一种新型水稻d-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型水稻D-乳酸脱氢酶（OsD-LDH）及其编码基因与应用，属于植物生物工程领域。新型水稻D-乳酸脱氢酶是细胞色素C依赖的D-乳酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；该D-乳酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明的OsD-LDH基因在植物体内参与胁迫条件下产生的丙酮醛代谢，可用于提高植物耐受逆境胁迫和培育高抗逆性植物。本发明的OsD-LDH基因还可以作为筛选标记，以丙酮醛或D-乳酸作为筛选压力应用于转基因筛选中。本发明的D-乳酸脱氢酶可用来培育高抗逆性的植物及用于转基因筛选，对增加农业生产及改进转基因方法具有重要的意义。
【专利说明】一种新型水稻D-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物工程领域，具体涉及一种新型水稻D-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]水稻是世界上最重要的粮食作物之一。在农业生产中，水稻的生育期内经常会遇到各种生物或非生物胁迫等逆境条件。植物在这些逆境条件下会产生丙酮醛，丙酮醛是一种突变剂和基因毒性剂，浓度过高会抑制细胞生长(Ray S，Dutta S, Haider J, RayM(1994)Inhibition of electron flow through complex I of the mitochondrialrespiratory chain of Ehrlich ascites carcinoma cells by methylglyoxal.Biochem J.303:69 - 72)，植物中主要通过乙二醛酶系统来对丙酮醛进行脱毒，最终产生 D-乳酸(Yadav SKj Singla-Pareek SLj Sopory SK(2008)An overview on therole of methylglyoxal and glyoxalases in plants.Drug metabolism and druginteractions23:51-68)。乳酸对细胞也具有低毒性(Bar-Even A, Flamholz A, Noor Ej MiloR(2012)Rethinking glycolysis:on the biochemical logic of metabolic pathways.NatChem Biol8:509-517)，需要通过乳酸脱氢酶代谢除去或者通过单羧酸盐转运蛋白转移到细胞外(Enerson BE，Drewes LR(2003)Molecular features, regulation, and functionof monocarboxylate transporters:1mplications for drug delivery.Journal ofPharmaceutical Sciences92:1531_1544;Bonen A, Heynen M，Hatta H(2006)Distributionof monocarboxylate transporters MCTl_MCT8in rat tissues and human skeletalmuscle.Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism31:31-39)。
[0003]D-乳酸脱氢酶根据电子受体类型不同，分为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖和非 NAD+ 依赖的乳酸脱氢酶两大类(Engqvist Mj Drincovich MF，Fliigge U-1j MaurinoVG(2009)Two d-2-hydroxy-acid dehydrogenases in Arabidopsis thaliana withcatalytic capacities to participate in the last reactions of the methylglyoxalandβ -oxidation pathways.Journal of Biological Chemistry284:25026_25037)。水稻细胞色素C依赖的D-乳酸脱氢酶(OsD-LDH)属于后者的一种，是一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)氧化酶类，具有FAD结合结构域和氧化结构域。在水稻中，OsD-LDH在细胞色素C存在情况下负责催化D-乳酸转化为丙酮酸，丙酮酸可以进入三羧酸循环以被重新利用，从而减少D-乳酸的积累，降低对细胞的毒害作用。
[0004]近年来，全球气候条件恶化，自然灾害频发，盐碱地增多，水涝和干旱时有发生，病虫害在局部地区有加剧趋势；且随着工业化的进程，土地受到重金属如铜、镉等离子污染严重，这些情况都会对作物的生长产生严重影响，最终造成农作物减产，影响农民收入和国家粮食安全。在植物中过量表达D-乳酸脱氢酶可以帮助其消除在逆境胁迫条件下产生的D-乳酸，进而有助于顺利 降解丙酮醛，这对于减轻植物在上述逆境胁迫条件下所受的伤害并促进农作物增产具有重要意义。[0005]转基因作物近年遭受到非常大的争议，其中一个重要原因是人们对于外源基因转入粮食作物是否安全的担心，如果转入序列完全为植物内源序列，可消除此种担心，因此，建立以内源序列为筛选标记的转基因筛选方法就显得非常必要和迫切。拟南芥中D-乳酸脱氢酶转化拟南芥后在特定浓度的D-乳酸筛选条件下，可以显著区分转基因幼苗和非转基因幼苗(Wienstroer J, Engqvist MK, Kunz HH, Flugge UI, Maurino VG (2012) D-Lactatedehydrogenase as a marker gene allows positive selection of transgenic plants.FEBS Lett586:36-40)。因此，将水稻D-乳酸脱氢酶置于组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子等的驱动下，在特定浓度的丙酮醛或D-乳酸的筛选压力下，可区分转基因组织和非转基因组织，这具有非常好的应用潜力。
