一种具有持续合成能力和盐耐受度的新型dna聚合酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶，是在金黄色葡萄球菌DNA聚合酶I（Sau）中插入有来源于T7噬菌体DNA聚合酶中的硫氧还蛋白结合结构域（TBD）而得到的杂合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还提供了编码该蛋白的基因以及该蛋白的制备方法和用途。本发明改造后的DNA聚合酶催化活力维持不变，但是持续合成能力显著提高，并且对盐的耐受性提高，在田间和现场检测过程中能够显著提高重组酶介导的核酸恒温扩增技术的DNA扩增效果，具有广泛的应用前景。
【专利说明】一种具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学和蛋白质工程领域，涉及一种具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶。
【背景技术】
[0002]在生物学研究、医学检验、法医鉴证及农业等相关领域，核酸的扩增都是一种非常重要的技术。目前，应用最为广泛的核酸扩增技术是聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction, PCR)。PCR技术利用反应温度的循环变化来实现目的序列的变性、复性和延伸，能够在2-3小时之内实现目的序列的指数级扩增。然而，由于PCR技术依赖体积大、耗电量高、价格昂贵的PCR仪来实现，限制了其在现场及田间检测中的广泛应用。
[0003]近些年，在DNA、RNA合成的分子生物学领域有许多的研究进展，许多在体内核酸扩增过程中发挥重要辅助作用的蛋白被相继发现。在这些研究进展的基础上，人们开发了多种恒温核酸扩增技术，如转录介导的核酸扩增技术、链置换核酸扩增技术、环介导核酸恒温扩增技术，及重组酶介导的核酸扩增技术等。与传统的PCR技术相比，恒温核酸扩增技术除了脱离PCR仪，能够在恒温条件下进行核酸扩增的优势以外，有一些恒温核酸扩增技术还对一些扩增反应的抑制因素具有更高的耐受能力。
[0004]重组酶介导的核酸扩增技术是新近开发的恒温核酸扩增技术之一。该技术模拟生物体内DNA的复制过程,利用酵母Rad51蛋白和大肠杆菌RecA蛋白来介导模板链的解链以及实现模板和扩增引物之间的链替换；在SSB蛋白的辅助下，DNA聚合酶可以对链替换后的DNA实现特异性的延 伸。该技术由ATP供能，并由磷酸肌酸催化实现ATP的再生。37°C恒温条件下，重组酶介导的核酸扩增技术能够在20-60min之内实现对目的片段的指数级别扩增。该技术还能够与SYBR green I，SYT0-13或SYT0-82等共同作用，利用肉眼可见荧光染料来对扩增结果进行判断。这样既可以避免反复开关反应管而造成交叉污染的问题，又无需依赖具有致癌性的核酸电泳试剂以及昂贵的凝胶成像系统，使得重组酶介导的核酸扩增技术的应用与传统的PCR技术相比更加便捷，也更加适用于现场和田间检测使用。
[0005]重组酶介导的核酸恒温扩增技术中使用的DNA聚合酶是枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I (Bacillus subtilis Pol I, Bsu)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Pol I，Sau)，这两种DNA聚合酶均属于DNA聚合酶I家族。DNA聚合酶I家族是负责DNA复制过程中损伤修复的聚合酶，该家族中大部分DNA聚合酶的持续合成能力都不高，也就是说该家族的聚合酶与模板结合一次能催化的聚合反应数目较少。T7噬菌体中的DNA聚合酶也属于DNA聚合酶I家族,然而它含有一段其他I类DNA聚合酶所不含有的蛋白序列(硫氧还蛋白结合结构域，thioredoxin binding domain, TBD),该序列能够与来源于大肠杆菌的硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)特异性的相互结合。Trx具有DNA结合作用，它与T7卩遼菌体中的DNA聚合酶的1:1结合能够大幅提高T7噬菌体中的DNA聚合酶的持续合成能力。因此，利用TBD结构域与Trx蛋白相互结合作用的机理对其他DNA聚合酶进行改造也许能为提高DNA聚合酶的持续合成能力提供一条很好的思路。
【发明内容】
[0006]本发明的第一目的是提供一种具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶，是在金黄色葡萄球菌DNA聚合酶I (Sau)中插入有来源于T7噬菌体DNA聚合酶中的硫氧还蛋白结合结构域(TBD)而得到杂合的DNA聚合酶，力求克服DNA聚合酶I家族中大部分DNA聚合酶的持续合成能力不高的问题。
[0007]本发明的第二目的是提供编码上述具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶的基因。
[0008]本发明的第三目的是提供上述具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶的制备方法。
[0009]本发明的第四目的是提供上述具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶的用途。
