离心处理和所述步骤二中的离心收集沉淀的离心条件均为 4°C、13000g 离心 IOmin0
3.根据权利要求1所述的高纯度α-环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法，其特征在于:所述步骤四中进行Native-PAGE电泳分离的电泳条件为:分离胶浓度12%，浓缩胶浓度4%，电泳电压300V，电泳温度4°C，电泳时间为6h。
4.根据权利要求1所述的高纯度α-环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法，其特征在于:所述步骤五中电泳回收的电泳条件为:电压60V，电泳温度4°C。
【文档编号】C12N9/10GK103820413SQ201410076463
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2014年3月4日
【发明者】陈济琛, 林新坚, 叶学军, 林陈强, 张慧 申请人:福建省农业科学院土壤肥料研究所