【发明内容】
[0006]本发明的首要目的在于提供一种新型水稻D-乳酸脱氢酶。
[0007]本发明的另一目的在于提供所述新型水稻D-乳酸脱氢酶的编码基因。
[0008]本发明的再一目的在于提供所述新型水稻D-乳酸脱氢酶或其编码基因的应用。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0010]一种新型水稻D-乳酸脱氢酶为细胞色素C依赖的D-乳酸脱氢酶，简称为OsD-LDH，来源于籼稻93-11，是如下I)或2)所述的蛋白质:
[0011]I)由SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，共由561个氨基酸组成；
[0012]2) SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列经过I个至不超过20个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与D-乳酸脱氢相关的衍生蛋白质。
[0013]所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶的编码基因如下1)、2)或3):
[0014]1)其核苷酸序列是SEQ ID N0.2所示的序列；
[0015]2)与上述1)中序列具有90%以上同源性且编码上述新型D-乳酸脱氢酶的核苷酸分子;
[0016]3)在严谨条件下可与上述I)中序列限定的DNA序列杂交且编码上述新型D-乳酸脱氢酶的核苷酸分子；
[0017]其中，上述严谨条件可为在6XSSC/0.5%SDS的溶液中，在68°C下杂交，然后用2XSSC/0.1%SDS 和 1XSSC/0.1%SDS 各洗膜一次。
[0018]上述OsD-LDH蛋白可人工合成，也可先获得其编码基因，再进行生物表达得到。上述OsD-LDH蛋白的编码基因可通过将SEQ ID N0.2所示的DNA序列中缺失或添加I个至20个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个至60个碱基对的错义突变，和/或在其5’端或3’添加如组氨酸标签(His)、原癌基因标签(myc)、旗帜标签(FLAG)、谷胱甘肽巯基转移酶标签(GST)等商用标签序列得到。
[0019]扩增OsD-LDH基因全长或部分片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0020]含有上述OsD-LDH基因的重组载体、重组菌和转基因细胞系等也属于本发明的保护范围。
[0021]可用现有植物表达载体如pCAMBIA系列、pBI121等载体及其他衍生植物表达载体构建含有OsD-LDH基因的植物重组表达载体。携带有OsD-LDH的植物表达载体可通过农杆菌介导、基因枪、显微注射和直接DNA转化等遗传转化方法转入植物细胞或组织中。[0022]使用OsD-LDH基因构建植物重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异性或诱导型启动子，它们可单独使用或与其他启动子结合使用；此外，还可使用增强子，包括转录增强子和翻译增强子，以及绝缘子调控序列。为了便于对转基因的细胞、组织或植株进行鉴定和筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的:可产生颜色变化的酶或荧光标记的基因如β葡萄糖苷酸媒(GUS)基因、荧光素酶基因或荧光蛋白基因等，可供筛选的抗生素标记如潮霉素、庆大霉素、卡那霉素基因标记或除草剂筛选标记基因或抗化学试剂标记基因如抗除莠剂基因等。
[0023]上述新型水稻D-乳酸脱氢酶或其编码基因有如下方面的应用:降解D-乳酸，在植物组织、细胞中促进丙酮醛代谢，提高植物逆境胁迫耐受性，转基因筛选等。
[0024]一种提高植物耐受逆境胁迫的方法，包含如下步骤:将上述新型水稻D-乳酸脱氢酶编码基因转入植物中获得转基因植物，然后将所述转基因植物种植于逆境条件下，其抗逆性获得提高。所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物，如棉花、小麦、水稻、玉米、大豆、油菜等；所述的逆境条件包括高盐、重金属离子、干旱、淹水、低温或高温等逆境条件。
[0025]一种转基因筛选标记，为上述新型水稻D-乳酸脱氢酶编码基因。
[0026]一种新型转基因筛选方法，是将上述新型水稻D-乳酸脱氢酶编码基因作为筛选标记，在转基因筛选阶段或得到转基因种子后幼苗萌发筛选阶段等，添加一定浓度的丙酮醛或D-乳酸作为筛选压力，区分转基因与非转基因组织或植株，获得转基因材料。
[0027]本发明通过生物信息学方法从水稻中克隆了一个细胞色素C依赖的D-乳酸脱氢酶(OsD-LDH)，通过原核表达纯化鉴定其酶学动力特征，并对其在水稻各组织中的表达模式进行了检测，转入OsD-LDH基因的水稻抗逆性提高，本发明的D-乳酸脱氢酶可用来培育高抗逆性的植物及用于转基因筛选，对增加农业生产及改进转基因方法具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】`
[0028]图1为反转录PCR扩增的OsD-LDH基因的电泳图。1:幼根，2:幼叶。