[0010]本发明通过以下技术方案来实现:
[0011]一、一种具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶，是在金黄色葡萄球菌DNA聚合酶I (Sau)中插入有来源于T7噬菌体DNA聚合酶中的硫氧还蛋白结合结构域(TBD)而得到的杂合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0012]二、编码上述具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]三、上述的具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0014](I)确定T7噬菌体DNA聚合酶TBD结构域在Sau蛋白中的对应位置，以及目标替换序列；
[0015](2)根据GenBank已经公布的Sau基因序列以及TBD序列信息设计并合成引物，并通过Overlap PCR技术扩增得到带有纯化标签、酶切位点的将TBD插入Sau基因序列正确位置的Sau-TBD片段；
[0016](3)将步骤(2)中得到的Sau-TBD克隆至表达载体pTrc99A中构建重组载体pTrc99A-Sau~TBD ；
[0017](4)表达载体pTrc99A_Sau_TBD转化大肠杆菌、诱导表达得蛋白。
[0018]四、上述的具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶在常温核酸扩增技术中的应用。
[0019]采用上述技术方案的积极效果:本发明对恒温核酸扩增技术中DNA聚合酶进行了分子生物学改造，改造后催化活力维持不变，但是持续合成能力显著提高，并且在重组酶介导的核酸恒温扩增反应中对盐的耐受性提高；在田间和现场进行核酸检测时，由于采用比较简便的DNA提取技术，因此DNA样品模板常`不够纯，可能含有盐离子等扩增抑制类物质；改造后的DNA聚合酶，由于对盐具有更高的耐受能力，因此在田间和现场检测过程中能够显著提高重组酶介导的核酸恒温扩增技术的DNA扩增效果，具有广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】[0020]图1是T7噬菌体DNA聚合酶和Sau蛋白三维结构预测及重叠比对结果；
[0021]图2是TBD结构域在Sau蛋白序列中的插入位置；
[0022]图3是pTrc99A-Sau_TBD重组质粒构建示意图；
[0023]图4是pTrc99A-Sau_TBD重组质粒酶切鉴定结果；
[0024]图中，MMarker, lpTrc99A-Sau_TBD 质粒，2pTrc99A-Sau_TBD 质粒双酶切产物；
[0025]图5是Sau-TBD重组蛋白SDS-PAGE分析结果；
[0026]图中，M Marker，I诱导前，2诱导后，3上清，4沉淀，5流穿，6目的蛋白(约73KD);
[0027]图6是pET28a_Trx重组质粒构建示意图；
[0028]图7是pET28a_Trx重组质粒酶切鉴定结果；
[0029]图中，MMarker, lpET28a_Trx 质粒,2pET28a_Trx 质粒双酶切产物；
[0030]图8是Trx蛋白SDS-PAGE分析结果；
[0031]图中，M Marker，l诱导前，2诱导后，3上清，4沉淀，5流穿，6目的蛋白(约13KD);
[0032]图9是Sau和Sau-TBD持续合成能力检测的电泳峰图；
[0033]图中，横 坐标表示加入的核苷酸量，纵坐标表示荧光强度；
[0034]图10是Sau和Sau-TBD盐耐受度比较的电泳图。
【具体实施方式】
[0035]下面结合实施例和对比例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制:
[0036]本发明中的生物材料来源:
[0037]1、金黄色葡萄球菌CICC21600购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，大肠杆菌BL21 (DE3)购自 Novagen 公司；
[0038]2、所用引物及含有TBD基因的质粒pUC57-TBD委托中国华大基因生物科技有限公司合成；
[0039]3、所用载体 pTrc_99A 和 pET28a 购自 Novagen 公司。
[0040]实施例1
[0041]根据GenBank 公布的序列信息，在 swiss-modeI 网站(http: //swissmodel.expasy.0rg/)对T7噬菌体DNA聚合酶和Sau进行三维结构预测。.随后，利用EBI网站上的 DaliLite 功能(http: //www.eb1.ac.uk/Tools/structure/daliIite/)对 T7 卩遼菌体 DNA聚合酶(PDB:2AJQ_A)和Sau (PDB:4DQQ_D)的三维结构进行比对，并找到Sau蛋白序列中TBD结构域的对应位置，确认替换序列(如图1、图2所示)。
[0042]实施例2
[0043]本实施例用于说明Sau-TBD片段的获取。
[0044]1、根据GenBank和相关文献报道的序列信息合成T7噬菌体DNA聚合酶TBD结构域序列(NCBI登记号为ACY75853.1)，序列如SEQ ID N0.3所示。