[0029]图2A为原核表达GST标签纯化的OsD-LDH蛋白电泳图；图2B为蛋白质印迹法鉴定的纯化蛋白。N1:未诱导菌；IN:诱导菌；S:菌体破碎后上清；P:菌体破碎后沉淀；FT:流穿液；E:洗脱蛋白；kDa:千道尔顿。
[0030]图3为纯化的OsD-LDH蛋白活性鉴定。D-Lac:D_乳酸；K3P04:50mM磷酸钾溶液；GST:对照谷胱甘肽巯基转移酶蛋白。
[0031]图4为纯化的OsD-LDH蛋白动力学参数检测。Km:米氏常数；Vmax:最大反应速度。
[0032]图5为荧光定量PCR检测籼稻93-11中OsD-LDH的表达。Cal:愈伤组织；GS:萌发7天种子；Sh:幼苗；Rt:萌发14天幼根；FL:成熟剑叶(源剑叶)；SL:未完全展开剑叶(库剑叶)；SinkFLS:库剑叶鞘；SourceFLS:源剑叶鞘；Nd:节；InterN:节间；Pan5/10/20:5/10/20cm长幼穗；SC1:抽穗后3天颖壳；An:花药；S0:柱头和子房；SC2:开花后15天颖壳；Imse:开花后 15 天种子；Carl/3/5/7/10/15/20:开花 1/3/5/7/10/15/20 天的穗。
[0033]图6为高浓度丙酮醛处理下转基因植株I周的生长状况。WT:野生型中花11 ;CK:空载体转基因对照；0ED-LDH:过表达OsD-LDH转基因株系；0ED-LDH_GFP:过表达OsD-LDH与绿色荧光蛋白GFP融合蛋白的转基因株系；MS:Murashige和Skoog植物生长培养基；MG:丙酮醛。【具体实施方式】
[0034]为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明的下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
[0035]实施例1、水稻OsD-LDH基因的克隆
[0036]取籼稻93-11幼叶和幼根,液氮研磨,按照Trizol法(Invitrogen)提取总RNA,用DNase I (Fermentas)消化混杂的DNA ;氯仿萃取去除DNase I后，以OligocKT) 18为引物，用Superscript II (Invitrogen)反转录得到cDNA。以上实验操作均按照试剂盒说明书进行。
[0037]以拟南芥D-乳酸脱氢酶(AtD-LDH)序列(Engqvist M, Drincovich MF, FliiggeU-1, Maurino VG(2009)Two d-2-hydroxy-acid dehydrogenases in Arabidopsisthaliana with catalytic capacities to participate in the last reactionsof the methylglyoxal andβ—oxidation pathways.Journal of BiologicalChemistry284:25026-25037) BLAST水稻基因组序列，获得对应的同源序列，设计引物以cDNA为模板，用高保真扩增酶Pfu进行RT-PCR扩增OsD-LDH，所用引物序列见下表:
[0038]
【权利要求】
1.一种新型水稻D-乳酸脱氢酶，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或为SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列经过I个至不超过20个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与D-乳酸脱氢相关的衍生蛋白质。
2.权利要求1所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶的编码基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，或为 A)与SEQID N0.2具有90%以上同源性且编码权利要求1所述D-乳酸脱氢酶的核苷酸分子，或为 B)在严谨条件下可与SEQID N0.2限定的DNA序列杂交的核苷酸分子。
3.一种引物，其特征在于:用于扩增权利要求2所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶的编码基因全长或部分片段。
4.一种重组载体、重组菌或转基因细胞系，其特征在于:含有权利要求2所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶的编码基因。
5.权利要求1所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶或权利要求2所述的编码基因在降解D-乳酸中的应用。
6.权利要求1所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶或权利要求2所述的编码基因在植物组织、细胞中促进丙酮醛代谢及逆境胁迫中的应用。
7.一种提高植物耐受逆境胁迫的方法，其特征在于包含如下步骤:将权利要求2所述的编码基因转入植物中，得到抗逆能力提高的转基因植物。
8.权利要 求1所述的新型水稻D-乳酸脱氢酶或权利要求2所述的编码基因在转基因筛选中的应用。
9.一种转基因筛选标记，其特征在于:为权利要求2所述的编码基因。
10.一种新型转基因筛选方法，其特征在于:以权利要求2所述的编码基因作为筛选标记，以丙酮醛或D-乳酸作为筛选压力，可区分转基因与非转基因组织或植株，获得相应转基因组织及植株。
【文档编号】C12N15/82GK103820409SQ201410085498
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】安保光, 李阳生, 邓小龙, 兰杰 申请人:武汉大学