[0045]2、根据GenBank已经公布的Sau基因序列(NCBI参考序列号为ΥΡ_006237943.I)以及TBD序列信息设计并合成引物:
[0046]PT1_F:5，-CATGCCATGGAACATCATCATCATCATCATTCAGCAAGCGTTGAAG-3’ (NcoI) (SEQID N0.4)[0047]PT1_R:5’ -GATACCACGA ACCAGCTGCATCATGGAT-3’ (SEQ ID N0.5)
[0048]PT2_F:5，-GTTGTGTTTAACCCTTCGTCTCCTAAGCAATTAGGTG-3’ (SEQ ID N0.6)
[0049]PT2 R:5’ -CGCGGATCCTTATTTTGCATCATACC-3’ (BamHI) (SEQ ID N0.7)
[0050]TBD_F:5，-TGCAGCTGGTTCGTGGTATCAGCCTAAAGG-3’ (SEQ ID N0.8)
[0051]TBD_R:5，-CACCTAATTGCTTAGGAGACGAAGGGTTAAACACAAC-3，(SEQ ID N0.9)
[0052]3、采用特异性引物PT1_F/PT1_I^PPT2_F/PT2_R，以金黄色葡萄球菌CICC21600的基因组DNA为模板，分别进行PCR扩增；采用特异性引物TBD_F/TBD_R，以人工合成的含有TBD基因的质粒pUC57-TBD为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为PrimeSTAR HS(TAKARA)建议的常规扩增体系。PCR反应程序:98°C预变性2min，98°C变性10s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，循环27次，最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0053]4、用PCR产物胶回收试剂盒分别进行PT1、PT2和TBD片段的回收，步骤如下:
[0054]I)在紫外灯下使用手术刀片快速切下目的片段琼脂糖凝胶，放入1.5ml离心管中。
[0055]2)按 1:3 的比例加入 Extraction Buffer。
[0056]3)在50°C恒温水浴锅放置lOmin，每隔2min轻柔颠倒。
[0057]4)将上一步中混合液加入Spin column中,6000Xg离心lmin,倒掉收集管液体。
`[0058]5)向 Spin column 内加 500 μ I Extraction Buffer,于 12000 X g 离心 lmin,弃去接液内液体。
[0059]6)向 Spin column 内加 750 μ I Wash Buffer,于 12000 X g 离心 lmin,弃去接液管
内液体。
[0060]7)将Spin column放回收集管内，12000Xg离心lmin。把Spin column放到无菌的1.5ml Ep管内。
[0061]8)向 Spin column 内加50μ1 Elution Buffer,并于室温静置 lmin。于 12000 X g离心lmin，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段。存放_20°C。
[0062]5、以PTl和TBD片段为模板，以PT1_F和TBD_R为引物进行Overlap PCR。扩增体系为:
[0063]
【权利要求】
1.一种具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶，是在金黄色葡萄球菌DNA聚合酶I (Sau)中插入有来源于T7噬菌体DNA聚合酶中的硫氧还蛋白结合结构域(TBD)而得到的杂合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所示的具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.权利要求1所述的具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶的制备方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)确定T7噬菌体DNA聚合酶TBD结构域在Sau蛋白中的对应位置，以及目标替换序列； (2)根据GenBank已经公布的Sau基因序列以及TBD序列信息设计并合成引物，并通过Overlap PCR技术扩增得到带有纯化标签、酶切位点的将TBD插入Sau基因序列正确位置的Sau-TBD片段； (3)将步骤(2)中得到的Sau-TBD克隆至表达载体pTrc99A中构建重组载体pTrc99A-Sau-TBD ； (4)表达载体pTrc99A-Sau-TBD转化大肠杆菌、诱导表达得蛋白。
4.权利要求1所述的具有持续合成能力和盐耐受度的新型DNA聚合酶在常温核酸扩增技术中的应用。
【文档编号】C12N9/12GK103881989SQ201410079508
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】程奇, 翟冰, 周国辉, 李贤祯, 刘国宪 申请人:中国农业科学院生物技术研究所